李曉波 王淑菁 付 瑞 王莎莎 秦 驍 李 威 黃宗文 賀爭鳴 王 吉 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 102629)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)，廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)、畜牧等領(lǐng)域，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量會(huì)直接影響到科學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，關(guān)系著產(chǎn)品質(zhì)量和人民群眾的身體健康。生物制品質(zhì)量問題牽扯著人民大眾的神經(jīng)，是關(guān)系國計(jì)民生的大事，關(guān)乎國家的長治久安，而生物制品質(zhì)量評(píng)價(jià)需要大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因此必須重視實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量問題，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物的預(yù)防與控制就顯得尤為緊迫和重要。

小鼠諾如病毒(murine norovirus,MNV)是目前實(shí)驗(yàn)小鼠中感染率最高的病毒[1-2]，國際上一些知名的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)管和檢測機(jī)構(gòu)如歐洲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物聯(lián)合會(huì)(FELASA)[3]、Charles River實(shí)驗(yàn)室等已將其列為實(shí)驗(yàn)小鼠的常規(guī)檢測項(xiàng)目，盡管我國已出臺(tái)了MNV的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，但不具有強(qiáng)制性，而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)目前還未要求實(shí)驗(yàn)小鼠排除MNV，因此我國大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)和使用單位都未對(duì)其進(jìn)行控制，因此，造成很多實(shí)驗(yàn)使用的小鼠是MNV陽性鼠。

已有報(bào)道MNV對(duì)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞具有感染親嗜性，并能夠感染B細(xì)胞[4-5]，感染免疫細(xì)胞的特性表明MNV可能會(huì)對(duì)免疫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)造成影響。小鼠可通過發(fā)揮固有免疫及適應(yīng)性免疫功能抗MNV感染，根據(jù)李曉波[6]研究表明MNV感染會(huì)影響小鼠的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致T細(xì)胞、B細(xì)胞含量及細(xì)胞因子含量發(fā)生顯著改變。因此，MNV的感染極有可能會(huì)影響生物制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)，而目前這方面的研究尚處于空白。

乙肝疫苗為國家計(jì)劃內(nèi)疫苗(一類疫苗)，其質(zhì)量把控至關(guān)重要，乙肝疫苗的檢驗(yàn)依據(jù)《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版第三部進(jìn)行，其中規(guī)定用NIH或BALB/c小鼠來測定重組乙肝疫苗(CHO細(xì)胞)的效價(jià)，本研究參照《中國藥典》乙肝疫苗效價(jià)測定方法，選用BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究MNV的感染對(duì)乙肝疫苗效價(jià)測定的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1病毒株:小鼠諾如病毒BJ10-2062株(GenBank: KM458057)，本實(shí)驗(yàn)室分離并保存[7]，TCID50為10-5.330/0.1 mL。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)BALB/c小鼠，體質(zhì)量8～10 g，雌性，共120只，購自國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2017-0005，經(jīng)檢測符合SPF等級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)且MNV為陰性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于中國食品藥品檢定研究院屏障動(dòng)物設(shè)施進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2017-0013，實(shí)驗(yàn)所用鼠料、水、墊料等均經(jīng)滅菌處理，已通過中檢院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審查，中檢動(dòng)(福)第2018(B)020號(hào)，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑和儀器

重組乙型肝炎疫苗(CHO細(xì)胞，規(guī)格：20 μg/支，批號(hào)：201707YB06)為華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；乙型肝炎病毒表面抗體檢測試劑盒(規(guī)格：96人份，批號(hào)：201709181)購自上?？迫A生物工程股份有限公司。酶標(biāo)儀(Thermo，型號(hào)MK3)。

1.3 方法

1.3.1動(dòng)物分組：動(dòng)物隨機(jī)分為感染組和對(duì)照組，每組60只，感染組經(jīng)口灌胃0.2 mL MNV病毒液，對(duì)照組灌胃0.2 mL生理鹽水。

1.3.2乙肝疫苗的免疫：小鼠感染MNV后第7天免疫乙肝疫苗，感染組和對(duì)照組均分為乙肝疫苗高劑量組(1.25 μg/mL)、中劑量組(0.31 μg/mL)和低劑量組(0.078 μg/mL)，每組20只，每只腹腔注射乙肝疫苗1 mL。于免疫后第7、14、21、28及35天分別經(jīng)眼周靜脈采血，分離血清。

1.3.3乙肝表面抗體(HbsAb)的檢測：用乙型肝炎病毒表面抗體檢測試劑盒定性檢測HbsAb，按說明書操作進(jìn)行，每份樣本測兩次。

1.3.4結(jié)果的計(jì)算與分析：①計(jì)算半數(shù)動(dòng)物有效劑量(ED50)：分別計(jì)算感染組和對(duì)照組各免疫時(shí)間點(diǎn)的ED50值，具體為統(tǒng)計(jì)各劑量組乙肝疫苗免疫后HbsAb陰陽性動(dòng)物數(shù)量，計(jì)算距離比例=高于50%陽轉(zhuǎn)率-50/高于50%陽轉(zhuǎn)率- 低于50%陽轉(zhuǎn)率，計(jì)算50%陽轉(zhuǎn)終點(diǎn)對(duì)數(shù)=高于50%陽轉(zhuǎn)率稀釋對(duì)數(shù)+距離比例×稀釋對(duì)數(shù)的因數(shù)，計(jì)算稀釋度=1050%陽轉(zhuǎn)終點(diǎn)對(duì)數(shù)，計(jì)算ED50=原濃度(20 μg/ml)/稀釋度；②統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，t檢驗(yàn)比較對(duì)照組與感染組總體ED50均值；卡方檢驗(yàn)比較對(duì)照組與感染組總體HbsAb結(jié)果及各時(shí)間點(diǎn)、各劑量組的HbsAb結(jié)果，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ED50比較

由于免疫第7天HbsAb陽轉(zhuǎn)率較低，無法計(jì)算其ED50。比較對(duì)照組和感染組各時(shí)間點(diǎn)ED50的總體均值，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；對(duì)比兩組各時(shí)間點(diǎn)的ED50值可見，除了免疫后第21天兩組的值接近，其余3個(gè)時(shí)間點(diǎn)感染組的ED50值均高于對(duì)照組(表1)。

表1 對(duì)照組及感染組ED50值比較(μg/mL)

2.2 HbsAb陽性率比較

2.2.1總體陽性率比較:對(duì)照組與感染組各免疫時(shí)間點(diǎn)HbsAb總體陰陽性結(jié)果見表2，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩組HbsAb陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表2 對(duì)照組及感染組總體HbsAb結(jié)果比較

2.2.2各時(shí)間點(diǎn)兩組HbsAb陽性率比較：分別比較免疫后各時(shí)間點(diǎn)兩組之間HbsAb陽性率，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，免疫乙肝疫苗后第7、14、21、28、35天感染組和對(duì)照組HbsAb陽性率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表3)。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組及感染組HbsAb結(jié)果比較

2.2.3不同劑量組兩組小鼠HbsAb陽性率比較:由于低劑量組HbsAb結(jié)果均為陰性，未對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，乙肝疫苗免疫后第28天及第35天，對(duì)照組小鼠免疫高劑量乙肝疫苗產(chǎn)生HbsAb的動(dòng)物數(shù)量顯著高于感染組(MNV陽性組)(P<0.05)；疫苗免疫后第14天，對(duì)照組小鼠免疫中劑量乙肝疫苗產(chǎn)生HbsAb的動(dòng)物數(shù)量相比感染組(MNV陽性組)有顯著提高(P<0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表4)。

表4 各免疫劑量組內(nèi)對(duì)照組及感染組HbsAb比較

3 討論

《中國藥典》2015年版第三部規(guī)定乙肝疫苗接種4～6周后采血，測定乙肝表面抗體，本實(shí)驗(yàn)選擇在乙肝疫苗接種后第1～5周共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血，對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的免疫效果分別進(jìn)行比較，以更全面的評(píng)估MNV感染對(duì)乙肝疫苗效價(jià)測定的影響。實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的3R原則，使用盡量少的動(dòng)物得到所需要的數(shù)據(jù)，每個(gè)劑量免疫20只，對(duì)小鼠進(jìn)行少量多次采血，每次采血控制在小鼠循環(huán)血量的10%以內(nèi)，大約100～200 μL，對(duì)動(dòng)物的損傷較輕，并且保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)結(jié)果進(jìn)行“定量”和“定性”的比較，“定量”指比較ED50，“定性”比較HbsAb的陰陽性結(jié)果。

從已有研究來看，目前還未有MNV的不同感染劑量會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的報(bào)道。參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[8-9]，本研究采用經(jīng)口灌胃的方式和單一的攻毒劑量感染小鼠，但病毒的感染劑量仍是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可忽視的因素，針對(duì)MNV的不同感染劑量對(duì)乙肝疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果影響的問題，還需后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。按照《中國藥典》2015年版第三部中規(guī)定的乙肝疫苗效價(jià)測定方法，需將乙肝疫苗濃度設(shè)為高、中、低3個(gè)劑量組來免疫小鼠，再根據(jù)每個(gè)劑量組的免疫結(jié)果來計(jì)算疫苗的半數(shù)動(dòng)物有效劑量(ED50)。本研究在實(shí)驗(yàn)的每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)均通過采集糞便的方式對(duì)小鼠的MNV進(jìn)行監(jiān)測，結(jié)果顯示整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期感染組小鼠MNV均為陽性，對(duì)照組均為陰性，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

MNV感染對(duì)生物制品檢定的影響，目前國內(nèi)外均無相關(guān)的報(bào)道。盡管比較對(duì)照組和感染組所有時(shí)間點(diǎn)ED50的總體均值、兩組HbsAb的總體陽性率及每個(gè)時(shí)間點(diǎn)HbsAb的陽性率，均未發(fā)現(xiàn)存在顯著差異，但進(jìn)一步比較各劑量組的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在免疫第14天，中劑量乙肝疫苗免疫對(duì)照組小鼠產(chǎn)生HbsAb的動(dòng)物數(shù)量顯著高于感染組；免疫第28天及第35天，高劑量疫苗免疫對(duì)照組小鼠產(chǎn)生HbsAb的動(dòng)物數(shù)量均顯著高于感染組。各時(shí)間點(diǎn)的ED50值相比，除了免疫第21天，其余時(shí)間點(diǎn)的ED50值對(duì)照組均低于感染組。藥典規(guī)定的采血時(shí)間點(diǎn)是免疫后第28天～第42天，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這段時(shí)間兩組的結(jié)果會(huì)出現(xiàn)差異。以上結(jié)果表明使用MNV感染的小鼠來評(píng)價(jià)乙肝疫苗會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差，所測的乙肝疫苗效價(jià)有可能低于MNV陰性小鼠。

MNV對(duì)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞具有感染親嗜性[4-5]，而巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在動(dòng)物機(jī)體的免疫應(yīng)答過程發(fā)揮著十分重要的作用，樹突狀細(xì)胞負(fù)責(zé)抗原遞呈和加工，可促進(jìn)T細(xì)胞活化，還可誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生B細(xì)胞刺激因子，促使B細(xì)胞分泌免疫球蛋白(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)，從而參與B細(xì)胞的生長、分化與抗體產(chǎn)生[10-11]。推測MNV感染導(dǎo)致乙肝疫苗效價(jià)測定值偏低主要有以下兩點(diǎn)原因：一是病理方面因素：乙肝疫苗效價(jià)測定使用的是BALB/c小鼠，病理研究發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠脾發(fā)生的病理變化主要表現(xiàn)為脾小結(jié)數(shù)量的減少[12]，脾小結(jié)位于脾白髓中央動(dòng)脈周圍淋巴鞘的旁側(cè)，為B細(xì)胞區(qū)，脾小結(jié)數(shù)量減少意味著淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少，動(dòng)物免疫力的降低；另一個(gè)原因是MNV感染造成的小鼠免疫功能的改變，輔助性T細(xì)胞分為Th1和Th2細(xì)胞，兩種細(xì)胞之間通過分泌細(xì)胞因子，彼此交叉調(diào)節(jié)又互相抑制。我們先前報(bào)道的免疫指標(biāo)變化研究中，MNV感染導(dǎo)致BALB/c小鼠γ干擾素(IFN-γ)含量顯著升高[6]，而IFN-γ作為Th1的效應(yīng)分子，具有輔助細(xì)胞免疫的作用，同時(shí)其高表達(dá)對(duì)Th2細(xì)胞的增殖分化又產(chǎn)生了抑制，而Th2細(xì)胞起輔助體液免疫的作用，因此間接影響到了小鼠的體液免疫應(yīng)答。根據(jù)以上兩點(diǎn)原因推測MNV感染影響了小鼠的體液免疫應(yīng)答，進(jìn)而影響到乙肝疫苗效價(jià)測定的結(jié)果。

本研究在MNV感染第7天進(jìn)行免疫，屬于感染的急性期，慢性期免疫(感染30 d后)是否同樣會(huì)對(duì)乙肝疫苗效價(jià)的測定產(chǎn)生影響？先進(jìn)行乙肝疫苗的免疫再感染MNV，以及免疫后的不同時(shí)間感染會(huì)產(chǎn)生什么影響？要進(jìn)一步深入了解MNV感染對(duì)乙肝疫苗的影響，這些問題都有待后續(xù)進(jìn)行深入研究。

致謝：感謝中檢院肝炎室邱少輝等同事提供的幫助！