李 磊 孟紅旭 陳 雨 付建華 袁清習 史 躍 馬彥雷 劉建勛

(1.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所/中藥藥理北京市重點實驗室，北京 100091)(2.中國科學院高能物理研究所，北京 100049)

冠狀動脈微循環(huán)障礙(coronary microvascular dysfunction，CMD)通常是指發(fā)生于直徑小于300 μm心臟血管的結構和功能改變，是心臟X綜合征、經皮冠狀動脈介入治療(PCI)后無復流等微循環(huán)病變的共同發(fā)病機制[1]。和心外膜冠脈狹窄一樣，CMD導致心肌耗氧的供需失衡，引起臨床癥狀并影響心血管疾病的診療和預后。隨著現代影像學的迅速發(fā)展，CMD的發(fā)生和防治得到越來越多的關注[2]。

X射線技術是廣泛應用于生物醫(yī)學領域的一種重要檢測分析手段，傳統X射線成像技術是基于不同材料或組織對X射線吸收不同而獲得成像的襯度，然而生物組織樣品產生的吸收襯度有限，直徑200 μm以下的微血管不能通過傳統的冠脈造影檢查評估[3]。傳統的血管可視化研究手段如組織病理學切片、血管熒光染色等，對微血管空間結構的展示尚停留在二維平面層次，無法精確再現血管網絡的空間分布[4]。目前，在CMD的診斷和療效評價方面缺乏對微小動脈的可視化技術，尤其缺乏適合小動物冠脈微血管的可視化研究方法。

衍射增強成像(diffraction enhanced imaging，DEI)也稱為基于晶體的相位襯度成像，是利用硅晶體極高的角度選擇特性探測樣品引起的X 射線角度變化來獲得樣品襯度圖像[5]。近年來，X射線衍射增強成像方法逐漸應用到生物醫(yī)藥領域[6-7]。與傳統的X射線吸收成像技術相比，由于軟組織對X射線的相位襯度比吸收襯度大100～1 000倍，因此DEI在生物軟組織方面具有顯著優(yōu)勢，為微血管的觀測和評估提供了有效手段。血管鑄型作為形態(tài)學研究的一項經典技術，是管道鑄型的重要種類之一，可以通過重建血管樹分析和評價血管三維形態(tài)，為研究某器官或組織的血管分布做出了重要貢獻[8-9]。近年來，Chen等[10]將該技術應用于心衰大鼠心臟微血管病變研究，然而在CMD方面該技術應用鮮有報道。

雙參寧心膠囊是本院研發(fā)的治療氣虛血瘀證冠心病的組分中藥，由人參、丹參和延胡索三藥味有效部位按比例組成，具有益氣活血、化瘀止痛之功效，用于冠心病、CMD及心絞痛氣虛血瘀證。前期研究顯示，雙參寧心膠囊能明顯改善心肌缺血(再灌注)損傷，增加缺血心臟的冠脈血流量，改善冠脈微循環(huán)；對血清乳酸脫氫酶(LDH)的增高、肌酸激酶(CK)活性升高及血漿內皮素(ET)的活性有明顯抑制作用；通過保存缺血心肌三磷酸腺苷(ATP)，對心肌細胞凋亡、自噬、線粒體自噬等均具有調控作用[11-13]。本研究主要采用血管鑄型及X射線衍射增強成像技術探索CMD時冠脈微血管三維變化及雙參寧心膠囊的作用，為下一步開展機制研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:SPF級健康雄性SD大鼠18只，體質量 300～320 g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0002。動物實驗操作及飼養(yǎng)均在中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院實驗動物中心進行，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2015-0011。實驗動物及實驗步驟符合國家實驗動物管理條例。該研究經中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院動管理委員會批準實驗，實驗動物處置均符合國家科委《實驗動物管理條例》，并遵循：“3R”原則給予實驗動物人道的關懷，審批號： 2020XLC007-2。

1.1.2藥物與試劑:雙參寧心膠囊(中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所藥學室)，氫氧化鉀和戊巴比妥鈉(Sigma)；自凝牙托粉和自凝牙托粉水(安陽市鷹牌齒科有限公司)；鄰苯二甲酸二丁酯(無錫市亞泰聯合化工有限公司)；大紅色油畫顏料(廣州市美幫祈福文儀有限公司)；40～120 μm栓塞微球(Merit Medical)。

1.1.3主要儀器:DW-3000S型雙通道小動物呼吸機(安徽正華生物儀器設備有限公司)；α77 Ⅱ數碼單電相機(SONY)。4W1A成像實驗站(北京同步輻射裝置)。

1.2 方法

1.2.1實驗分組與給藥:動物適應3 d后，隨機分為三組，每組6只。具體分組如下：①假手術組(Sham)：不注射栓塞微球，給予等體積生理鹽水；②模型組(Model)：注射栓塞微球，給予等體積生理鹽水；③雙參寧心膠囊組(SSNX)：給予雙參寧心膠囊，劑量為1 mL/100 g。各組動物3只用于血管鑄型研究，另外3只用于X線衍射(X-ray diffraction,XRD)成像研究。雙參寧心膠囊組動物，連續(xù)給予雙參寧心膠囊7 d，劑量為1 mL/100 g灌胃給藥，假手術組和模型組給予等體積生理鹽水，末次給藥后2 h進行模型制備，造模后24 h處死取材。

1.2.2CMD模型建立:參考Sun等[14]造模方法，大鼠按體質量給予戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，胸部常規(guī)備皮，取仰臥位固定于手術板上，把頭頸部拉直固定，行氣管插管術，將氣管插管與小動物呼吸機連接。大鼠于左前外側沿胸骨左側緣縱向切開皮膚，鈍性分離肌層，開胸暴露第4肋中部并縱向剪斷，以垂直肋骨方向放置大鼠開胸器，剪開心包膜暴露心臟，分離主動脈弓，并在其下穿一棉線，令大鼠穩(wěn)定10 min后，將棉線兩端提起并用血管夾夾閉主動脈，迅速以注射器從心尖部直接向左心室注射0.2 mL栓塞微球(微球直徑42～120 μm，約含1 000個微球)，注射前回抽血以確保針尖在心腔中，夾閉20 s后，松開血管夾，待呼吸心跳穩(wěn)定后，徹底止血、逐層縫合肌肉和皮膚。拔除氣管插管，普通飼養(yǎng)。假手術組手術過程采用同樣的操作，區(qū)別僅在于大鼠注射的為 0.2 mL生理鹽水。

1.2.3動物冠脈血管鑄型及圖像采集:根據李忠華等[15]方法及預實驗，確定血管鑄型劑配方如下：自凝牙托粉25 g、自凝牙托水25 mL、鄰苯二甲酸二丁酯12 mL及大紅油畫顏料2 mL。使用時先將自凝牙托水、鄰苯二酸二丁酯及油畫顏料混勻攪拌充分，注意用玻璃棒順時針攪拌使其充分混勻，攪拌過程中避免氣泡產生，最后加入自凝牙托水，再次攪拌均勻后立即用20 mL的塑料注射器灌注，不間斷、緩慢加壓注入，15 min內鑄型劑有較好的流動性。

大鼠麻醉后，經腹主動脈插管注入1%肝素生理鹽水處死動物。剪開動物下腔靜脈放血，直至從靜脈端流出清亮的液體為止，再灌入鑄型劑，直至鑄型劑從下腔靜脈流出表示灌注成功。結扎腹主動脈和下腔靜脈，靜置標本于室溫下4 h。待鑄型劑完全聚合后，取心臟放置于含有2%吐溫80的4 mol/L氫氧化鉀堿溶液中腐蝕組織，3 mL/g心肌組織。室溫消化24 h，其間適當搖晃以便腐蝕掉的組織脫落，沖洗干凈后移入純水中保存。血管鑄型圖像采集使用索尼α77 Ⅱ數碼單電相機，配合索尼SAL 50 mm f/2.8 Macro 鏡頭拍攝。使用Image Pro Plus 6.0軟件完成定標，并標注相關血管直徑。拍照后將冠脈鑄型從純水中取出，修剪去除主動脈弓處等多余部分，室內放置待鑄型表面無水分后稱質量[16]。

1.2.4X射線衍射增強用樣本制備:動物麻醉后分離下腔靜脈，并插入留置針。頸總動脈插管，連接三通，50 mL生理鹽水從下腔靜脈緩慢注入，同時放開頸總動脈插管放血，待頸總動脈血流顏色變?yōu)橥该鲿r，更換為4%多聚甲醛從下腔靜脈插管處緩慢注入，直至大鼠四肢僵硬時停止灌注。假手術組和模型組各取1只動物，在橫切面乳頭肌水平取3～4 mm心臟切片，其他動物切除左右心房后，保留完整心室組織固定。將心臟組織放入4%多聚甲醛固定液中保存[17]。

1.2.5XRD增強圖像采集與分析:衍射成像研究在北京同步輻射裝置(Beijing synchrotron radiation facility， BSRF)4W1A成像實驗站開展。EDI方法的光路示意見圖1A，單色器(晶體)主要作用是從白光X射線中通過調整入射角度獲得特定波長的單色X射線，單色X射線通過樣品內部密度不同或結構不同區(qū)域時會發(fā)生不同大小的折射角折射，放置在樣品之后的分析晶體通過調節(jié)接受角度，選擇某一折射角度出射的X射線，放大這種密度不同或結構不同造成的光強度變化，最終在檢測器上得到襯度增強圖像。高靈敏度衍射成像系統主要包括同步輻射光源、單色器、旋轉樣品臺、分析晶體和探測器組成，見圖1B。4W1A 成像實驗站建在Wiggler白光束線上，光束線出口距發(fā)光點43 m，光源尺寸水平方向為2.2 mm，垂直方向為0.8 mm，X射線能量范圍為3～22 KeV，物像距為0.3 m。為獲得更好的成像效果，于拍攝前1 h將心臟樣品從多聚甲醛中去除，用濾紙拭去表面并置于空氣中風干。

圖1 XRD光束線及實驗裝置(北京同步輻射)

實驗參數設置: 選擇Si(400)晶體進行分析。單色光能量為20 keV，電子束流強度Ie為60～100 mA，曝光時間在峰位為70 ms左右，半高位均為280 ms，探測器使用X射線CCD成像系統探測器：Hamamatsu C12849-101U；探測器像素尺寸：6.5×6.5 μm。放置樣品后獲取搖擺曲線，然后分別在搖擺曲線的峰位和反射率為50%左右的半高寬位進行成像。CT 掃描參數設置: 光子能量15 keV，曝光時間12 ms，轉臺轉速0.32°/s，CT數據采集的投影范圍為180°，角度間隔0.5°。圖像采集及三維重建結束后，利用濾波反投影算法進行二維斷層重建，并將二維切片圖像利用Avizo9.0軟件進行三維可視化處理。采用Zanatta等[18]“無血管評分法”對冠脈微血管病變程度進行半定量評分，具體評分如下：0分，未見明顯微血管異常；1分，冠脈微血管異?；驕p少率≤33%；2分，冠脈微血管異?；驕p少率33%～66%；冠脈微血管異常或減少率>66%。

2 結果

2.1 大鼠冠脈血管鑄型結果

本研究所使用的鑄型劑可以在室溫下2 d內方便快捷的制作出大鼠冠脈血管主干和微血管標本。鑄型標本冠脈血管管道較完整、飽滿，血管樹的空間分布清晰。該鑄型劑配方可以一次性灌注完成，顯示血管最小直徑可達40 μm(見圖2)，更小的血管在該鑄型條件下顯示比較困難，更細的血管在心肌消化時多數隨心肌脫落。

圖2 大鼠冠脈血管鑄型

2.2 CMD大鼠血管鑄型改變及雙參寧心膠囊干預作用

經心室內注射栓塞微球建立的CMD大鼠冠脈鑄型標本可見冠脈血管稀疏，微血管密度明顯較假手術動物減少，冠脈血管鑄型質量較假手術組明顯降低(P<0.01)。雙參寧心膠囊預防后給藥7 d可以明顯改善冠脈血管分布異常，增加微血管密度(見圖3)。

圖3 各組動物冠脈血管鑄型比較

2.3 高精度衍射成像圖采集結果

XRD成像中，為獲得樣品的吸收、折射、散射等信息，需要樣品在搖擺曲線不同位置獲得不同襯度的圖像，在搖擺曲線峰值位置時采集的圖像成為DEI峰位圖。所有樣本均獲得良好的衍射增強圖像峰位圖，圖像襯度較好，立體感較強，呈浮雕樣。圖像的空間分辨率及襯度分辨率明顯要高于常規(guī)X線檢測。心臟橫向切片后，采集的DEI峰位投影圖中觀察不到明顯的血管結構(見圖4)。心室縱向放置采集的圖像可以觀察到類似血管走形的投影，然而各組間未觀察到明顯差異(見圖5)。上述結果提示直接獲得的DEI峰位圖不能直接用于觀察冠脈微血管分布情況。

圖4 大鼠心室橫切面DEI峰位投影

圖5 大鼠心室縱向DEI峰位投影

2.4 CT圖像及血管三維重建

利用Avizo 9.0軟件，對DEI圖進行三維重建，選取適當灰度值，可以觀察到冠脈微血管走形及空間形態(tài)結構。心室橫切面取材直接CT三維重建，顯示冠脈微血管直徑最小15～25 μm，但只能觀察到心室壁內部一部分血管走形，對深部穿支血管的形態(tài)空間分布顯示模糊，同時受到心肌腱索圖像干擾較多(見圖6)。由于受到圖像干擾，該觀察條件下，假手術組和模型組大鼠冠脈微血管并未見明顯差異。

圖6 大鼠心室DEI成像CT三維重建

整個心室通過旋轉CT掃描拍攝得到361張DEI峰位圖，經過濾波反投影法轉換可以得到約1 000幀橫斷面圖(見圖7A)。對整個心室所有斷層進行重建，圖像干擾增多，很難發(fā)現有意義的血管改變(見圖7B)。經過反復對比，發(fā)現心臟冠脈回旋支分布節(jié)段，200層(第800～1 000層)斷層片重建獲得的圖像比較有利于觀察冠脈微血管(見圖7C)。通過選擇適當的灰度，可以將冠脈微血管較好顯示，血管走形遵循從大到小的一般規(guī)律，分布情況與解剖學冠脈血管走形分布大體一致，可以見到最小直徑為10 μm的冠脈微血管(接近毛細血管直徑)。相同觀察條件對CMD大鼠冠脈微血管進行觀察，假手術組動物冠脈微血管分布主干粗大且分支完整清晰明顯(見圖7D)，而冠脈微栓塞動物的冠脈微血管主干變細，分支數明顯減少，冠脈微血管評分降低(P<0.01)(見圖7E)。給予劑量為雙參寧心膠囊90 mg/kg干預的大鼠冠脈微血管較模型組動物明顯血管密度增加，增加冠脈微血管評分(P<0.05)，見圖7F及表1。

表1 大鼠冠脈微血管鑄型質量及XRD成像血管評分

圖7 冠脈微血管三維重建

3 討論

傳統的X線冠脈造影技術不能評價冠脈微血管，病理組織學切片技術雖然可以觀察到微血管的改變但不能反映血管樹的三維立體分布。冠脈微血管鑄型技術具有構建性強、美觀且色澤鮮艷，能真實的反映出標本的血管網形態(tài)、分布及側支的吻合情況。自2012年，使用自凝牙托材料進行心血管鑄型研究已經廣泛應用在解剖教學和大動物實驗研究中，其制作的標本具有支撐力強、收縮率小、柔韌性好、鑄型飽滿、價格低廉、化學性能和物理機械性能都比較穩(wěn)定的特點[17]。本研究結果顯示，使用自凝牙托材料可以快捷的制作大鼠冠脈血管鑄型標本，鑄型標本可以反映出CMD大鼠血管異常，雙參寧心膠囊可以明顯改善CMD大鼠血管鑄型所示的冠脈微血管密度降低。

隨著DEI技術的逐步完善，在生物學、醫(yī)學、材料學等領域表現出廣泛的應用前景。XRD成像的中搖擺曲線指出射光強隨分析晶體角度搖擺而變化的曲線，分析晶體具有極高的角度選擇性，只有那些嚴格滿足布拉格衍射條件的部分X射線才能通過分析晶體到達探測器進行成像。將分析晶體調節(jié)到搖擺曲線不同位置，通過轉換樣品和成像裝置之間不同方位，可以獲得衍射增強影像[18]。本研究使用北京同步輻射裝置開展大鼠冠脈微循環(huán)血管三維重建探索。由于心臟相對較厚，前期研究報道在該裝置上觀察小鼠活體成像十分模糊，較肝臟和腎臟影像清晰度差，除了顯示心臟大血管結構外，其余結構顯示欠佳[19]。因此本研究采用大鼠離體心臟固定后采集圖像進行分析重建。高分辨率和高質量的原始圖像是進行精確血管三維重建的重要基礎，樣品的處理需經過嚴格統一的灌注、固定、脫水等操作。本研究分別采用橫斷切片和整個心臟兩種方式進行了圖像采集的探索，結果顯示心臟橫切片雖然可以得到橫切面的高清晰和高分辨率DEI峰位投影圖，同時經過CT重建后可以觀察到部分冠脈微血管，然而在空間分辨程度上不夠清晰。對心臟整體進行DEI峰位投影圖采集可以獲得立體、浮雕感的圖像，可以直接觀察到細微冠脈微血管走形，但并不能區(qū)分出假手術大鼠與模型大鼠的區(qū)別。若將所有獲得的近1 000幀圖像進行CT重建，得到的圖像由于偽影和圖像重疊不能清楚觀察到冠脈微血管。因此，本研究通過減少重建的幀數，并調整灰度值，在冠脈乳頭肌水平選擇200幀進行重建，可以獲得冠脈回旋支較為清晰的影像，而且冠脈微球栓塞導致的CMD大鼠冠脈微血管分布出現異常，冠脈主干變細，同時冠脈微血管明顯減少，給予雙參寧心膠囊預防性給藥7 d后，冠脈微循環(huán)明顯改善，冠脈分支較模型組明顯增多。

綜上所述，血管鑄型和XRD增強成像均能在一定程度上構建出血管網的三維可視化模型。XRD增強成像技術在顯示冠脈微血管細節(jié)方面具有極大優(yōu)勢，最細可以顯示到直徑為10 μm級別血管。血管鑄型和XRD增強成像均在一定程度上反映大鼠CMD時冠脈微血管空間分布改變，雙參寧心膠囊干預對動物模型的冠脈微血管亦可以見到明顯改善。XRD增強成像方法的樣本制作簡便，獲得圖像可后期轉化分析，對CMD的實驗研究具有一定參考價值。