趙娜 邱國(guó)萍 王滿庭

(九江市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科,江西 九江 332000)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥，是腎衰竭的主要原因之一[1]。其發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重?fù)p害人類健康[1-2]。DN可逐漸發(fā)展為腎小球硬化，間質(zhì)纖維化以及功能喪失[3]。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是內(nèi)源的非編碼小RNA分子，長(zhǎng)約20～24個(gè)核苷酸[4]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs通過(guò)基因調(diào)控在DN的發(fā)生和發(fā)展中有著重要的作用，表明miRNAs可能與DN的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[5]。磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)早期被認(rèn)為是抑癌基因。但是，隨著研究的進(jìn)一步深入，PTEN同時(shí)也被認(rèn)為是AKT的負(fù)性調(diào)節(jié)器[6]。研究表明磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號(hào)通路的激活與腎臟纖維化的發(fā)展密切相關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)喂食高糖高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)建立DN大鼠模型，觀察miR-214在DN大鼠腎組織中的表達(dá)變化，并進(jìn)一步探討抑制 miR-214對(duì)DN大鼠腎組織的治療作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只SD雄性大鼠，SPF級(jí)，7周齡，體重(200±20)g，購(gòu)自九江學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中，正常飲食飲水，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均符合動(dòng)物倫理要求，并通過(guò)我院倫理委員會(huì)嚴(yán)格審查批準(zhǔn)。大鼠適應(yīng)環(huán)境兩周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 細(xì)胞 人胚腎(HEK-293T)細(xì)胞株細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.3 試劑 STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-214 mimics由Genepharma公司合成。尿蛋白(UP)定量試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)測(cè)定試劑盒購(gòu)自瑞士羅氏公司。TRIzol試劑、PrimeScriptTMRT Reagen試劑盒和SYBR Premix EX TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。HE試劑盒、DAB顯色盒和Masson試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。大鼠血清丙二醛(MDA)試劑盒、大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、大鼠血清谷胱甘肽(GSH)試劑盒和大鼠血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液和BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。PTEN抗體、p-PI3K抗體、PI3K抗體、p-AKT抗體、AKT抗體、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)抗體、mTOR抗體、β-actin抗體和IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 建立DN大鼠模型 SD大鼠喂食高糖高脂飲食，持續(xù)8周。之后SD大鼠經(jīng)腹腔注射STZ(30 mg/kg)，并繼續(xù)喂食高糖高脂飲食。72 h后，從尾靜脈收集血液并測(cè)定空腹血糖(FPG)。如果FPG≥16.7 mmol/L，則認(rèn)為糖尿病模型建立成功。大鼠繼續(xù)喂食高糖高脂飲食，定期測(cè)量血糖。4周后，如果UP>20 mg且尿液葡萄糖呈陽(yáng)性，則認(rèn)為DN模型建立成功[8]。

1.2.2 分組及給藥 將SD大鼠分為4組：對(duì)照組(control組)、糖尿病腎病模型組(DN組)、miR-214陰性對(duì)照組(DN+miR-NC組)和miR-214模擬物組(DN+miR-214 mimics組)，每組10只。DN組、DN+miR-NC組和DN+miR-214 mimics組大鼠按1.2.1進(jìn)行DN模型制作(糖尿病腎病造模過(guò)程中，DN組一只小鼠狀態(tài)不佳導(dǎo)致死亡，DN組造模后剩余9只小鼠)，其余control組大鼠喂養(yǎng)正常的飼料，并經(jīng)腹腔注射生理鹽水。造模成功后，DN+miR-NC組大鼠經(jīng)尾靜脈注射miR-NC(30 mg/kg)，DN+miR-214 mimics組大鼠經(jīng)尾靜脈注射miR-214 mimics(30 mg/kg)，control組和DN組大鼠經(jīng)尾靜脈注射等量的生理鹽水，每7 d注射一次，連續(xù)8周[8]。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè) 用TRIzol試劑提取腎組織中的總RNA。使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和含量，并將每個(gè)配對(duì)的樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。使用PrimeScriptTMRT Reagen試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-214的正向引物序列為5′-CACCTTTCTCCCTTTCCCCTTACTCTCC-3′，反向引物序列為5′-TTTCATAGGCACCACTCACTT TAC-3′；U6的正向引物序列為5′-CTCGCTTCGG CAGCACA-3′，反向引物序列為5′-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3′。按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。使用FTC-3000p實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)完成實(shí)驗(yàn)后，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 大鼠FPG測(cè)定 末次給藥結(jié)束后，SD大鼠禁食一晚(12 h)，第二天早晨取大鼠尾靜脈血，使用血糖儀測(cè)定大鼠FPG。

1.2.5 大鼠UP水平測(cè)定 末次給藥結(jié)束后，收集大鼠24 h尿液，采用雙縮脲法測(cè)定大鼠24 h尿蛋白濃度。計(jì)算公式：24 h尿蛋白量=尿蛋白濃度×24 h尿量。

1.2.6 大鼠Scr和血清BUN水平測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，于心尖取血，并置于1.5 mL EP管中，3000 r/min 離心15 min，吸取上層血清，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠Scr和血清BUN水平。

1.2.7 HE染色 切取新鮮腎組織，經(jīng)固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，并制成4 μm的石蠟切片。按HE染色步驟經(jīng)脫蠟、脫水、染色、沖洗、中性樹膠封片，光鏡下觀察腎組織的病理變化。

1.2.8 Masson染色 切取新鮮腎組織，進(jìn)行OCT包埋，制作成6 μm的冰凍切片。切片上滴加50 μL Bouin’s 2000TM溶液，于60℃烤箱中烤片1～1.5 h，用純凈水沖洗切片至組織無(wú)色。之后將切片置于蘇木素中染色5 min，純凈水清洗。再滴加猩紅-酸品紅染色液，染色10 min，純凈水清洗；滴加一滴磷鉬酸染液染色12 min，用濾紙吸去多余染液；滴加一滴苯胺藍(lán)染色8 min后，純凈水清洗切片2 min；滴加一滴1%的醋酸孵育4 min。沖洗，用中性樹膠封片，顯微鏡觀察并拍照。藍(lán)色組織表示腎組織纖維化，紅色組織表示腎組織正常。

1.2.9 ELISA檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，于心尖取血，并置于1.5 mL EP管中，3000 r/min 離心15 min，吸取上層血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用酶聯(lián)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)定各孔的光密度(OD值)，根據(jù)OD值所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出血清中MDA、SOD、GSH和GSH-PX的表達(dá)。

1.2.10 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 腎組織經(jīng)固定，包埋，石蠟切片、脫水、緩沖液清洗，3%過(guò)氧化氫溶液去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加非免疫動(dòng)物血清20 min，滴加一抗、PBS沖洗、滴加二抗、沖洗后加ABC復(fù)合物、DAB顯色，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，用MIAS圖像分析系統(tǒng)分析，按照免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在每一高倍視野中所占比例依次統(tǒng)計(jì)。目標(biāo)蛋白呈棕黃色，則為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.11 雙熒光素酶報(bào)告基因 細(xì)胞培養(yǎng)：HEK-293T細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。雙熒光素酶檢測(cè)：通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-214的靶基因。將PTEN 3'UTR wt/mut克隆到pmirGLO載體中，然后將NC、miR-214 mimics、pmirGLO-PTEN-wt或pmirGLO-PTEN-mut轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中。48 h后，應(yīng)用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定HEK-293T細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.2.12 Western blot檢測(cè) 各組大鼠腎組織(100 mg)用RIPA裂解提取總蛋白，并經(jīng)過(guò)BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。將上清液與2×樣品緩沖液混合，在95℃下煮沸5 min，在12% SDS-PAGE上電泳，然后電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在室溫下用脫脂牛奶封閉1 h，然后與單克隆抗體β-actin(1∶500)，PTEN(1∶500)，p-PI3K(1∶500)，PI3K(1∶500)，p-AKT(1∶500)，AKT(1∶500)，p-mTOR(1∶500)和mTOR(1∶500)在4℃下過(guò)夜。將膜用PBS洗滌3次以除去第一抗體，并與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶500)在室溫下溫育1 h。用PBS洗滌3次，并用ECL顯色試劑盒顯影曝光，用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織中miR-214的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組相比，DN組和DN+miR-NC組大鼠腎組織中miR-214的表達(dá)水平均顯著下調(diào)(均P<0.001)；與DN組和DN+miR-NC組比較，DN+miR-214 mimics組大鼠腎組織中miR-214的表達(dá)水平均顯著上調(diào)(均P<0.001)。見表1。

表1 各組大鼠腎組織中miR-214的表達(dá)

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、腎指數(shù)、FPG、UP、Scr和BUN水平的變化 與control組相比，DN組和DN+miR-NC組大鼠體質(zhì)量均明顯下降(均P<0.01)，腎指數(shù)、FPG、UP、Scr及BUN水平均明顯升高(均P<0.01，P<0.001)；與DN組和DN+miR-NC組相比，DN+miR-214 mimics組大鼠體質(zhì)量均升高(均P<0.05)，腎指數(shù)、FPG、UP、Scr及BUN水平均下降(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量、腎指數(shù)、FPG、UP、Scr和BUN水平的變化

2.3 各組大鼠腎組織病理學(xué)的變化 HE染色結(jié)果顯示，control組大鼠腎組織形態(tài)正常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)很少；與control組相比，DN組和DN+miR-NC組大鼠腎組織中出現(xiàn)不規(guī)則的腎小球，腎小管水腫伴部分壞死，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加(P<0.001)；與DN組和DN+miR-NC組相比，DN+miR-214 mimics組大鼠腎組織中可見規(guī)則的腎小球，輕度浮腫的腎小管，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少(P<0.01)。見圖1、表3。

表3 各組大鼠腎組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度

圖1 HE染色觀察各組大鼠腎組織病理變化(200×)

2.4 各組大鼠腎組織間質(zhì)纖維化的變化 Masson染色結(jié)果顯示，藍(lán)色膠原纖維沉積代表間質(zhì)化纖維面積，control組大鼠腎組織間質(zhì)纖維化面積極少；與control組相比，DN組和DN+miR-NC組大鼠腎組織間質(zhì)纖維化面積顯著增加(P<0.001)；與DN組和DN+miR-NC組相比，DN+miR-214 mimics組大鼠腎組織間質(zhì)纖維化面積明顯減少(P<0.01)。見圖2、表4。

表4 各組大鼠腎組織間質(zhì)纖維化面積

2.5 各組大鼠血清中氧化應(yīng)激水平的表達(dá) ELISA結(jié)果顯示，與control組相比，DN組和DN+miR-NC組大鼠血清MDA的水平顯著升高(P<0.001)，SOD、GSH、GSH-PX的水平明顯降低(均P<0.01)；與DN組和DN+miR-NC組相比，DN+miR-214 mimics組大鼠血清中MDA的水平降低(均P<0.05)，SOD、GSH、GSH-PX的水平升高(均P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠血清中MDA、SOD、GSH和GSH-PX的表達(dá)水平

2.6 各組大鼠腎組織中TGF-β1的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，與control組相比，DN組和DN+miR-NC組大鼠腎組織中TGF-β1的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)；與DN組和DN+miR-NC組相比，DN+miR-214 mimics組大鼠腎組織中TGF-β1的表達(dá)水平下降(P<0.05)。見圖3、表6。

圖3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠腎組織中TGF-β1的表達(dá)(200×)

表6 各組大鼠腎組織中TGF-β1的表達(dá)

2.7 PTEN是miR-214的靶基因 TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，PTEN可能是miR-214的候選目標(biāo)(圖4)。雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定結(jié)果顯示，miR-214 mimics明顯抑制了攜帶PTEN 3'UTR wt的熒光素酶活性(P<0.001)，但當(dāng)報(bào)告質(zhì)粒攜帶PTEN 3'UTR mut 時(shí)未觀察到明顯的抑制作用(P>0.05)，見表7。

圖4 miR-214與PTEN的結(jié)合位點(diǎn)

表7 雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果

2.8 各組大鼠腎組織中相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與control組比較，DN組和DN+miR-NC組大鼠腎組織中PTEN蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.001)，PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化程度均顯著升高(均P<0.001)；與DN組和DN+miR-NC組比較，DN+miR-214 mimics組大鼠腎組織中PTEN蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化程度均明顯下降(均P<0.01)。見圖5、表8。

圖5 Western blot檢測(cè)各組大鼠腎組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)

表8 各組大鼠腎組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

糖尿病已成為主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。在中國(guó)，2013年成人糖尿病的患病率達(dá)到了10.9%[9]。DN是糖尿病的常見慢性微血管并發(fā)癥，并且也是終末期腎臟疾病的重要原因。大約40%的糖尿病患者患有DN[10]。腎小球結(jié)構(gòu)肥大，腎小球基底膜增厚，腎小球系膜細(xì)胞增生，腎小管間質(zhì)擴(kuò)張以及細(xì)胞外基質(zhì)成分(如膠原蛋白和纖連蛋白)的異常堆積是DN的主要病理特征[11]。因此，深入研究DN的發(fā)病機(jī)制并認(rèn)識(shí)到治療DN的新靶點(diǎn)變得尤為重要和緊迫，這為DN的臨床預(yù)防和治療提供了新的依據(jù)。

miRNA是一類小的(約21個(gè)核苷酸長(zhǎng))非編碼RNA，通過(guò)翻譯抑制或促進(jìn)RNA降解來(lái)介導(dǎo)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[12]。miRNA參與許多關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，包括細(xì)胞增殖、分化、代謝，尤其是細(xì)胞凋亡[13-14]。大量研究表明，miRNA在DN的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，例如，miR-30e靶向BNIP3L來(lái)防止醛固酮誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡和線粒體功能障礙[15]。在DN大鼠外周血中miR-214的表達(dá)水平下調(diào)[16]。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，miR-214在DN大鼠腎組織中低表達(dá)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。進(jìn)一步探討miR-214對(duì)DN的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-214可以使DN大鼠的體質(zhì)量增加，腎指數(shù)、FPG、UP、Scr及BUN水平下降，也可使DN大鼠腎組織中腎間質(zhì)中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，膠原纖維沉積減少。

氧化應(yīng)激標(biāo)記物是一系列生物化學(xué)物質(zhì)，可反映體內(nèi)氧化應(yīng)激水平[17]。其中，ROS、活性氮和脂質(zhì)過(guò)氧化物常用于糖尿病檢測(cè)，氧化應(yīng)激標(biāo)志物的測(cè)定在揭示糖尿病的發(fā)生和發(fā)展與氧化應(yīng)激的相關(guān)性中起著重要的作用[18]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-214可降低DN大鼠的氧化應(yīng)激。Gao等[19]發(fā)現(xiàn)miR-214通過(guò)靶向ATF4和EZH2的增強(qiáng)子來(lái)保護(hù)紅系細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。這些結(jié)果證明miR-214的過(guò)表達(dá)降低了DN中的氧化應(yīng)激。

PTEN是經(jīng)典的促凋亡基因[20]，并且已發(fā)現(xiàn)在糖尿病及其并發(fā)癥中起著重要作用[21]。Mahimainatha等[22]發(fā)現(xiàn)高血糖引起的系膜細(xì)胞肥大與PTEN表達(dá)的降低有關(guān)。此外，已證明PI3K/AKT信號(hào)通路在糖尿病的增殖，細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞生存力中起著至關(guān)重要的作用[23]。PTEN是PI3K信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子，可以抑制AKT的激活[24]。本研究中發(fā)現(xiàn)，DN大鼠腎組織中PTEN蛋白顯著降低，PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化程度顯著升高。表明PTEN是miR-214的直接靶標(biāo)，且過(guò)表達(dá)miR-214可以上調(diào)PTEN蛋白的表達(dá)、降低PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化程度。

4 結(jié)論

miR-214在DN大鼠腎組織中表達(dá)下降，過(guò)表達(dá)miR-214對(duì)DN大鼠的腎組織起到治療作用，其作用機(jī)制可能與減輕腎組織的氧化應(yīng)激水平、TGF-β1蛋白表達(dá)和PI3K/AKT通路有關(guān)，可能是DN診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。