袁平 李其玲 周陽(yáng) 李經(jīng)綸 周翔宇

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 瀘州 646000；2.隆昌市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 隆昌 642150；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院甲狀腺血管外科，四川 瀘州 646000；4.德陽(yáng)市人民醫(yī)院血管外科，四川 德陽(yáng) 618000)

腦卒中是全球主要的致殘及死亡病因之一，缺血性卒中更是占到所有急性卒中的87%，顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄是其主要誘發(fā)因素[1]。miRNAs(小型非編碼RNA)逐漸成為中風(fēng)發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素，并參與關(guān)鍵代謝的調(diào)控、炎癥和血管生成[2]。研究顯示，miRNAs可以介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，從而致使顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄，其主要是通過(guò)調(diào)控脂質(zhì)代謝，影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷徙以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解等表型功能實(shí)現(xiàn)的[3]。但有關(guān)miRNAs在顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄患者中的作用仍有待進(jìn)一步證實(shí)。因此，本研究旨在探討顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄患者血清中一系列miRNAs的表達(dá)水平并分析其臨床相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年9月～2018年12月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的99例急性缺血性腦卒中患者。其中，男性74例，女性25例，平均(60.19±9.96)歲。依據(jù)腦血管造影(Angiography,DSA)結(jié)果分為對(duì)照組(顱內(nèi)外動(dòng)脈無(wú)狹窄，NOCS組，n=33)和狹窄組(n=66)。狹窄組按狹窄部位分為ICAS組(單純顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄，n=24)、ECAS組(單純顱外動(dòng)脈狹窄，n=18)、COMS組(顱內(nèi)外動(dòng)脈均有狹窄，n=24)；按狹窄程度分為輕度、中度、重度狹窄組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷明確的缺血性腦卒中患者按照《2014年中國(guó)急性缺血性腦卒中診療指南》臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。②診斷明確的顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄患者按照《2015中國(guó)缺血性腦血管病血管介入診療指南》臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。③患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①血液病、動(dòng)靜脈畸形、動(dòng)脈炎、動(dòng)脈剝離、惡性腫瘤等非動(dòng)脈粥樣硬化因素引起的缺血性腦卒中。②由心源性栓塞或其他明確栓子引起腦栓塞的患者。③嚴(yán)重心、肝、腎功能不全患者。④任何原因?qū)е虏荒芑虿辉概浜蠙z查的患者。本研究通過(guò)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 采集腦卒中患者靜脈血約3 mL，放入含EDTA的試劑管中，并迅速以3000 r/min離心15 min。之后，無(wú)酶EP管中收集上清200 μL，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR引物 從四川愛(ài)奇生物科技有限公司購(gòu)買人miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-125a-5p、miR-186-5p、miR-208b-3p等PCR引物，為確保序列的準(zhǔn)確性，應(yīng)用NCBI對(duì)每條相關(guān)引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證、分析。

1.2.3 RNA的提取和定量 RNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司。測(cè)定所提取的RNA濃度和檢測(cè)其完整性(微量分光光度計(jì)法)后，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR儀的操作說(shuō)明，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測(cè)miRNA的表達(dá)情況，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)表達(dá)量情況。

1.3 觀察指標(biāo) ①各組患者的一般臨床資料特征比較，包括男性、吸煙、高血壓、糖尿病比例，中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比值(NLR)、尿酸(UA)、胱抑素C(Cys-c)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白A1(Apo A1)、載脂蛋白B(Apo B)、纖維蛋白原(Fib)等各指標(biāo)。②對(duì)照組與狹窄組血清中miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p的表達(dá)水平比較。③對(duì)照組及不同狹窄程度組間miRNA的表達(dá)水平比較。④不同部位狹窄組間miRNAs表達(dá)水平比較。

2 結(jié)果

2.1 各組相關(guān)臨床指標(biāo)的比較 本研究將納入的腦卒中患者根據(jù)發(fā)生狹窄的部位的不同分為四組：NOCS組、ICAS組、ECAS組、COMS組。與NOCS組相比，ICAS組、ECAS組及COMS組中男性、吸煙、高血壓比例、UA、Cys-c、TC、LDL-C、Apo A1、Apo B等指標(biāo)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。而COMS組年齡明顯高于NOCS組(P<0.05)。各組糖尿病病例、HDL-C、NLR、TG、Fib等指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組相關(guān)臨床指標(biāo)的比較

2.2 顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄組和對(duì)照組血清中各miRNA的表達(dá)比較 RT-qPCR測(cè)定各組血清的miRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，狹窄組患者血清中miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)，而miR-125a-5p在狹窄組患者血清中的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，兩組患者血清miR-208b-3p表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 狹窄組和對(duì)照組血清miRNAs的相對(duì)表達(dá)水平比較

2.3 對(duì)照組及不同狹窄程度組間miRNA表達(dá)水平的比較 結(jié)合DSA，根據(jù)動(dòng)脈狹窄程度將顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄患者又分為輕度狹窄組(n=13)、中度狹窄組(n=18)和重度狹窄組(n=35)。與對(duì)照組比較，各不同程度狹窄組miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p和miR-186-5p的表達(dá)情況均明顯升高(P<0.001)，miR-125a-5p的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.001)。重度狹窄組miR-17-5p的表達(dá)水平明顯高于輕度狹窄組，miR-27b-3p表達(dá)水平高于輕、中度狹窄組，miR-125a-5p的表達(dá)水平卻明顯低于輕度狹窄組(均P<0.001)。輕、中度狹窄組miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-125a-5p和miR-186-5p表達(dá)水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；在3組狹窄組血清中，miR-92a-3p的表達(dá)水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)，miR-186-5p的表達(dá)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 對(duì)照組及不同狹窄程度組血清miRNAs的相對(duì)表達(dá)水平比較

2.4 不同部位狹窄組間miRNAs 表達(dá)水平的比較 根據(jù)動(dòng)脈狹窄部位的不同分為ICAS組(包括輕度狹窄7例，中度狹窄8例，重度狹窄9例)、ECAS組(包括輕度狹窄3例，中度狹窄4例，重度狹窄11例)和COMS組(包括輕度狹窄3例，中度狹窄6例，重度狹窄15例)。在COMS組中，盡管miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p和miR-186-5p的表達(dá)水平均高于ICAS組和ECAS組，miR-125a-5p表達(dá)低于ICAS組和ECAS組，然而統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 在不同部位動(dòng)脈狹窄組間miRNAs的表達(dá)水平比較

3 討論

腦卒中是一組由腦血管缺血或破裂出血而導(dǎo)致的疾病，其中缺血性腦卒中最為常見(jiàn)，發(fā)病率約占80%，其主要病理過(guò)程為動(dòng)脈粥樣硬化性(Atherosiclerosis, AS)狹窄，往往顱內(nèi)外動(dòng)脈都受累[1]。本研究中，首先分析了顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄患者的相關(guān)臨床指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A1、載脂蛋白B等有明顯差異，說(shuō)明該疾病與動(dòng)脈硬化的高危因素密切相關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[4]。盡管篩查顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄的方法如頸動(dòng)脈超聲、腦血管造影、TCD及CT/MRI血管成像等廣泛應(yīng)用，并非所有人群都能從上述篩查手段中確診并獲益[5]。因此，進(jìn)一步尋找與顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄相關(guān)的生物標(biāo)記物，對(duì)于頸內(nèi)外動(dòng)脈狹窄的臨床診斷和預(yù)測(cè)仍具有一定的意義。

miRNA是一類通過(guò)作用于多個(gè)靶基因調(diào)控不同的生物學(xué)過(guò)程的短鏈微小RNA[2]。miR其在疾病的早期病理過(guò)程中便可發(fā)生顯著變化[6]，并且在血液中具有可靠的穩(wěn)定性。因此，檢測(cè)血液中的miRNA的表達(dá)水平并將其作為生物學(xué)標(biāo)記物具有一定的臨床意義及可行性。本研究通過(guò)查閱文獻(xiàn)，選取了可能具有差異表達(dá)的6個(gè)miRNAs，檢測(cè)了其在顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄患者血清中的表達(dá)量。結(jié)果表明，在顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄患者血清中， miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p表達(dá)明顯升高，miR-125a-5p表達(dá)水平明顯降低，說(shuō)明上述5個(gè)miRNAs參與顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄的發(fā)病過(guò)程。根據(jù)狹窄程度不同分組，輕度、中度、重度動(dòng)脈狹窄組患者血清中，都存在不同miRNA表達(dá)差異，說(shuō)明血清miRNAs的差異可以在一定程度上部分反映頸動(dòng)脈狹窄程度，從而有利于臨床評(píng)估。就狹窄的不同部位而言，顱內(nèi)外動(dòng)脈均有狹窄組患者血清中，miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p水平顯著高于單純性顱內(nèi)或顱外組。顱內(nèi)外動(dòng)脈同時(shí)發(fā)生狹窄的病情嚴(yán)重程度可能相較于單純性顱內(nèi)或顱外動(dòng)脈狹窄更重，這可能是miRNAs差異表達(dá)的原因。但也不能排除其差異表達(dá)與顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄發(fā)生部位的不同有關(guān)。因此，可以嘗試將其作為預(yù)測(cè)顱內(nèi)外動(dòng)脈同時(shí)發(fā)生狹窄的生物學(xué)標(biāo)記物。

作為miR-17-19族的成員， miR-17-5p已被證實(shí)在惡性腫瘤的增殖和遷徙[7]、炎癥反應(yīng)的發(fā)生及AS的形成[8]等病理過(guò)程中都有重要的作用。其影響AS發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程可能與miR-17-5p誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞異常增殖相關(guān)[9]。多項(xiàng)研究顯示miR-17-5p可以作為預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈血管狹窄[5]及其狹窄嚴(yán)重程度[10]的重要標(biāo)志物，但未涉及到頸動(dòng)脈及顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄的情況。有研究認(rèn)為miR-17-5p的升高與腦卒中患者的預(yù)后相關(guān)，但并未評(píng)估血清中miR-17-5p水平與顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄程度相關(guān)性[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄患者血清中miR-17-5p表達(dá)明顯升高，并與狹窄程度顯著相關(guān)，提示miR-17-5p可能是預(yù)測(cè)顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄發(fā)生和嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。

血清中miR-27b-3p水平與胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(IGFBP3)及IGF-1水平呈負(fù)相關(guān)，而缺血性腦卒中的發(fā)生率又與IGF-1水平呈正相關(guān)，提示miR-27b-3p可能參與缺血性腦卒中的病理生理過(guò)程[14]。同時(shí)，在無(wú)癥狀頸動(dòng)脈狹窄患者血清中miR-27b-3p升高，結(jié)合本研究結(jié)果，miR-27b-3p的變化與顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄的程度呈正相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明miR-27b-3p不僅有預(yù)測(cè)頸動(dòng)脈狹窄的作用，在一定程度上有利于判斷顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄的情況。

多項(xiàng)對(duì)冠狀動(dòng)脈硬化的研究顯示，miR-92a-3p的升高可能與動(dòng)脈痙攣直接或間接導(dǎo)致AS的形成相關(guān)[13-14]，且與粥樣斑塊形成面積呈正相關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)在顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄患者血清中miR-92a-3p的表達(dá)顯著升高，提示其可能是缺血性腦卒中發(fā)生和發(fā)展中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。

最新研究認(rèn)為血清miR-186-5p在無(wú)癥狀頸動(dòng)脈狹窄早期診斷中的潛在作用，并明確其過(guò)表達(dá)與無(wú)癥狀頸動(dòng)脈狹窄患者腦卒中發(fā)生率密切相關(guān)，其研究結(jié)果表明miR-186-5p可以作為無(wú)癥狀頸動(dòng)脈狹窄患者的潛在診斷生物標(biāo)志物，并能夠作為未來(lái)腦卒中事件的預(yù)測(cè)因子[16]。本研究也證實(shí)，在有癥狀顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄者中，miR-186-5p不僅能作為腦卒中事件的預(yù)測(cè)因子，也可能預(yù)測(cè)顱內(nèi)外動(dòng)脈不同狹窄程度。

miR-125a-5p可以作為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)測(cè)標(biāo)記物[17]，其參與到AS過(guò)程可能與其能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生異常凋亡有關(guān)[18]。然而，對(duì)于miR-125a-5p對(duì)顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄及狹窄程度的預(yù)測(cè)作用，國(guó)內(nèi)外研究均鮮有報(bào)道。而我們的研究結(jié)果支持miR-125a-5p可能作為顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄及狹窄程度的潛在預(yù)測(cè)因子。

既往研究顯示，心肌缺血再灌注損傷病理過(guò)程的加重與miR-208b-3p的高表達(dá)相關(guān)。同時(shí)，在有癥狀的頸內(nèi)動(dòng)脈狹窄和無(wú)癥狀頸內(nèi)動(dòng)脈狹窄中，miR-208b-3p的表達(dá)水平存在顯著差異[19]。然而本研究中，miR-208b-3p的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？赡艿脑?，一方面可能與納入的病例數(shù)相對(duì)較少相關(guān)，另一方面雖然miRNAs在循環(huán)中具有穩(wěn)定表達(dá)，但其在組織、血清、血漿中的表達(dá)可能存在差異[20]。因此，未來(lái)在血漿、組織中的大樣本數(shù)據(jù)驗(yàn)證仍然是有必要的。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)檢測(cè)6個(gè)miRNAs在顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄組患者血清中的表達(dá)水平并分析其相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p、miR-125a-5p的表達(dá)改變與缺血性腦卒中患者顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄聯(lián)系緊密，且表達(dá)水平從某種程度反映顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄程度，可能對(duì)未來(lái)預(yù)測(cè)顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄程度提供新的生物標(biāo)志物。