喬彥 趙景宏 劉濤 孫娜 王曉娟

(南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院 1.內分泌科；2.心血管內科,四川 南充 637000)

1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus, T1DM)是一種慢性器官特異性自身免疫性疾病，發(fā)病率呈全球上升趨勢，患者需終生依賴胰島素治療維持生命，給社會和家庭帶來沉重的負擔[1-3]，所以T1DM的防治顯得尤為重要。T1DM主要是在遺傳易感基因的基礎上，由自身抗原特異性、致病性T淋巴細胞介導的免疫損傷造成胰腺b細胞進行性破壞導致胰島素絕對缺乏而致病，但具體機制尚未闡明[4-5]，而免疫和遺傳學易感因素越來越引起人們的重視。調節(jié)性T細胞(Regulatory T cell, Treg)是一類在調節(jié)機體免疫應答和維持免疫穩(wěn)定的過程中具有重要作用的CD4 T細胞群，有著天然的免疫抑制功能[6-7]。Treg細胞減少或抑制功能下降，會導致起某些包括T1DM、腫瘤、移植排斥等免疫相關疾病發(fā)生[8-10]。叉頭蛋白 p3(Forkhead box p3，Foxp3)是Treg細胞最特異性的轉錄因子，獨特表達于Treg細胞，對Treg細胞的分化發(fā)育和功能建立非常重要，其突變、缺陷或者表達異常會導致機體內免疫穩(wěn)態(tài)失衡，引發(fā)自身免疫性疾病[11-12]。動物研究及患者樣本研究發(fā)現，TIDM存在Foxp3+Treg數量和功能受損，修復或替代T1DM患者體內的Treg可能逆轉自身免疫并保護殘余b細胞功能[13]。有研究證實，與Foxp3+Treg細胞功能密切相關的基因單核苷酸多態(tài)性會影響Foxp3+Treg的功能[14]。不同種族和地域的人群的單核苷酸多態(tài)性分布規(guī)律及等位基因頻率是不同的，而Foxp3基因多態(tài)性與中國漢族人群T1DM的敏感性卻鮮有研究。本研究旨在探討川北地區(qū)漢族人Treg細胞轉錄因Foxp3基因啟動子區(qū)域-3279(C→A)位點rs3761548多態(tài)性的基因頻率分布及其與T1DM的相關性，為探討川北地區(qū)漢族人T1DM發(fā)病的分子遺傳基礎提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年4月～2020年9月我院內分泌科收治的180例經典T1DM患者為T1DM組。納入標準：①符合世界衛(wèi)生組織制定的糖尿病診斷及分型標準。②均為漢族。排除標準：①繼發(fā)性、其他特殊類型糖尿病。②合并急性并發(fā)癥、妊娠、嚴重高脂血癥及心、肺、肝、腎等主要臟器嚴重疾患。③合并其他類型的自身免疫性疾病。④合并惡性腫瘤。另隨機選取同期本地區(qū)無血緣關系的我院健康體檢者186名為對照組，經詢問病史和體檢，排除心、肺、肝、腎及內分泌疾病、自身免疫性疾病及家族史等，口服糖耐量試驗結果正常，均為漢族。本研究經醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA的分離及聚合酶鏈反應 抽取空腹12～14 h 靜脈血1 mL，EDTA 抗凝。按微量DNA全血提取法提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增引物由北京百泰克公司合成。引物1為 5′-CCT CTC CGT GCT CAG TGT AG -3′，引物2為 5′-GCC TCA GCC TTC GCC AAT A-3′。PCR反應總體積25 μL，含0.5 μmol/L 引物，200 μmol/L dNTP，25 mmol/L MgCl2，0.2 μg DNA 模板，2.0 U Taq DNA 聚合酶。反應在DNA熱循環(huán)儀上進行，PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃延伸5 min結束反應。用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測特異性PCR擴增產物。

1.2.2 基因分型 PCR擴增產物送北京三博遠志生物技術有限公司，采用質譜法完成進行基因分型。

1.2.3 臨床資料收集與生化指標檢測 由專業(yè)調查醫(yī)師登記研究對象的一般資料、現病史、既往史、家族史、診療過程等，測量身高、體重，計算體質指數(BMI)。酶法檢測空腹血糖(FPG)、餐后2小時血糖(2 h PG)、血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)；化學發(fā)光法檢測空腹C肽(FCP)、餐后2小時C肽(2 h CP)；液相色譜法檢測糖化血蛋白A1c(HbA1c)。低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C) 按公式 (TG<4.52 mmol/L ) 計算:LDL-C=TC-(TG/2.1+HDL-C)。

2 結果

2.1 兩組臨床及生化資料比較 T1DM組與對照組性別配比基本一致(P>0.05)。與對照組比較，T1DM組的年齡、BMI及HDL-C水平均顯著降低(P<0.05)，而HbA1C、FPG、2 h PG、TG、TC、LDL-C水平均顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 兩組臨床及生化資料比較

2.2 兩組Foxp3基因rs3761548基因型及等位基因頻率的比較 T1DM組和對照組的Foxp3基因rs3761548多態(tài)性基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。rs3761548等位基因分布在兩組均以C等位基因為常見等位基因，A等位基因為少見等位基因。rs3761548多態(tài)位點A等位基因頻率為18.7%，等位基因C、A的頻率在T1DM組和正常對照組分別為80.8%、19.2%和81.7%、18.3%。兩組間基因型頻率和等位基因頻率分布差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組Foxp3基因rs3761548基因型和等位基因頻率分布[n(×10-2)]

2.3 不同遺傳模型下Foxp3基因 rs3761548 多態(tài)性與T1DM的相關性 本研究進一步分析了在超顯性模型、顯性模型、隱性模型及加性模型下Foxp3基因 rs3761548 多態(tài)性與T1DM易感的相關性，結果提示，在四種不同的遺傳模型下，Foxp3基因rs3761548位點的基因型分布在T1DM組和對照組之間無統計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 不同遺傳模型下Foxp3基因rs3761548多態(tài)性與T1DM的相關性

2.4 T1DM患者Foxp3基因 rs3761548 多態(tài)性不同基因型亞組臨床特征的比較 T1DM組Foxp3基因 rs3761548 位點不同基因型的患者的LDL-C、FCP及2 h CP水平存在差異(均P<0.01)。與CC基因型患者相比，A等位基因攜帶者AA+CA基因型的LDL-C水平更高，而FCP、2 h CP水平更低。rs3761548多態(tài)位點不同基因亞組之間BMI、HbA1C、TG、TC、HDL-C等指標差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 T1DM組 rs3761548 多態(tài)性不同基因型臨床及生化資料的比較

3 討論

T1DM是一種由T淋巴細胞介導的胰島b細胞破壞，從而引起血糖升高的代謝紊亂性疾病，由遺傳易感性和環(huán)境危險因素相互作用導致，全球患病率不斷上升，然而其發(fā)病機制目前尚未闡明[15]。研究表明，許多與免疫相關的遺傳變異，如人類白細胞抗原Ⅱ類基因、細胞毒T淋巴細胞相關抗原4基因等均被證實與T1DM有關[16]。鑒于Treg細胞在免疫調節(jié)中的重要作用，本研究探討了Foxp3基因多態(tài)性與我國川北地區(qū)漢族人群T1DM的相關性。

Foxp3基因位于X染色體p11.23區(qū)域，是Treg細胞的標志性轉錄因子，恒定表達于Treg細胞上，與Treg細胞的發(fā)育和功能密切相關。Foxp3+Treg細胞分為天然型和誘導型，可以通過分泌細胞因子、耗竭IL-2、通過perforin通路抑制效應T細胞及降低ATP介導的前炎癥反應、抑制樹突狀細胞功能等多種分子機制起到免疫抑制的作用[17]。Foxp3+Treg細胞在1型糖尿病中表達下調，修復或替代T1DM患者體內的Treg可能逆轉自身免疫并保護殘余b細胞功能[18]。單核苷酸多態(tài)性是人類最為普遍的一種遺傳變異，可能使翻譯序列中某些氨基酸發(fā)生改變而影響蛋白質的生物功能甚至改變其生物性狀[19-20]。

本研究對我國366名漢族人群Foxp3基因 rs3761548 多態(tài)位點基因型分析顯示，在中國漢族人群中 rs3761548 多態(tài)位點A等位基因的頻率為18.7%，低于伊朗人群的61%[21]及土耳其人的56%[22]，顯示rs3761548 基因頻率存在明顯的種族差異性。T1DM組和對照組Foxp3基因 rs3761548 多態(tài)位點C、A等位基因頻率分別80.8%、19.2%和81.7%、18.3%，兩位點基因型頻率和等位基因頻率在T1DM組和對照組之間的分布差異均無統計學意義(P>0.05)。同時分別在超顯性模型、顯性模型、隱性模型、加性模型遺傳模型下，rs3761548位點基因型在兩組間分布差異無統計學意義，提示rs3761548多態(tài)位點與T1DM間沒有直接關聯。

rs3761548 的基因型AA和AC可能増加多種疾病的風險，如白癜風、銀屑病、Graves甲亢等[23-24]。我們進一步的基因型-表型關聯研究發(fā)現，Foxp3基因rs3761548 多態(tài)位點A等位基因攜帶者的FCP及2 h CP更低，而LDL-C水平更高，提示A等位基因攜帶者的T1DM進展及相關心血管并發(fā)癥的風險可能更高。El-Shabrawy等[25]研究發(fā)現低水平的Foxp3+Tregs與TIDM患者的LDL-C水平升高及心血管并發(fā)癥有關。

在這項研究中，我們評估了Foxp3基因的單核苷酸多態(tài)性rs3761548的可能作用，沒有發(fā)現所選單核苷酸多態(tài)性與T1DM風險之間的關聯，但是發(fā)現rs3761548 C→A的突變導致T1DM患者LDL-C水平更高，胰島功能更差。在今后的研究中，我們可以進一步擴大樣本量、關聯分析更多的SNP位點及進一步檢查Foxp3分子水平表達、Foxp3+Treg細胞水平等來研究Foxp3對T1DM的影響。

4 結論

Foxp3這一對免疫調節(jié)起重要作用的基因，其rs3761548多態(tài)性與T1DM沒有直接關聯，但 rs3761548位點A等位基因與我國川北地區(qū)漢族T1DM人群的LDL-C水平及FCP、2 h CP水平密切相關，提示Foxp3基因rs3761548位點與川北地區(qū)漢族人群T1DM患者的臨床特征相關。