汪銘煜 郭振 楊政 樊迪 唐其柱

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院 1.心血管內(nèi)科；2.代謝與相關(guān)慢病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430060)

心肌纖維化(Myocardial fibrosis, MF)是心臟在各種內(nèi)外環(huán)境刺激下發(fā)生的病理性改變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)的過(guò)度沉積和心肌成纖維細(xì)胞(Cardiac fibroblasts, CFs)的增殖，是影響心血管疾病預(yù)后的重要因素[1]。MF可導(dǎo)致心室壁僵硬、心室順應(yīng)性下降、心臟舒張功能受損，從而影響心臟的正常功能，最終進(jìn)展為心力衰竭[2-4]。澳洲茄堿(Solaso nine, SS)是一種含有甾體結(jié)構(gòu)的糖苷生物堿，是藥用植物龍葵的主要活性成分，對(duì)肝癌、宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病等多種腫瘤均有抑制作用[5-8]。既往研究表明，SS具有抑制血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)微管系統(tǒng)等作用[9-12]。并且，SS可通過(guò)調(diào)節(jié)p38 MAPK及Akt信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而這兩個(gè)信號(hào)通路均與MF的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[8,10,13]。因此，本研究認(rèn)為SS可能通過(guò)調(diào)節(jié)p38 MAPK及Akt信號(hào)通路改善MF。本研究主要采用主動(dòng)脈縮窄術(shù)(Aortic banding,AB)建立小鼠心臟纖維化模型，探討SS對(duì)小鼠MF的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 SS購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)純度>98%。GAPDH(9315)、P-p38 MAPK(4511)、T-p38 MAPK(9212)、P-Akt(4060)、T-Akt(4691)均購(gòu)于CST公司。羊抗兔二抗(美國(guó)CST公司，7074)；RIPA裂解液(美國(guó)賽默飛世爾公司，89900)；Trizol試劑(美國(guó)賽默飛世爾公司，15596)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR，RT-PCR)試劑(瑞士Roche公司，4896866001)，SYBRGreen I Master(瑞士Roche公司，4707516001)。定量RT-PCR儀(瑞士Roche公司，型號(hào)：LC480)，酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司，Synergy HT)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型 選取8～10周齡雄性C57/BL6小鼠40只，體質(zhì)量23.5～27.5 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管病研究所，飼養(yǎng)環(huán)境SPF級(jí)。所有針對(duì)于動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)均通過(guò)武漢大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將C57小鼠分為假手術(shù)組、假手術(shù)組+SS組、AB組、AB+SS組，每組10只。AB+SS組接受AB手術(shù)3周后，每天腹腔注射SS(10 mg/kg)；AB組接受AB手術(shù)3周后，每天腹腔注射等量的生理鹽水；假手術(shù)+SS組接受假手術(shù)處理(不結(jié)扎主動(dòng)脈，其余步驟一致)3周后，每天腹腔注射SS(10 mg/kg)；假手術(shù)組接受假手術(shù)處理3周后，每天腹腔注射等量的生理鹽水。腹腔注射持續(xù)1周。

1.2.2 心功能測(cè)量及取材 各組小鼠完成腹腔注射處理后，于異氟烷吸入麻醉下行心臟超聲檢查，評(píng)估心功能情況[左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD]、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)及左室短軸縮短率(LVFS)]。完成測(cè)量后處死小鼠并收集心臟標(biāo)本，用于病理染色及分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.2.3 病理染色 經(jīng)4%甲醛溶液固定的心臟脫水，石蠟包埋切片后，進(jìn)行天狼猩紅染色(PSR)。

1.2.4 分子生物學(xué)檢測(cè) 采用免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)心肌纖維化相關(guān)分子。取心臟組織或心臟成纖維細(xì)胞，研磨后加入RIPA裂解液進(jìn)行裂解，提取蛋白并定量。每孔蛋白上樣量50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜，封閉后分別孵育一抗GAPDH抗體、P-p38 MAPK抗體、T-p38 MAPK抗體、P-Akt抗體、T-Akt抗體4℃過(guò)夜，次日二抗孵育1 h后顯色。以GAPDH作為內(nèi)參，采用Image-ProPlus6.0軟件檢測(cè)各條帶的吸光度(A)值。RT-PCR檢測(cè)MF標(biāo)志物mRNA的表達(dá)：取心臟組織或心臟CFs，Trizol法提取總mRNA，取2 μg mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，建立PCR反應(yīng)體系，檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的引物序列

1.3 p38 MAPK抑制實(shí)驗(yàn) 將原代大鼠心臟成纖維細(xì)胞接種到六孔板上培養(yǎng)。分別加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、10 ng/mL TGF-β1、PBS+50 μmol/L SS、10 ng/mL TGF-β1+50 μmol/L SS、PBS+1 μmol/L p38 MAPK抑制劑、10 ng/mL TGF-β1+1 μmol/L p38 MAPK抑制劑。24 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心臟功能比較 AB組心重/體重(HW/BW)及心重/脛骨長(zhǎng)(HW/TL)比值均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；而AB+SS組比值均明顯低于AB組(P<0.05)(圖1)。AB+SS組LVEDD明顯小于AB組，而LVEF及LVFS均明顯高于AB組(P<0.05)(表2)。上述結(jié)果表明，AB手術(shù)成功誘導(dǎo)了小鼠心功能不全，而SS改善了AB誘導(dǎo)的小鼠心功能不全。

圖1 各組小鼠心重/體重及心重/脛骨長(zhǎng)比值

表2 各組小鼠心臟超聲指標(biāo)

2.2 各組小鼠MF程度 PSR染色后觀察，AB組小鼠心臟的間質(zhì)及血管周圍纖維化程度明顯高于假手術(shù)組，而AB+SS組小鼠心臟的間質(zhì)及血管周圍纖維化程度顯著低于AB組(均P<0.05)。AB組小鼠心肌組織COL-1 mRNA、COL-3 mRNA、TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)水平與假手術(shù)組相比明顯升高(3.53±0.48vs1.00±0.11、4.87±0.81vs1.00±0.14、2.87±0.52vs1.00±0.18)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AB+SS組小鼠心肌組織上述指標(biāo)明顯低于AB組(1.89±0.41vs3.53±0.48、1.81±0.73vs4.87±0.81、1.64±0.46vs2.87±0.52)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠心肌組織纖維化程度

2.3 SS對(duì)小鼠MF相關(guān)信號(hào)通路的影響 Western blot結(jié)果顯示，AB組小鼠心肌組織中的p38 MAPK蛋白的磷酸化水平明顯高于假手術(shù)組(2.66±0.51vs1.00±0.09，P<0.05)，AB+SS組的p38 MAPK蛋白的磷酸化水平低于AB組(1.39±0.32vs2.66±0.51,P<0.05)；而Akt蛋白的磷酸化水平?jīng)]有顯著性差異(P>0.05),見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠心肌組織p38 MAPK及Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)及磷酸化情況

2.4 SS對(duì)心肌細(xì)胞纖維化的影響 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，TGF-β1+p38 MAPK 特異性抑制劑(SB203580)組和TGF-β1+SS組的COL-1、COL-3、TGF-β mRNA水平均顯著低于TGF-β1+PBS組(2.31±0.43，2.24±0.52vs4.98±1.42；1.78±0.28，1.71±0.33vs5.11±1.36；1.62±0.27，1.59±0.41vs3.66±0.54, 均P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 心肌成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

3 討論

心肌成纖維細(xì)胞的激活是MF發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。活化的心肌成纖維細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的作用下轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，分泌大量Ⅰ型、Ⅲ膠原蛋白及其他基質(zhì)蛋白，最終導(dǎo)致膠原沉積及心臟纖維化[14-15]。盡管MF在早期是維持心臟結(jié)構(gòu)完整，防止心臟功能障礙的適應(yīng)性反應(yīng)，但這些變化最終將導(dǎo)致心臟的惡性重構(gòu)，進(jìn)而發(fā)展為心力衰竭[3,16]。目前仍然沒(méi)有針對(duì)MF的特異性治療方法，探索新的有效治療措施十分重要。

MF的發(fā)生發(fā)展與TGF-β/Smads信號(hào)通路、MAPK通路、Akt信號(hào)通路等有關(guān)[17-18]。其中，p38 MAPK是MAPKs家族的主要成員之一，在心肌肥厚、心室重構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用[19-20]。抑制p38 MAPK活性可降低TGF-β誘導(dǎo)的CFs轉(zhuǎn)化，減少小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中膠原、纖連蛋白及α-SMA的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)p38 MAPK則可誘導(dǎo)CFs向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[21]。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制p38 MAPK不但能減輕心肌梗死后纖維化及α-SMA的表達(dá)，還能明顯提高缺氧或肺動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的小鼠右心室重構(gòu)，進(jìn)而改善心臟功能[22]。已有研究表明，SS通過(guò)調(diào)節(jié)p38 MAPK途徑從而抑制神經(jīng)膠原瘤的生長(zhǎng)，但其在心臟中的作用仍不明確[23]。

本研究發(fā)現(xiàn)，SS干預(yù)可明顯減輕AB誘導(dǎo)的MF，下調(diào)MF標(biāo)志物(COL-1、COL-3、TGF-β)的mRNA表達(dá)水平，同時(shí)降低了p38 MAPK的磷酸化水平，改善心臟功能。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，使用p38 MAPK抑制劑與SS干預(yù)均可使心肌纖維化標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平下降，提示SS可能通過(guò)p38 MAPK通路發(fā)揮其抗纖維化作用。

4 結(jié)論

澳洲茄堿可改善主動(dòng)脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)的小鼠心臟功能障礙及心肌纖維化，并抑制其向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。澳洲茄堿抗纖維化的作用可能與抑制p38 MAPK磷酸化水平相關(guān)，但其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步探究。