張睿，邸松蕊，余淑惠，劉金蓮，湯如瑩，葛東宇，董瑞娟，張建軍

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

諾麗(Noni)原產(chǎn)于波利尼西亞群島，為茜草科海濱木巴戟(MorindacitrifoliaL.)的果實，廣泛分布于太平洋南部諸島和中南半島地區(qū)，當(dāng)?shù)厝藨?yīng)用其強身健體治療各種疾病[1]，現(xiàn)代研究表明其具有強大的抗氧化能力[2]。目前諾麗已合法引入中國使用，國內(nèi)市場已出現(xiàn)諾麗與人參配伍，諾麗與黃精配伍，諾麗與山茱萸、女貞子配伍等產(chǎn)品。在專利網(wǎng)站進行檢索，截至2021年5月共有407條諾麗相關(guān)專利，其中不乏與中藥配伍之品。有學(xué)者對南美草藥阿薩伊等一系列外來藥物進行了中藥藥性探討[3]，并明確了新外來中藥的概念[4]，提出了外來藥物“中藥化”的研究策略[5]。為使諾麗在我國更好地推廣應(yīng)用，也為使其與中藥合理配伍，依據(jù)新外來中藥現(xiàn)代研究范式[6]，劉金蓮等[7]對諾麗文獻進行全面整理并首次進行系統(tǒng)的中醫(yī)藥理論分析，提出了諾麗的藥性為酸、甘、平,歸肝、腎、脾經(jīng)，具有滋補肝腎、強筋健骨、益氣養(yǎng)陰之效。有研究表明諾麗可改善記憶[8]，但其作用機制尚不明確。本研究旨在通過觀察諾麗對氫化可的松致腎陽虛模型記憶損傷小鼠行為學(xué)、病理、神經(jīng)遞質(zhì)和cAMP/PKA通路蛋白的影響，揭示諾麗補腎改善記憶的作用機制，為諾麗歸腎經(jīng)及補腎功效提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF雄性昆明小鼠60只，體質(zhì)量(20±2)g，購自斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0002。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房，小鼠自由攝食和飲水。實驗符合相關(guān)倫理學(xué)要求。

1.2 藥物

諾麗干粉(美國大溪地諾麗公司，批號：US20180321)，人參配方顆粒(北京康仁堂藥業(yè)有限公司，批號：18006312)，氫化可的松注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司，批號：1801181)。

1.3 試劑

環(huán)磷酸腺苷(cAMP)試劑盒、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、磷酸激酶A(PKA)ELISA試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所，批號：20190812，20190815，20190823)；乙酰膽堿(ACh)、5羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上素(NA)ELISA試劑盒(江蘇科特生物科技有限公司，批號：MB3256B，MB3179B，MB3092B，MB3269B)。

1.4 主要儀器

Epoch2C型酶標儀(美國BioTek)，SleeMPS/P2型包埋機(德國SLEE)，RM2245型切片機(德國Leica)，全自動切片掃描儀Axio Scan.Z1(德國ZEISS)。

1.5 方法

1.5.1 分組與給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機分為6組，每組10只，即對照組,模型組,人參組(1.00 g/kg，相當(dāng)于成人劑量6 g/d),諾麗高、中、低劑量組(1.33、0.67、0.33 g/kg，分別相當(dāng)于成人劑量8、4、2 g/d)。從實驗開始第1天，每天除對照組、模型組灌胃雙蒸水外，其余各組每天下午灌胃相應(yīng)藥物，連續(xù)14 d，灌胃容量為0.01 mL/g。

1.5.2 造模

除對照組外，其余5組每天上午灌胃氫化可的松(25 mg/kg)造成記憶損害模型，對照組灌胃生理鹽水，連續(xù)14 d[9-10]。

1.6 檢測指標

測量實驗第7天、第14天體質(zhì)量及大腦指數(shù)(Brain Index，BI=大腦質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%)；第10天和第14天行為學(xué)檢測跳臺實驗和避暗實驗的潛伏期，3 min的錯誤次數(shù)，消退測驗潛伏期，消退測驗3 min的錯誤次數(shù)；大腦尼氏染色(苯胺藍染液)，觀察椎體細胞形態(tài)，檢測尼氏體數(shù)量(運用Image pro plus 5.1進行形態(tài)計量)；ELISA檢測ACh、5-HT、DA、NA、cAMP、cGMP、PKA含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量、腦指數(shù)比較

實驗期間，各組小鼠活動正常，毛色正常，造模和用藥后，體質(zhì)量總體減輕，腦指數(shù)增加，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，氫化可的松、諾麗、人參均不會對體質(zhì)量和腦指數(shù)產(chǎn)生影響，結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量和腦指數(shù)的比較

2.2 小鼠記憶行為學(xué)比較

與對照組比較，模型組跳臺測驗和避暗實驗潛伏期顯著縮短(P<0.01)，測驗錯誤次數(shù)顯著增加(P<0.01)，說明造模成功。與模型組相比，人參組和諾麗高、中劑量組的潛伏期和消退潛伏期明顯延長(P<0.01，P<0.05)，錯誤次數(shù)和消退錯誤次數(shù)也明顯減少(P<0.01，P<0.05)。諾麗高劑量組的療效與人參組相近，結(jié)果見表2、表3。

表2 小鼠跳臺實驗結(jié)果

表3 小鼠避暗實驗結(jié)果

2.3 小鼠大腦海馬尼氏體表達情況

對照組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)椎體細胞排列緊湊和整齊，尼氏體豐富，且未有明顯的尼氏體深染或固縮。與對照組比較，模型組小鼠海馬CA3區(qū)尼氏體數(shù)量顯著減少(P<0.01)，細胞排列疏松，且有明顯的椎體細胞深染或固縮。與模型組相比，各給藥組小鼠海馬CA3區(qū)尼氏體數(shù)量顯著增加(P<0.01)，細胞排列稍緊湊，且椎體細胞深染和固縮減輕。結(jié)果見圖1，表4。

圖1 各組小鼠大腦尼氏染色(×10,×100)

表4 100倍光鏡下各組小鼠大腦CA3區(qū)尼氏體數(shù)量

2.4 小鼠大腦中ACh、5-HT、DA、NA含量比較

與對照組相比，模型組4種神經(jīng)遞質(zhì)含量均明顯下降(P<0.01，P<0.05)，與模型組相比,人參組和諾麗高、中劑量組可明顯回升4種神經(jīng)遞質(zhì)含量(P<0.01，P<0.05)，結(jié)果見表5。

表5 各組小鼠大腦神經(jīng)遞質(zhì)含量

2.5 小鼠大腦中cAMP、cGMP、PKA含量比較

與對照組相比，模型組cAMP、cGMP、PKA含量、cAMP/cGMP明顯下降(P<0.01)，與模型組相比,人參組，諾麗高、中、低劑量組均可明顯回升cAMP、cGMP、PKA含量、提升cAMP/cGMP比值(P<0.01，P<0.05)，結(jié)果見表6。

表6 小鼠大腦中cAMP、cGMP、PKA含量、

3 討論

隨著社會老齡化的發(fā)展趨勢，記憶減退逐漸成為了嚴重的社會和醫(yī)學(xué)問題，阿爾茲海默病的主要特征是記憶減退。據(jù)估計,到2030年，全球?qū)⒂?.35億人患有阿爾茲海默病[11]。目前仍未發(fā)現(xiàn)有效的途徑能從根本上治療記憶減退。對現(xiàn)存改善記憶的中成藥和中藥類保健食品進行數(shù)據(jù)挖掘和特點分析發(fā)現(xiàn)，改善記憶產(chǎn)品用藥多歸腎經(jīng)[12]。中醫(yī)理論認為記憶減退與腎密切相關(guān)，腎藏精主骨生髓，腦為髓海，腦為元神之府，腎中精氣虧虛，記憶力下降；腎中精氣充足，腦髓得養(yǎng)，則記憶力增強。GEORGIEVA-KOTETAROVA等[13]在記憶行為學(xué)方面觀察到諾麗可改善由地西泮誘導(dǎo)的癡呆大鼠模型，能夠有效防治記憶減退。本實驗重點研究其歸腎經(jīng)補腎改善記憶的功效和作用機制。

腎精虧耗產(chǎn)生的陰陽氣血失調(diào)是衰老和記憶減退的重要原因，當(dāng)陰陽平衡遭到破壞，人體機能穩(wěn)態(tài)就會發(fā)生破壞導(dǎo)致衰老和記憶減退。諾麗性平補腎，平補陰陽，即在腎精虧虛陰陽虛損的情況下，通過既補腎陰又補腎陽調(diào)節(jié)機體平衡，達到延緩衰老，改善記憶的目的，符合平性藥“條件顯性，雙向適用”的作用特點[14]。氫化可的松致腎陽虛模型是最早建立的中醫(yī)模型之一[15]，之后學(xué)者相繼用腺嘌呤法、頻繁交配法、甲狀腺切除法模擬腎陽虛，為腎陽虛模型的研究奠定了基礎(chǔ)。沈自尹[16]提出腎陽虛與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)有關(guān)，腎陽虛證在下丘腦-垂體-靶腺軸不同環(huán)節(jié)、不同程度的功能紊亂，在建立腎陽虛證動物模型方面取得了較大突破。氫化可的松為外源性糖皮質(zhì)激素，當(dāng)攝入大量外源性糖皮質(zhì)激素后垂體分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素受到抑制，導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)激素分泌減少，腎上腺萎縮，使模型動物出現(xiàn)一系列“耗竭”現(xiàn)象，符合中醫(yī)腎陽虛證的臨床表現(xiàn)。皋聰?shù)萚10]用氫化可的松建立腎陽虛記憶障礙小鼠模型，研究補腎填精對記憶的改善作用。在補腎陽本質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)，腎陽虛機體免疫功能總體水平低下，cAMP/cGMP比值下降是腎陽虛發(fā)病的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，應(yīng)用藥物使cAMP/cGMP升高，可表示該藥物可補腎陽[17]。依據(jù)同類比較原則，陽性藥選擇性溫、大補元氣、歸腎經(jīng)[18]、有明確改善記憶作用[19]的人參。人參性溫可溫補腎陽，大補元氣，元氣是人體各項生命活動的基礎(chǔ)，是腦部生理功能的根本；元氣充沛，則腦清神明；元氣虧虛，則髓海失養(yǎng)，記憶減退。本實驗?zāi)Ｐ徒McAMP/cGMP降低，用藥后cAMP/cGMP升高，諾麗和人參均表現(xiàn)出補腎陽的趨勢。

PACHAURI等[20]應(yīng)用東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶損傷模型，觀察到諾麗可增加避暗實驗的潛伏時間，增加乙酰膽堿酯酶的活性、提升谷胱甘肽活性、清除丙二醛。本研究避暗實驗及跳臺實驗結(jié)果均說明氫化可的松造模后，小鼠存在嚴重的認知障礙。給予人參或諾麗后其記憶行為得到改善，說明人參或諾麗可改善對小鼠的認知能力。諾麗高劑量改善小鼠認知障礙的效果最好，且效果與人參相當(dāng)。病理觀察小鼠大腦海馬CA3區(qū)椎體細胞和尼氏體數(shù)量。椎體細胞是參與信息傳遞局部微環(huán)路的中間神經(jīng)元，尼氏體為神經(jīng)元細胞器合成和更新提供結(jié)構(gòu)蛋白，常作為神經(jīng)元功能狀態(tài)的標志[21]，尼氏體多而大表明神經(jīng)細胞合成蛋白質(zhì)的功能較強，突觸為接受信號和傳遞信號的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的改變均會影響學(xué)習(xí)記憶[22]。因此抑制神經(jīng)元丟失和改善突觸的形態(tài)及其功能可能對海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶具有一定的意義。尼氏染色結(jié)果說明模型組小鼠存有明顯的神經(jīng)元丟失和尼氏體損傷。給予人參或諾麗后，椎體細胞深染固縮減輕，表明人參和諾麗可以抑制小鼠神經(jīng)元丟失。

ACh屬于中樞膽堿能系統(tǒng)，在記憶調(diào)節(jié)中起著重要作用[23]。5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)的遞質(zhì)[24]。DA參與學(xué)習(xí)、記憶和注意力等各種認知過程[25]。NA對記憶的準確性和泛化產(chǎn)生相反的影響，通過對記憶的時間依賴性重組的系統(tǒng)鞏固過程產(chǎn)生不同的影響。NA增強基底外側(cè)杏仁核-海馬連通性來提高記憶準確性，從而產(chǎn)生持久的海馬依賴性情節(jié)性記憶[26]。造模后，4種神經(jīng)遞質(zhì)均明顯減少，而應(yīng)用人參或諾麗后，神經(jīng)遞質(zhì)含量均得到恢復(fù)。說明諾麗可以調(diào)控記憶損傷情況下的腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)。

cAMP作為細胞內(nèi)傳遞信息的第二信使，主要由腺苷酸環(huán)化酶催化三磷酸腺苷而來，容易被細胞內(nèi)磷酸二酯酶水解。因此，神經(jīng)細胞內(nèi)的水平，是由磷酸二酯酶和腺苷酸環(huán)化酶二者功能狀態(tài)決定的。cAMP的升高可增強突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，其作用可能是直接的，也可能是通過激活PKA來實現(xiàn)。研究表明，cAMP/PKA信號通路在蛋白合成依賴性時相中起重要作用，可以經(jīng)由磷酸化轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)元件啟動通路下游基因的轉(zhuǎn)錄，還能夠磷酸化通道結(jié)構(gòu)亞基而改變其功效，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子水平和鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。cAMP/PKA信號通路從多個方面改善神經(jīng)元內(nèi)在生長狀態(tài)影響軸突生長，促進軸突的再生[27]。PKA磷酸化代謝過程中的一些靶蛋白中的絲氨酸或者蘇氨酸殘基，將其激活或活化[28-29]。這些被磷酸化的蛋白是關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)酶、功能重要的蛋白質(zhì)或者轉(zhuǎn)錄因子，因此可以介導(dǎo)細胞外信號調(diào)節(jié)的代謝、基因轉(zhuǎn)錄等細胞的效應(yīng)。通過對底物蛋白的磷酸化而參與其下游受體的基因表達、突觸功能等的調(diào)控、神經(jīng)活性物質(zhì)的釋放與合成。神經(jīng)元和突觸為海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶的生物學(xué)基礎(chǔ)[30]，其下游釋放的神經(jīng)活性物質(zhì)包括Ach、5-HT、DA、NA等。諾麗可以提升cAMP、PKA含量進而促使腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)釋放。

綜上所述，腎生髓通腦，諾麗補腎可改善氫化可的松致腎陽虛的記憶損傷，其機制可通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)cAMP/PKA通路蛋白，影響下游神經(jīng)遞質(zhì)含量，促進神經(jīng)元蛋白合成而實現(xiàn)。本研究為探討諾麗中藥藥性、指導(dǎo)臨床配伍應(yīng)用及闡明改善記憶機制提供實驗依據(jù)。諾麗的中藥藥性仍有待在實踐中不斷驗證與完善。