李永志，張鋮，裴俊鵬，張萬川，張春東，2，戴冬秋，3

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院胃腸外科，沈陽 110032；2.東京大學(xué)醫(yī)學(xué)部胃食道外科，東京 113-0033；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腫瘤治療中心，沈陽 110032）

胃癌是全球五大常見癌癥之一［1］。胃癌與幽門螺桿菌［2］、高鹽飲食、低水果飲食、飲酒和吸煙等因素相關(guān)［3］。近年來胃癌的發(fā)病率和死亡率緩慢下降［4］，但全球胃癌患者的5年生存率仍很低［5-6］。因此，研究胃癌進展的生物學(xué)分子機制對胃癌的早期診斷和治療具有重大意義。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在細胞核或細胞質(zhì)中調(diào)節(jié)基因的表達［7］。它們編碼蛋白質(zhì)能力較弱［8］。lncRNA參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控［9-10］、胚胎發(fā)育和疾病進展等過程［11-12］，lncRNA的失調(diào)可促進腫瘤的進展［13-14］。

MCF2L基因的變異與骨關(guān)節(jié)炎有關(guān)［15］。MCF2L反義RNA 1（MCF2L-AS1） 是新鑒定出來的位于染色體13q34上的lncRNA，可以調(diào)節(jié)骨細胞的分化［16］。

本研究通過生物信息學(xué)分析和實時定量PCR發(fā)現(xiàn)，相對于癌旁非癌胃組織，MCF2L-AS1在胃癌組織中表達升高。本研究還對MCF2L-AS1在胃癌中調(diào)節(jié)增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用進行分析，并通過癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）和基因本體論（the gene ontology，GO） 數(shù)據(jù)庫對與MCF2L-AS1相關(guān)的mRNA進行了富集分析，以探索MCF2L-AS1可能參與的生物學(xué)過程。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的2種胃癌細胞系（HGC-27，AGS）和非癌胃細胞系（GES-1） 購自中國科學(xué)院。RPMI-1640培養(yǎng)基和高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。胎牛血清購自美國Gibco公司。TRIzol試劑和Lipofectamine 3000試劑購自美國Invitrogen公司。TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa實時熒光定量試劑盒購自寶生物工程（大連） 有限公司。siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。細胞計數(shù)試劑盒8和Transwell 小室購自美國康寧公司。Matrigel（基質(zhì)膠） 購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用TCGA數(shù)據(jù)庫，分析lncRNAMCF2L-AS1在375例胃癌組織和32例癌旁非癌胃組織中的表達水平差異。

1.3 細胞培養(yǎng)

HGC-27細胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，而AGS和GES-1細胞用含有10%胎牛血清及100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。在37 ℃和5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)基每2～3 d更換1次。

1.4 RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄

使用TRIzol 試劑提取細胞總RNA，并使用分光光度計檢測RNA的濃度和純度。按照試劑盒說明書，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。

1.5 實時PCR檢測

按照TaKaRa試劑說明書配置試劑混合物，采用TaKaRa實時熒光定量試劑盒對cDNA進行實時熒光定量檢測。以GAPDH為內(nèi)參，每個樣品重復(fù)3次。之后讀取 Ct值，計算靶基因的表達量。lncRNAMCF2L-AS1與內(nèi)參GAPDH的引物序列見表 1。

表1 引物和si-RNA的序列Tab.1 Sequence of primers and si-RNA

1.6 siRNA轉(zhuǎn)染

針對MCF2L-AS1設(shè)計特異性siRNA（si-MCF2LAS1#1，si-MCF2L-AS1#2） 和陰性對照si-NC（表 1）。將處于對數(shù)生長期的細胞接種于培養(yǎng)板，融合＞50%時根據(jù)試劑的轉(zhuǎn)染操作說明進行操作，使用不含血清的培養(yǎng)基稀釋siRNA和Lipofectamine 3000，靜置5 min，混勻后再靜置20 min。棄掉細胞瓶中原有培養(yǎng)基，并用不含血清的培養(yǎng)基洗2遍，之后加入siRNA和Lipofectamine 3000的混合液，將si-MCF2L-AS1（＃1，＃2） 與si-NC轉(zhuǎn)染到HGC-27和AGS細胞中，4～6 h后更換含有血清的培養(yǎng)基，48 h后用實時PCR檢測轉(zhuǎn)染前后MCF2L-AS1的表達情況并進行進一步的實驗。

1.7 CCK-8法檢測細胞增殖情況

取轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，計數(shù)并調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100 μL細胞懸液，使每孔的細胞數(shù)為2 000，每個樣品5個復(fù)孔，邊緣孔加等量的無菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS），培養(yǎng)0、24、48、72 h后每孔加10 μL的CCK-8試劑，并繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標儀測量各孔在450 nm處的光密度（optical density，OD） 值。

1.8 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力

取轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，將細胞用無血清培養(yǎng)基重懸，制成細胞懸液后調(diào)整細胞懸液濃度為1×105/mL，取200 μL的細胞懸液分別加入含基質(zhì)膠和不含基質(zhì)膠的小室內(nèi)，使每個小室內(nèi)含有20 000個細胞，在下室加入含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基。溫育48 h后，細胞遷移或侵襲至小室底部外表面，去除培養(yǎng)基后用PBS洗2遍，之后用多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min。晾干后在顯微鏡下隨機選取6個視野計數(shù)并拍照。

1.9 基因富集分析

利用TCGA和GO數(shù)據(jù)庫預(yù)測與lncRNAMCF2L-AS1表達相關(guān)的mRNA，并進行基因富集分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗均重復(fù)進行3次，數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用成對t檢驗進行比較，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA MCF2L-AS1在胃癌組織和細胞中高表達

TCGA數(shù)據(jù)庫的結(jié)果顯示，375例胃癌組織中MCF2L-AS1的表達明顯高于32例癌旁非癌胃組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.000 1，圖1A）。實時PCR結(jié)果顯示，lncRNAMCF2L-AS1在HGC-27和AGS細胞中表達均明顯高于GES-1細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1B。

圖1 lncRNA MCF2L-AS1在胃癌組織與細胞中的表達情況Fig.1 Expression of long noncoding RNA MCF2L-AS1 in gastric cancer

2.2 敲低MCF2L-AS1抑制HGC-27和AGS細胞的增殖遷移和侵襲

在HGC-27和AGS細胞中敲低MCF2L-AS1，實時PCR結(jié)果顯示，si-MCF2L-AS1#2敲低的效果更明顯（圖2A）。因此后續(xù)研究采用si-MCF2L-AS1#2作為敲低MCF2L-AS1的siRNA。

CCK-8法檢測MCF2L-AS1對HGC-27和AGS細胞增殖的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，MCF2L-AS1敲低后的HGC-27和AGS細胞增殖能力下降（P＜ 0.05），見圖2B。

Transwell方法檢測MCF2L-AS1對HGC-27和AGS細胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，MCF2L-AS1敲低后HGC-27和AGS細胞遷移和侵襲能力均下降（P均＜0.05），見圖2C、2D。

圖2 敲低胃癌細胞中長鏈非編碼RNA MCF2L-AS1對胃癌細胞增殖侵襲和遷移能力的影響Fig.2 The effect of MCF2L-AS1 knockdown on the proliferation，invasion，and migration of gastric cancer cells

2.3 MCF2L-AS1與細胞周期等生物學(xué)過程密切相關(guān)

利用TCGA和GO數(shù)據(jù)庫預(yù)測了與MCF2L-AS1相關(guān)的mRNA，并通過富集分析發(fā)現(xiàn)MCF2L-AS1可能與細胞周期、微管細胞骨架組織、減數(shù)分裂的細胞周期和有絲分裂激酶B通路等密切相關(guān)，見圖3。

圖3 與MCF2L-AS1相關(guān)的mRNA功能富集分析結(jié)果Fig.3 Enrichment analysis results of mRNA associated with MCF2L-AS1

3 討論

在過去的幾十年中，盡管胃癌的診斷和治療方法取得了顯著進展，但由于癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，全球胃癌患者的5年生存率仍然很低［5-6］。因此，詳細研究胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制對于尋找治療胃癌的新靶點和新策略至關(guān)重要。

lncRNA是一類RNA分子，其轉(zhuǎn)錄本＞200個核苷酸。它們被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，優(yōu)先定位于細胞核中，調(diào)節(jié)順式或反式基因的表達。而且，具有類似于mRNA共有序列的3’切割和聚腺苷酸化特征的lncRNA可以輸出至細胞質(zhì)執(zhí)行細胞質(zhì)功能［7］。在人類基因組中，lncRNA作為常見的表觀遺傳調(diào)控分子，在表觀遺傳學(xué)中發(fā)揮重要作用，并參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括RNA剪切和修飾、mRNA穩(wěn)定和翻譯、蛋白質(zhì)穩(wěn)定和運輸、染色體形成和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［9-10］。它們參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育，組織分化，器官形成以及某些疾病的發(fā)生和發(fā)展［11-12］。lncRNA的失調(diào)可通過調(diào)節(jié)增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移來促進腫瘤發(fā)生并促進癌癥的發(fā)展［13-14］。許多研究［17-18］表明，lncRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜機制中發(fā)揮著不可或缺的作用［19-21］。

MCF2L基因編碼一個鳥嘌呤核苷酸交換因子，與三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP） 結(jié)合的Rac1可與該因子特異性相互作用，并在Rho/Rac信號通路中起作用［15］。MCF2L反義RNA 1（MCF2L-AS1）是最近新發(fā)現(xiàn)的lncRNA。CHEN等［16］發(fā)現(xiàn)MCF2L-AS1能控制成骨分化，HUANG等［22］和ZHANG等［23］發(fā)現(xiàn)MCF2L-AS1在結(jié)直腸癌中過表達，并且促進結(jié)直腸癌的增殖侵襲和遷移。本研究探討了MCF2L-AS1在胃癌中的表達情況，并分析了MCF2L-AS1在胃癌中的潛在作用。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，MCF2L-AS1在胃癌組織中的表達顯著上調(diào)，實時PCR檢測結(jié)果顯示，在HGC-27和AGS細胞中發(fā)現(xiàn)MCF2L-AS1的表達水平的確明顯高于非癌胃細胞GES-1。敲低MCF2L-AS1后，CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)胃癌細胞的增值能力明顯減弱。進而通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，敲低MCF2L-AS1后，胃癌細胞的侵襲和遷移能力也受到抑制。最后，采用TCGA和GO數(shù)據(jù)庫對MCF2L-AS1相關(guān)的mRNA進行了富集分析，發(fā)現(xiàn)其可能與細胞周期等生物學(xué)過程密切相關(guān)。因此，推測lncRNAMCF2L-AS1在胃癌中過表達，并且這種過表達促進了胃癌的增殖侵襲和遷移。然而，MCF2L-AS1在胃癌中發(fā)揮作用的具體分子機制以及MCF2L-AS1所涉及的信號通路還有待進一步研究。

綜上所述，本研究證實了MCF2L-AS1在胃癌中過表達，而且MCF2L-AS1通過促進胃癌的增殖、侵襲和遷移在胃癌中發(fā)揮促癌作用。