張偉溪 王顏波,2 丁昌俊 朱文旭,3 蘇曉華

(1.林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 北京 100091；2.南昌工程學(xué)院 南昌 330099； 3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 沈陽 110866)

自從Parsons等(1986)證實(shí)楊樹(Populus)可以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化、外源基因可在林木細(xì)胞中表達(dá)以來，林木基因工程研究已經(jīng)取得長(zhǎng)足發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球至少有35個(gè)國家對(duì)百余個(gè)樹種進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化研究，其中楊樹、番木瓜(Carica)、松樹(Pinus)、柳樹(Salix)、核桃(Juglans)、蘋果(Malus)、櫻桃(Cerasus)、樟樹(CinnamomumSect.Camphora)、懸鈴木(Platanus)、桉樹(Eucalyptus)、云杉(Picea)、美國栗(Castaneadentata)、美國榆(Ulmusamericana)等200多個(gè)轉(zhuǎn)基因林木已進(jìn)入田間試驗(yàn)階段或已批準(zhǔn)商品化(FAO，2004;Straussetal.,2011;Sedjo,2005;Klockoetal.,2018;Muhretal.,2018;Changetal.,2018;康向陽，2020)。轉(zhuǎn)基因林木的改良性狀主要集中在抗病、抗蟲等抗生物脅迫，抗除草劑，抗旱、耐鹽等抗非生物脅迫，降低木質(zhì)素合成、增加纖維素合成等材性改良以及發(fā)育調(diào)控等方面(Londoetal.,2010)。由此可見，轉(zhuǎn)基因林木主要應(yīng)用于木材生產(chǎn)或在生態(tài)景觀建設(shè)等方面，并不像轉(zhuǎn)基因作物一樣直接或間接涉及人類生命安全相關(guān)問題。但是，轉(zhuǎn)基因林木的環(huán)境釋放及推廣應(yīng)用的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)仍不容忽視，其生態(tài)安全性監(jiān)測(cè)仍需持續(xù)跟蹤進(jìn)行，以便有效地規(guī)避其生態(tài)安全問題，從而加速轉(zhuǎn)基因林木的商業(yè)化應(yīng)用和推廣。因此，加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因生物安全的基礎(chǔ)研究，提高對(duì)轉(zhuǎn)基因生物安全性評(píng)價(jià)水平，制定有效的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和管理策略尤為重要。

目前，轉(zhuǎn)基因植物生態(tài)安全評(píng)估主要集中在轉(zhuǎn)基因植物外源基因逃逸以及對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響方面(Londoetal.,2010;Richardsonetal.,2011)，如外源基因可能存在通過花粉、種子以及無性繁殖器官等媒介向其近緣種或其他生物群體進(jìn)行基因漂移和水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)(Wangetal.,2018;Klockoetal.,2018)。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，參與土壤結(jié)構(gòu)形成、分解有機(jī)質(zhì)和礦物質(zhì)，與植物根部營養(yǎng)吸收密切相關(guān)。因此，轉(zhuǎn)基因植物的外源基因可能通過水平轉(zhuǎn)移整合到土壤微生物的基因組中，從而改變其遺傳特性與功能(Luetal.,2018)。例如，轉(zhuǎn)基因西瓜(Citrulluslanatus)中35S啟動(dòng)子基因存在向土壤微生物轉(zhuǎn)移的可能(Keese,2008)，在轉(zhuǎn)Bt玉米(Zeamays)、棉花(Gossypium)等作物的土壤中檢測(cè)到了不同水平的Bt 蛋白(Stotzky,2005;Icozetal.,2008)。但也有研究發(fā)現(xiàn)，外源基因發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的頻率低于自然轉(zhuǎn)化的頻率，從而給環(huán)境帶來的風(fēng)險(xiǎn)可以忽略(Keese,2008)，如對(duì)成熟期雄性轉(zhuǎn)Bt基因歐洲黑楊(Populusnigra)人工林基因流頻率和距離研究發(fā)現(xiàn)，距轉(zhuǎn)Bt楊樹人工林0 m處產(chǎn)生Bt種子的頻率為0～0.15%，500 m處產(chǎn)生Bt種子的頻率為0～0.02%，在自然條件下，轉(zhuǎn)Bt楊樹人工林通過花粉或種子產(chǎn)生的基因流水平極低(Huetal.,2017)。另外，外源基因表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物目標(biāo)性狀改變有可能影響相關(guān)代謝途徑產(chǎn)物的積累，從而通過植物落葉、根系等對(duì)根際土壤微生物及其群落的多樣性產(chǎn)生潛在影響(Dauduetal.,2009;Gaoetal.,2014)。如轉(zhuǎn)基因水稻(Oryzasativa)生長(zhǎng)旺盛時(shí)期土壤中細(xì)菌數(shù)量顯著增加(陳曉雯等,2011);轉(zhuǎn)MdSOS2L1基因蘋果(Malusdomestica)植株根際微生物多樣性研究表明，轉(zhuǎn)基因與野生型植株根際微生物群落豐富度和多樣性存在較大差異，轉(zhuǎn)MdSOS2L1植株根際酸桿菌門(Acidobacteria)豐度增加較多，藍(lán)藻門(Cyanophyta)、放線菌門(Actinobacteria)豐度略有下降，同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株根際土壤的蘋果酸、檸檬酸、草酸含量明顯升高，轉(zhuǎn)基因植株根際微生物的差異極有可能與MdSOS2L1基因介導(dǎo)的有機(jī)酸分泌有關(guān)(王曉娜等，2018)。因此，土壤微生物的種類和數(shù)量通?？勺鳛檗D(zhuǎn)基因植物生態(tài)安全性檢測(cè)的重要指標(biāo)。目前有關(guān)轉(zhuǎn)基因植物系統(tǒng)生態(tài)安全性監(jiān)測(cè)研究多集中在大豆(Glycinemax)、玉米、棉花、水稻等農(nóng)作物方面(Icozetal.,2008;Keetal.,2014;Lietal.,2017)。轉(zhuǎn)基因林木雖有研究，但多以苗期或幼齡的轉(zhuǎn)Bt、Cry1A、Cry3A等基因林木為主，并未發(fā)現(xiàn)外源基因向土壤微生物轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象(胡建軍等,2004;侯英杰等,2009;魏冰等,2009;張雁等,2012;李霞等,2011;Tranetal.,2018;Zuoetal.,2018;孫偉博等,2020)，對(duì)成齡期轉(zhuǎn)基因林木監(jiān)測(cè)研究較少(Zhuetal.,2016;朱文旭等,2017;Huetal.,2017;呂威等,2018)。與集約化程度較高的農(nóng)作物相比，轉(zhuǎn)基因林木栽培環(huán)境復(fù)雜、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、經(jīng)營管理相對(duì)粗放，且多為風(fēng)媒傳粉，因此，對(duì)成齡期轉(zhuǎn)基因林木試驗(yàn)林的土壤微生物進(jìn)行長(zhǎng)期持續(xù)性監(jiān)測(cè)非常必要。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取轉(zhuǎn)抗逆轉(zhuǎn)錄因子基因(JERF36)銀中楊(Populusalba×P.berolinensis)——抗逆1號(hào)楊(ABJ01)及非轉(zhuǎn)基因銀中楊(9#，對(duì)照)為研究材料，抗逆1號(hào)楊(ABJ01)是本實(shí)驗(yàn)室早期通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將連有35S啟動(dòng)子和NOS終止子的JERF36基因?qū)脬y中楊中，并且通過PCR、RT-PCR、Southern 雜交等分子檢測(cè)獲得外源基因成功整合并穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因銀中楊，其中JERF36基因是從番茄(Lycopersiconesculentum)中克隆獲得的茉莉酸乙烯應(yīng)答元件基因，編碼AP2/EREBP類植物轉(zhuǎn)錄因子，能專一結(jié)合GCC-box，在植物中能夠激活下游抗逆相關(guān)基因表達(dá)，提高抗逆性。報(bào)告基因nptⅡ來自于細(xì)菌，編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，能賦予細(xì)胞抗卡那霉素能力(Lietal.,2009)?？鼓?號(hào)楊已獲得環(huán)境釋放及生產(chǎn)性試驗(yàn)行政許可，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，其形態(tài)未發(fā)生明顯變化，抗旱耐鹽性顯著提高，于2015年獲得國家植物新品種保護(hù)權(quán)。

1.2 試驗(yàn)地概況及樣品采集

試驗(yàn)林位于北京市房山區(qū)韓村河?xùn)|營苗圃(115°58′E，39°37′N)，2006年春季造林，轉(zhuǎn)基因株系及其對(duì)照均按隨機(jī)區(qū)組，正方形種植100株(行10 株、列10 株)，株行距為2 m × 2 m，造林總面積為0.66 hm2。試驗(yàn)地的地勢(shì)、地貌、氣溫、降雨、植被、栽培管理等自然條件和人為管理均一致，整個(gè)試驗(yàn)階段林地不進(jìn)行任何肥水及噴施農(nóng)藥管理。

分別于2015年5—8月、2016年5—10月及2017年5—10月每月中旬取樣1次，選擇連續(xù)3天以上晴天的上午在試驗(yàn)林地內(nèi)使用土鉆鉆取非根際土壤。隨機(jī)選取抗逆1號(hào)楊(ABJ01)和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)各3株進(jìn)行取樣，以植株為中心，每株選取與主干50 cm距離的東南西北4個(gè)點(diǎn)進(jìn)行取土，去除表層腐殖質(zhì)層，留取 10～20 cm土柱，將土樣中的石塊和植物的根殘?bào)w等雜物去掉，裝入無菌的封口袋中混合均勻，放在冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。該土壤樣品用于研究微生物?shù)量變化。2017年7月分別隨機(jī)選取抗逆1號(hào)楊(ABJ01)和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)各10株采集幼嫩葉片，并按非根際土壤取樣方法采集林下雜草，每種雜草取2～3片葉子混合；同時(shí)采集試驗(yàn)林地旁(約10 m)行道樹毛白楊(Populustomentosa)、歐美楊(Populus×euramericana)雌株樹下自然生長(zhǎng)的實(shí)生楊樹幼苗葉片，延路每隔10 m取1次樣品，取樣10次，每株楊樹幼苗取3～5片葉子混合。樣品用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃ 低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物及土壤基因組DNA的提取 采用 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen,Germany)提取抗逆1號(hào)楊(ABJ01)、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)、林下雜草以及試驗(yàn)林旁行道樹下楊樹幼苗葉片基因組DNA；使用 PowerSoil? DNA Isolation Kit(Mobio,America)提取2017年7月非根際土壤中微生物的總DNA，具體操作參照試劑盒使用手冊(cè)。

1.3.2 細(xì)菌基因組DNA的提取 選取2017年7月采集的抗逆1號(hào)楊(ABJ01)、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)土壤樣本的10-1土壤懸濁液涂布在含卡那霉素濃度50 mg·L-1的細(xì)菌選擇培養(yǎng)基平板中篩選抗性菌株，共獲得2株。分別挑取其單菌落使用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，吸取5 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液5 000 r·min-1離心1 min，棄上清。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN,China)提取2個(gè)菌株的基因組DNA。

1.3.3 土壤及細(xì)菌DNA質(zhì)量檢測(cè) 以土壤微生物總DNA和細(xì)菌DNA為模板，去離子水為陰性對(duì)照。以細(xì)菌16S rRNA通用引物(上游引物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；下游引物：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為468 bp。

1.3.4 外源基因水平轉(zhuǎn)移情況檢測(cè) 以上述提取的所有DNA為模板，質(zhì)粒DNA為陽性對(duì)照，去離子水為陰性對(duì)照。根據(jù)JERF36序列設(shè)計(jì)特異引物(上游引物：5′-CTCCCTTGAACATTGCTTG-3′；下游引物：5′-TGATTGCCCGTCAACATAC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為278 bp。

1.3.5 土壤微生物數(shù)量測(cè)定 采用稀釋平板法培養(yǎng)土樣中的細(xì)菌、真菌、放線菌。稱取 10 g 土壤樣品倒入裝有90 mL無菌水和無菌小玻璃珠(10粒)的三角瓶中，置于搖床上(200 r·min-1)室溫振蕩30 min，隨后用無菌水稀釋土壤懸濁液(使用移液槍準(zhǔn)確吸取0.1 mL土壤懸浮液注入0.9 mL的無菌水中即得到終濃度為10-1土壤懸濁液)，其中，細(xì)菌稀釋液終濃度分別為10-3、10-4、10-5的土壤懸濁液，放線菌稀釋液終濃度分別為10-2、10-3、10-4的土壤懸濁液，真菌稀釋液終濃度分別為10-1、10-2、10-3的土壤懸濁液。吸取50 μL稀釋懸濁液均勻涂在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)菌)、馬丁(Martin)孟加拉紅-鏈霉素培養(yǎng)基(培養(yǎng)真菌)、改良淀粉銨鹽培養(yǎng)基(培養(yǎng)放線菌)上，放線菌置于28 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)菌和真菌置于35 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。2天后統(tǒng)計(jì)真菌的菌落數(shù)，2～4天后統(tǒng)計(jì)細(xì)菌的菌落數(shù)，5天左右統(tǒng)計(jì)放線菌菌落數(shù)。每個(gè)菌種每個(gè)濃度培養(yǎng)3次。同時(shí)稱取50 g的待測(cè)土樣，用牛皮紙信封裝好，放于烘箱中，105 ℃烘烤，烘至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量，計(jì)算土壤含水量，從而計(jì)算出每克干土中土壤微生物的菌落數(shù)，菌落數(shù)=(菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù))/[接種量毫升數(shù)×(1-含水量)]。采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源基因JERF36的水平轉(zhuǎn)移

采用外源基因JERF36的特異性引物分別對(duì)抗逆1號(hào)楊(ABJ01)、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)、林下雜草、林下土壤、試驗(yàn)林旁行道樹下楊樹實(shí)生苗葉片、土壤中篩選出的抗性菌株基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖1A)，采用細(xì)菌16S rRNA通用引物對(duì)林下土壤、土壤中篩選出的抗性菌株基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖1B)。結(jié)果顯示，在抗逆1號(hào)楊(ABJ01)的基因組DNA中能擴(kuò)增出JERF36目的片段(278 bp)，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)、林下雜草、林下土壤、試驗(yàn)林旁行道樹下楊樹實(shí)生苗葉片以及2個(gè)抗性菌株基因組DNA均沒得到擴(kuò)增產(chǎn)物，且在土壤及菌株DNA，均能檢測(cè)到微生物DNA，說明土壤及抗性菌株基因組DNA質(zhì)量合格。以上說明種植11年后，JERF36基因仍穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因植株基因組中，并未發(fā)現(xiàn)向林地土壤、周邊雜草等發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。

圖1 外源基因JERF36 PCR檢測(cè)Fig.1 PCR detection of exogenous gene JERF36A:外源基因JERF36 PCR檢測(cè)(1：非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?#；2：林下雜草；3：林下土壤總DNA；4：試驗(yàn)林旁行道樹下楊樹實(shí)生苗葉片；5：抗性菌株1；6：抗性菌株2；7：轉(zhuǎn)基因植株ABJ01；CK+：質(zhì)粒陽性對(duì)照；CK-：去離子水陰性對(duì)照)；B:16S rRNA PCR檢測(cè)(H：去離子水陰性對(duì)照；1：林下土壤總DNA 1；2：林下土壤總DNA 2；3：抗性菌株1；4：抗性菌株2；M：DNA marker)。A:PCR detection of exogenous gene JERF36 (1:Non-transgenic control 9#;2:Understory weed;3:Total DNA in soil;4:Seedling leaves of roadside poplar beside the test field;5:Kanamycin-resistant strain 1;6:Kanamycin-resistant strain 2;7:Transgenic poplar ABJ01;CK+:Plasmid positive control;CK-:Deionized water negative control);B:PCR detection of 16S rRNA(M:DNA marker;H:Deionized water negative control;1:Total DNA in soil 1;2:Total DNA in soil 2;3:Kanamycin-resistant strain 1;4:Kanamycin-resistant strain 2).

2.2 林下土壤微生物的數(shù)量

分別對(duì)9年生(2015年)、10年生(2016年)、11年生(2017年)抗逆1號(hào)楊(ABJ01)及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)林下土壤中微生物總數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)分析(圖2A)。3年連續(xù)性觀測(cè)顯示，各年份成齡抗逆1號(hào)楊與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ臻g林下土壤中微生物總數(shù)量均無顯著差異；不同年份間的抗逆1號(hào)楊和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏牧窒峦寥牢⑸飻?shù)量均略有差異，但無明顯變化規(guī)律。其中6—8月是土壤中微生物快速增長(zhǎng)期，其總量呈現(xiàn)2015年>2016年>2017年；而3個(gè)年份間6—8月氣溫并無顯著差異(圖2B)，但降雨天數(shù)差異明顯且呈現(xiàn)2015年(44天)>2016年(37天)>2017年(31天)(圖2B)。在2016年和2017年的9—10月土壤中微生物總量、氣溫迅速下降，但在2016年9—10月的降雨天數(shù)維持穩(wěn)定，2017年降雨天數(shù)先下降后上升，2017年9—10月試驗(yàn)林中土壤微生物總數(shù)量顯著高于2016年。由此推測(cè)可能由于降雨差異導(dǎo)致土壤濕度變化，進(jìn)而造成不同年份間抗逆1號(hào)楊和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏牧值赝寥牢⑸飻?shù)量差異，而抗逆1號(hào)楊未對(duì)林地土壤微生物總量造成影響。

圖2 9～11年生(2015—2017年)楊樹林地土壤微生物總數(shù)量以及不同月份氣溫和降雨天數(shù)Fig.2 Total number of microorganisms of 9-11 year-old(2015-2017)poplar test field and the temperature and raining days in different months9#:非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?ABJ01:轉(zhuǎn)基因植株。下同。不同小寫字母表示不同月份微生物數(shù)量在0.05水平上存在顯著性差異;“*”表示不同年份間微生物數(shù)量在0.05水平上存在顯著性差異。9#:Non-transgenic plants;ABJ01:Transgenic plants.The same below.Different lowercase letters indicate significant differences in the number of microorganisms in different months at the 0.05 level;“*”means significant differences in the number of microorganisms in different years at the 0.05 level.

分別對(duì)9年、10年、11年生抗逆1號(hào)楊(ABJ01)及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?9#)林地土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)分析(圖3)。結(jié)果表明：9年、10年、11年生抗逆1號(hào)楊和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ樟值赝寥?大類微生物數(shù)量在樹木生長(zhǎng)季呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，其中在生長(zhǎng)旺季的7月和8月林地土壤微生物數(shù)量最高，顯著高于開始生長(zhǎng)階段(5月和6月)和停止生長(zhǎng)階段(9月和11月)。3個(gè)年份中，細(xì)菌和放線菌的數(shù)量均在每年的8月達(dá)到最高值；9年生、10年生抗逆1號(hào)楊和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ樟值赝寥乐姓婢鷶?shù)量也在8月達(dá)到最高值，11年生的林地土壤中真菌數(shù)量在7月峰值最高?？鼓?號(hào)楊與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ臻g林地土壤中3大類微生物數(shù)量均無顯著差異，變化趨勢(shì)一致。表明抗逆1號(hào)楊未對(duì)林地土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量造成影響，而其中的微小差異可能是由氣候等其他因素造成的。

圖3 9～11年生(2015—2017年)林地土壤細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量Fig.3 Total numbers of bacteria,actinomycetes,and fungi in soil of 9-11 years old (2015—2017)poplar test fieldA：9年生楊樹5—8月土壤微生物數(shù)量；B：10年生楊樹5—10月土壤微生物數(shù)量；C：11年生楊樹5—10月土壤微生物數(shù)量。不同小寫字母表示不同月份微生物數(shù)量在0.05水平上存在顯著性差異。A：Total number of soil microorganisms in 9-year-old poplar plantation from May to August;B：Total number of soil microorganisms in 10-year-old poplar plantation from May to October;C：Total number of soil microorganisms in 11-year-old poplar plantation from May to October.Different lowercase letters indicate significant differences in the number of microorganisms in different months at the 0.05 level.

通過對(duì)不同年份間細(xì)菌、真菌和放線菌的比例分析(圖4)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)年份中，抗逆1號(hào)楊和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ樟值赝寥乐?類微生物的比例相似，從高到低依次是細(xì)菌、放線菌和真菌；不同年份間3類微生物所占比例略有差異，但并沒有出現(xiàn)某一類微生物急速增加或降低的現(xiàn)象。說明抗逆1號(hào)楊并沒有破壞主要微生物種類之間的平衡。

圖4 不同年份(2015—2017年)林地土壤中微生物比例Fig.4 Proportions of microorganisms in plantation soil in different years(2015—2017)不同小寫字母表示不同年份間微生物比例在0.05水平上存在顯著性差異。The different lowercase letters mean significant deference of the microbial proportion in different years at the 0.05 level.

綜上所述，對(duì)試驗(yàn)林內(nèi)抗逆1號(hào)楊與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ赵诔升g期后的連續(xù)監(jiān)測(cè)顯示，試驗(yàn)林地土壤微生物的數(shù)量和種類平衡并未發(fā)現(xiàn)顯著變化，而環(huán)境變化如降雨差異可能是不同年份微生物數(shù)量差異的主要原因，抗逆1號(hào)楊與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ樟值匚⑸飻?shù)量略微差異需要結(jié)合環(huán)境因素做進(jìn)一步研究分析。

3 討論

隨著越來越多轉(zhuǎn)基因植物的大面積田間種植，其對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響一直備受矚目。而外源基因在轉(zhuǎn)基因受體植物中，特別是多年生林木中是否會(huì)發(fā)生逃逸現(xiàn)象是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物安全性的首要問題(Frankenhuyzenetal.,2004)。盡管早期研究發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)基因林木中存在外源基因沉默現(xiàn)象(Jouaninetal.,2000;Kumaretal.,2001)，但眾多研究表明外源基因能在轉(zhuǎn)基因林木中穩(wěn)定存在并表達(dá)。例如，對(duì)5年生轉(zhuǎn)基因741楊[Populusalba×(P.davidiana+P.simonii)×P.tomentosa]田間檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，外源基因Cry1Ac、Cry3A仍能穩(wěn)定表達(dá)，未發(fā)現(xiàn)丟失和沉默現(xiàn)象(Zuoetal.,2018)；轉(zhuǎn)基因雜種山楊(Populustremula×P.tremuloides)在溫室生長(zhǎng)18年后，外源基因rolC依然穩(wěn)定表達(dá)，并未出現(xiàn)外源基因丟失和沉默現(xiàn)象(Fladungetal.,2013)；經(jīng)過7年田間試驗(yàn)的轉(zhuǎn)Bt基因歐洲黑楊(Populusnigra)的外源基因仍存在于轉(zhuǎn)基因楊的基因組中(胡建軍等，2004)；轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)春花(Catharanthusroseus)在5年后依然檢測(cè)到外源基因rolA、rolB、rolC的存在和穩(wěn)定表達(dá)(Vermaetal.,2015)。本試驗(yàn)使用外源基因特異引物對(duì)轉(zhuǎn)基因銀中楊(抗逆1號(hào)楊)和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?銀中楊)的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)結(jié)果表明，抗逆1號(hào)楊在田間種植11年后，外源基因仍穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因楊樹的基因組中，未發(fā)生外源基因丟失現(xiàn)象。

基因水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象在原核生物中廣泛存在，在真核生物中也有一些相關(guān)報(bào)道(Kyndtetal.,2015;Quispe-Huamanquispeetal.,2019;Matveevaetal.,2019)。林木生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因樹木種植大田后，每年試驗(yàn)林中產(chǎn)生大量根茬、落葉、花粉、果實(shí)等，經(jīng)過多年累積，外源基因可能通過根際分泌物、土壤微生物降解和吸收有機(jī)物的過程進(jìn)入土壤體內(nèi)，影響周圍土壤環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性等(Gaoetal.,2014;Aslametal.,2017;Figueredoetal.,2018)。因此外源基因是否發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，土壤中微生物的種類、群落數(shù)量等是否發(fā)生變化是對(duì)轉(zhuǎn)基因林木進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)的重要方面。對(duì)包含3 種編碼不同抗性蛋白的外源基因(PeTLP、Cry1Ac、AtGols)的轉(zhuǎn)基因南林895楊試驗(yàn)林進(jìn)行安全性評(píng)估，未發(fā)現(xiàn)外源基因向土壤微生物中轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象(孫偉博等,2020)。5年生轉(zhuǎn)基因741楊的生態(tài)安全性評(píng)價(jià)表明，在土壤和林下雜草中未檢測(cè)到外源基因，外源基因沒有發(fā)生基因轉(zhuǎn)移，多年生轉(zhuǎn)基因楊樹對(duì)土壤理化性質(zhì)和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生影響，微生物群落結(jié)構(gòu)主要受地理位置和季節(jié)變化的影響(Zuoetal.,2018)。大田種植12年后轉(zhuǎn)基因毛白楊暫未對(duì)土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量造成顯著影響(呂威等,2018)。轉(zhuǎn)Bt基因棉花根際土壤微生物的活性并不受Bt蛋白的影響，其主要的影響因素是土壤的鹽分(Luoetal.,2017)。本實(shí)驗(yàn)室早期研究顯示，8年生轉(zhuǎn)多基因歐美楊 (Populus×euramericana‘Guariento’)未發(fā)現(xiàn)外源基因轉(zhuǎn)移，其與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g林地土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)無顯著差異，其對(duì)土壤微生物系統(tǒng)沒有明顯的影響，轉(zhuǎn)基因楊樹的土壤微生物數(shù)量主要受季節(jié)變化影響(朱文旭等，2015；2017；Zhuetal.,2016)。對(duì)不同區(qū)域抗逆1號(hào)楊及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諆?nèi)生菌多樣性研究表明，外源基因?qū)氩⑽磳?duì)抗逆1號(hào)楊根、莖中內(nèi)生菌(細(xì)菌和真菌)群落結(jié)構(gòu)及多樣性產(chǎn)生影響，微生物的群落結(jié)構(gòu)主要取決于土壤pH值和有機(jī)質(zhì)含量(Wangetal.,2019)。本試驗(yàn)也未在抗逆1號(hào)楊試驗(yàn)林內(nèi)的雜草和林地土壤微生物基因組中檢測(cè)到外源基因。由于本試驗(yàn)材料在轉(zhuǎn)JERF36基因的同時(shí)引進(jìn)了報(bào)告基因nptⅡ，為了進(jìn)一步驗(yàn)證土壤中抗卡那霉素的細(xì)菌是否被整合上外源基因，本試驗(yàn)篩選出2個(gè)抗性菌株，但均未得到外源基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，充分表明外源基因未發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。此外，抗逆1號(hào)楊與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ樟值赝寥乐械募?xì)菌和真菌數(shù)量無顯著差異；放線菌僅在2015年(楊樹9年生)的7月份略有差異，可能是環(huán)境變化引起，隨后的2年中均無顯著差異。也進(jìn)一步證實(shí)11年生抗逆1號(hào)楊并未對(duì)土壤微生物的種類、數(shù)量造成顯著影響。

此外，還有通過檢測(cè)試驗(yàn)林內(nèi)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、表層土凋落物、花粉中外源基因表達(dá)等方面對(duì)多年生轉(zhuǎn)基因楊樹對(duì)土壤環(huán)境的安全性進(jìn)行檢測(cè)，但均未發(fā)現(xiàn)顯著影響。如在內(nèi)蒙古地區(qū)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)林地內(nèi)的轉(zhuǎn)基因銀中楊安全性檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)基因銀中楊并未影響其根際土壤微生物的數(shù)量及主要類群的數(shù)量(呂秀華,2017；2018)；種植13年的轉(zhuǎn)基因三倍體毛白楊枯落物中的外源基因暫未水平轉(zhuǎn)移到根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌基因組中(呂威等,2019)。雖然上述研究并未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因楊樹對(duì)根際土壤等產(chǎn)生顯著影響，但本研究中并未進(jìn)行相關(guān)方面安全性檢測(cè)，因此在今后的研究中可加強(qiáng)本試驗(yàn)林在該方面的相關(guān)檢測(cè)內(nèi)容，以期更加全面地進(jìn)行轉(zhuǎn)基因楊樹試驗(yàn)林的安全性檢測(cè)，為轉(zhuǎn)基因林木安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)基因林木對(duì)生態(tài)的影響是一個(gè)長(zhǎng)期而復(fù)雜的過程，目前尚沒有公認(rèn)的評(píng)估轉(zhuǎn)基因植物生態(tài)安全性的方法和標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)JERF36基因銀中楊生態(tài)安全性的初步分析表明，外源基因在轉(zhuǎn)基因銀中楊中穩(wěn)定存在，沒有發(fā)現(xiàn)向周邊環(huán)境水平轉(zhuǎn)移，并未發(fā)現(xiàn)外源基因?qū)雽?duì)林地土壤微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)造成影響。森林中土壤微生物的組成和結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，關(guān)于轉(zhuǎn)基因林木生態(tài)及生物安全性監(jiān)測(cè)需要進(jìn)行更加系統(tǒng)、全面和長(zhǎng)期的研究。