鄧小敏 楊署光 田維敏

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ?？?571101)

天然橡膠是關(guān)系到國(guó)計(jì)民生與國(guó)防安全的重要戰(zhàn)略物資之一，其中聚順式天然橡膠(cis-1,4-polyisoprene rubber)主要來(lái)源于橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)，由特化的乳管細(xì)胞中起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的橡膠合成機(jī)器——橡膠粒子合成(史敏晶等，2016)。天然橡膠生物合成從本質(zhì)上仍是植物類(lèi)異戊二烯代謝。該生物合成過(guò)程可分為3部分，即上游的甲羥戊酸合成途徑、五碳合成前體異戊二烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)的合成途徑，以及IPP經(jīng)橡膠粒子上的橡膠轉(zhuǎn)移酶立體選擇性聚合生成聚順式異戊二烯橡膠 (Lietal.,2016；鄧小敏等，2018a；Cherianetal.,2019。橡膠樹(shù)和橡膠草(Taraxacumkok-saghyz)基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)的應(yīng)用展示了參與這些過(guò)程的基因成員(Lauetal.,2016;Tangetal.,2016;Makitaetal.,2018;Liuetal.,2020)。除了個(gè)別基因在橡膠草和橡膠樹(shù)中進(jìn)行了功能驗(yàn)證外，這些研究主要聚焦在基于蛋白序列的同源序列比對(duì)分析預(yù)測(cè)與基因表達(dá)水平的檢測(cè)上，即僅從基因序列信息層面、基因表達(dá)水平層面和蛋白質(zhì)序列及其修飾類(lèi)型等層面說(shuō)明其與乳管細(xì)胞天然橡膠合成的關(guān)系，但是還缺乏直接的酶學(xué)證據(jù)證明這些關(guān)鍵酶參與了天然橡膠前體的合成，因而難以加深對(duì)天然橡膠合成機(jī)理的認(rèn)識(shí)。

生產(chǎn)上主要使用乙烯利刺激橡膠樹(shù)增產(chǎn)，乙烯不僅促進(jìn)了由水通道蛋白介導(dǎo)的排膠時(shí)間延長(zhǎng)，同時(shí)也增強(qiáng)了膠乳中與天然橡膠合成相關(guān)的能量與物質(zhì)代謝(莊海燕等，2010)，特別是還參與小橡膠粒子再生相關(guān)的小橡膠粒子SRPP蛋白的表達(dá)與修飾調(diào)控過(guò)程(Wangetal.,2015；Yuetal.,2020)。除了乙烯利明顯的刺激增產(chǎn)效果外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)另一重要植物激素——茉莉酸不僅促進(jìn)次生乳管細(xì)胞的發(fā)育，亦能夠通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)正調(diào)控割膠后天然橡膠的再生過(guò)程。茉莉酸通過(guò)促進(jìn)法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)合成酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)基因HbFPS1和小橡膠粒子蛋白基因HbSRPP1的轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)割膠后的橡膠再生(Dengetal.,2018)。法尼基焦磷酸是橡膠粒子天然橡膠生物合成的直接引發(fā)劑(Cornishetal.,1999)，一般認(rèn)為由法尼基焦磷酸合成酶催化香葉基焦磷酸(geranyl pyrophosphate，GPP)和IPP聚合而成。

橡膠樹(shù)基因組中含有預(yù)測(cè)的3個(gè)法尼基焦磷酸合成酶HbFPS1、HbFPS2和HbFPS3編碼基因。這3個(gè)酶的編碼基因不僅在膠乳中的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平上存在著差異，而且其一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列也存在差異。在轉(zhuǎn)錄水平上，HbFPS1和HbFPS2基因在膠乳中的表達(dá)量較高，并且HbFPS1基因的表達(dá)量高于HbFPS2基因，而HbFPS3基因在膠乳中表達(dá)最低(郭冬等，2015；Guoetal.,2015)。在蛋白水平上，乙烯處理前后的小橡膠粒子差異蛋白質(zhì)譜中僅鑒定到豐度較高的HbFPS1和HbFPS2蛋白，而未鑒定到HbFPS3蛋白，這說(shuō)明HbFPS1和HbFPS2蛋白編碼基因的高轉(zhuǎn)錄水平與其在小橡膠粒子上發(fā)揮作用的蛋白豐度水平正相關(guān)(Wangetal.,2019)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)HbFPS1和HbFPS2蛋白的相似性達(dá)95%，而HbFPS3蛋白與前二者相似性?xún)H為84%，盡管HbFPS1、HbFPS2和HbFPS3的一級(jí)結(jié)構(gòu)存在差異，但是其三級(jí)主體結(jié)構(gòu)仍較相似(Guoetal.,2015)。這些研究說(shuō)明高同源性蛋白HbFPS1和HbFPS2可能是參與天然橡膠生物合成中的重要蛋白，為了在酶學(xué)水平上明確HbFPS1和HbFPS2的酶催化產(chǎn)物，明晰其在天然橡膠合成中的作用，本研究將表達(dá)純化HbFPS1和HbFPS2蛋白，并研究其催化底物偏好性和產(chǎn)物的特性，研究結(jié)果將為橡膠樹(shù)產(chǎn)膠性狀的遺傳改良提供堅(jiān)實(shí)的酶學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與試劑

海南省儋州市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)內(nèi)的7年生成熟橡膠樹(shù)無(wú)性系Reyan7-33-97品系(平均樹(shù)圍約50 cm)以S/2 d/3的割制(陽(yáng)刀1/2樹(shù)圍，3天一刀)采集膠乳。并且每個(gè)膠乳樣品為等體積混合的10 棵割膠樹(shù)的膠乳。

分子生物學(xué)相關(guān)試驗(yàn)所用的試劑為天根生化科技(北京)有限公司的植物總RNA 提取試劑盒和快速質(zhì)粒小提試劑盒(DP105)，Thermo Scientific 公司的蛋白預(yù)染Marker 和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，英濰捷基(上海)有限公司合成所需引物，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司的2× PrimerSTAR Max Permix和膠回收試劑盒，NEB限制性?xún)?nèi)切酶和T4 DNA 連接酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司的pEASY-Blunt Cloning Kit和Trans1-T1及BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室保存的pET28a 載體，北京索萊寶生物科技有限公司的IPTG。

1.2 基因克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

參考郭冬等(2015)和Guo等(2015)中對(duì)橡膠樹(shù)3個(gè)法尼基焦磷酸合成酶基因的命名及其編碼框序列(HbFPS1:XM_021816652.1;HbFPS2:KT306000.1;HbFPS3:KT306001.1)設(shè)計(jì)HbFPS1基因引物：HbFPS1-F：5′-CCGGAATTCATGGCGGATCTGAAGT CAACT-3′ 和HbFPS1-R：5′-CCGCTCGAGTTTCTGT CTCTTGTAAATTTTGGC-3′；HbFPS2基因引物：HbFPS2-F：5′-CGCGGATCCATGTCTGATCTGAAGTC GACATTCTTG-3′和HbFPS2-R：5′-CCGGAATTCT TATTTCTGTCTCTTGTAAATTTTGGC-3′；HbFPS3基因引物：HbFPS3-F:5′-CGCGGATCCATGAGCGATCC AAAATCCAAGTTC-3′和HbFPS3-R：5′-CCGCTCGAG TCATTTGTTCCCGGCAGCATTCC-3′。利用RT-PCR方法以膠乳cDNA為模板進(jìn)行PCR克隆。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增體系：13 μL PCR級(jí)水，15 μL 2× PrimerSTAR Max Permix，0.5 μL正反向引物，1 μL膠乳cDNA模板。目的條帶膠回收純化后HbFPS1基因片段直接用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切過(guò)夜，含HbFPS2基因片段用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切過(guò)夜，含HbFPS3基因片段用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切過(guò)夜，經(jīng)熱失活后分別與EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切、BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切以及BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后的對(duì)應(yīng)載體在16 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化Trans1-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后分別在卡那霉素抗性平板上進(jìn)行篩選。待菌落PCR 鑒定到含有目的基因的陽(yáng)性菌后送英濰捷基(上海)有限公司測(cè)序確證目的基因的核酸序列。

1.3 蛋白序列與結(jié)構(gòu)分析

采用ClustalW2.0軟件對(duì)橡膠樹(shù)HbFPS1、HbFPS2和HbFPS3 蛋白進(jìn)行同源比對(duì)分析。HbFPS1和HbFPS2蛋白結(jié)構(gòu)的同源模建參考Guo等(2015)的方法進(jìn)行。以蒿屬ArtemisiaspiciformisFPS1蛋白的晶體結(jié)構(gòu) (PDB id:4kk2.1)為模板分別構(gòu)建HbFPS1和HbFPS2蛋白的三維結(jié)構(gòu)。同源模建的HbFPS1蛋白和HbFPS2蛋白與雙底物分子IPP和DMAPP或雙底物分子IPP和GPP以及酶輔因子鎂離子分別對(duì)接到相應(yīng)的活性空間域中進(jìn)行分析對(duì)比。采用ProtScale軟件分析蛋白的親疏水性。

1.4 原核表達(dá)與純化

參考先前描述的方法(鄧小敏等，2017；2018a)在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達(dá)橡膠樹(shù)來(lái)源的HbFPS1基因、HbFPS2基因和HbFPS3基因。把經(jīng)鑒定含有HbFPS1基因、HbFPS2基因和HbFPS3基因的重組質(zhì)粒pET28-HbFPS1、pET28-HbFPS2和pET28-HbFPS3分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，將陽(yáng)性菌接種到30 mL LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)中，37 ℃，220 r·min-1培養(yǎng)過(guò)夜，再次接種到新鮮的100 mL LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)，待OD600值約為0.6后，加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度約0.5 mmol·L-1。16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜。菌液經(jīng)8 000 r·min-1離心2 min 后收集菌體。使用磷酸緩沖液重懸再經(jīng)低溫超聲破碎，12 000 r·min-1離心20 min，收集上清液。經(jīng)過(guò)Ni+柱純化目標(biāo)蛋白。通過(guò)SDS-PAGE技術(shù)分析HbFPS1-His、HbFPS2-His和HbFPS3-His重組蛋白的表達(dá)。純化蛋白的濃度按照Nanodrop測(cè)定。

1.5 蛋白質(zhì)膠內(nèi)水解與質(zhì)譜鑒定

參考代龍軍等(2012)的方法進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)膠塊脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)胰蛋白酶水解、MALDI/TOFTOF分子量校準(zhǔn)和測(cè)試樣品準(zhǔn)備及肽段比對(duì)分析。

1.6 體外酶活性檢測(cè)

橡膠樹(shù)法尼基焦磷酸酶活性檢測(cè)參考體外橡膠合成反應(yīng)體系的方法(Dengetal.,2018)。純化的HbFPS1蛋白和HbFPS2蛋白按照50 μg的含量加入反應(yīng)體系中，分別添加5 μg·mL-1的反應(yīng)底物IPP、DMAPP和GPP進(jìn)行反應(yīng)。隨后添加1 U去磷酸化酶(NEB)37 ℃反應(yīng)2 h，經(jīng)提取液萃取后進(jìn)行GC色譜分析。

1.7 體外橡膠合成效率的檢測(cè)

體外橡膠合成效率參考Deng等(2018)的方法進(jìn)行。400 μL反應(yīng)體系包含10 μmol·L-1MgCl2，10 μmol·L-1DTT，5 μmol·L-1ATP，0.736 μmol·L-113C-MVA (mevalonolactone-2-13C)(Sigma Aldrich,Lot# MBBB5201 V)，100 mmol·L-1PBS 緩沖液。在反應(yīng)體系中試驗(yàn)組分別添加50、100、200 μg HbFPS1蛋白或HbFPS2蛋白，對(duì)照組添加對(duì)應(yīng)體積的蛋白純化液，最后添加25 μL經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾的新鮮膠乳，將反應(yīng)體系置于30 ℃，70 r·min-1反應(yīng)8 h。然后添加400 μL的飽和NaCl溶液并充分混勻，接著加入800 μL提取液(甲苯/正己烷，1∶1體積比)提取橡膠組分，16 000×g離心30 min，將上層有機(jī)相收集并用等體積正丁醇混合后過(guò)夜析出橡膠組分。再次經(jīng)16 000×g離心30 min后棄掉有機(jī)相層，剩下的橡膠層干燥后制備分析樣品。稱(chēng)取約0.3 mg橡膠樣品包埋至薄層錫紙(Elemental Microanalysis,6 mm × 4 mm,BN261080)中。用穩(wěn)定同位素儀(GV Instruments,IsoPrime JB312)和元素分析儀(Thermo,FLASH EA1112 Series)檢測(cè)樣品中的13C/12C 比例。結(jié)果按照原子百分比形式表示，其值等于橡膠樣品中的13C含量相對(duì)于總C(13C+12C)的含量百分比。所有的分析進(jìn)行2次生物學(xué)重復(fù)。t-test分析添加HbFPS1重組蛋白或HbFPS2重組蛋白的試驗(yàn)組與其對(duì)應(yīng)的對(duì)照組之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹(shù)法尼基焦磷酸合成酶的序列分析

膠乳中高表達(dá)的HbFPS1和HbFPS2基因分別編碼的HbFPS1蛋白和HbFPS2蛋白具有95%的氨基酸序列相似性(圖1)，說(shuō)明HbFPS1和HbFPS2為基因組上的2個(gè)同源冗余基因，可能是進(jìn)化后期發(fā)生的基因拷貝事件。而膠乳中低表達(dá)的HbFPS3基因編碼的HbFPS3蛋白，其氨基酸序列與HbFPS1和HbFPS2蛋白僅存84%的相似性(圖1)，說(shuō)明HbFPS3蛋白與HbFPS1和HbFPS2蛋白的差異相對(duì)較大，這些差異的氨基酸有可能對(duì)蛋白三維結(jié)構(gòu)和性質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。HbFPS1、HbFPS2和HbFPS3含有已報(bào)道的法尼基焦磷酸合成酶的2個(gè)特征性結(jié)構(gòu)域，分別是“DDIMD”和“DDYXD”，為活性中心特異結(jié)合鎂離子與底物的功能區(qū)。

圖1 橡膠樹(shù)FPS蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig.1 The amino acids alignment among rubber tree FPS proteins 矩形方框代表保守結(jié)構(gòu)域。The squares represent the conserved motifs.

2.2 橡膠樹(shù)HbFPS1和HbFPS2蛋白表達(dá)與純化

雖然HbFPS1、HbFPS2和HbFPS3蛋白含有特征性的法尼基焦磷酸合成酶結(jié)構(gòu)域和類(lèi)似的空間結(jié)構(gòu)，但仍然缺乏實(shí)證的酶學(xué)證據(jù)。而獲得較純的蛋白進(jìn)行體外酶學(xué)催化是證明該類(lèi)蛋白酶學(xué)性質(zhì)的有效方法。為此目的構(gòu)建了HbFPS1、HbFPS2和HbFPS3基因的原核表達(dá)載體，小量表達(dá)發(fā)現(xiàn)僅橡膠樹(shù)膠乳高表達(dá)的2個(gè)同源基因HbFPS1和HbFPS2能夠在大腸桿菌中表達(dá)與正確折疊，在上清中可見(jiàn)。而HbFPS3蛋白(pI=5.79,MW=40.27 kDa)表達(dá)形成大量包涵體蛋白，上清中未見(jiàn)明顯的條帶(圖2A)。蛋白質(zhì)親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)蛋白的N末端50個(gè)氨基酸內(nèi)的親疏性差異十分明顯，其中HbFPS3蛋白的N50疏水性較強(qiáng)，而HbFPS1和HbFPS2蛋白的N50親水性較強(qiáng)(圖2B、C、D)，這種蛋白N端的親疏水性的差異可能與HbFPS3蛋白在包涵體表達(dá)，而HbFPS1和HbFPS2蛋白在上清中的可溶性表達(dá)有關(guān)。重點(diǎn)研究可溶性表達(dá)的HbFPS1蛋白(pI=5.75,MW=39.42 kDa)和HbFPS2蛋白(pI=5.27,MW=39.56 kDa)的純化與酶學(xué)性質(zhì)。經(jīng)常規(guī)鎳柱純化后獲得了較純的HbFPS1和HbFPS2蛋白(圖3A)。為確證該純化蛋白是否是橡膠樹(shù)HbFPS1和HbFPS2，對(duì)該純化蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定與分析，結(jié)果表明純化的重組蛋白的特征肽段分別與橡膠樹(shù)HbFPS1和HbFPS2序列一致(圖3B、C、D)，表明成功獲得正確的重組蛋白HbFPS1-His和HbFPS2-His。

圖2 橡膠樹(shù)HbFPS3蛋白的表達(dá)與3個(gè)FPS蛋白的親疏水性分析Fig.2 The recombinant prokaryotic expression of HbFPS3 and the hydrophilicity or hydrophobicity analysis of three rubber tree FPS proteinsA:HbFPS3蛋白主要在包涵體中表達(dá)(從左至右第3泳道)，在上清液中未見(jiàn)明顯表達(dá)(從左至右第2泳道)；B-D:分別為HbFPS3、HbFPS1、HbFPS2蛋白的親疏水性分析。A:The HbFPS3 was mainly expressed in the inclusion body (the third lane from left to right),and no obvious expression in the supernatant (the second lane from left to right);B-D:The hydrophilicity or hydrophobicity analysis of HbFPS3 protein (B),HbFPS1 protein (C)and HbFPS2 protein (D),respectively.

圖3 橡膠樹(shù)HbFPS1和HbFPS2蛋白的表達(dá)與質(zhì)譜鑒定Fig.3 The expression and identification of rubber tree HbFPS1 and HbFPS2 proteinsA:HbFPS1和HbFPS2蛋白的SDS-PAGE分析；B:HbFPS1與HbFPS2蛋白N末端氨基酸序列比對(duì)；C:HbFPS1蛋白經(jīng)酶解消化后得到的差異肽段的質(zhì)譜檢測(cè)圖；D:HbFPS2蛋白經(jīng)酶解消化后得到的差異肽段的質(zhì)譜檢測(cè)圖。A:SDS-PAGE analysis of the HbFPS1 and HbFPS2;B:The different amino acids locate in the N-terminals between HbFPS1 and HbFPS2;C：The MS detection of the differential peptide of HbFPS1 obtained from enzymatic digestion;D:The MS detection of the differential peptide of HbFPS2 obtained from enzymatic digestion.

2.3 橡膠樹(shù)HbFPS1和HbFPS2酶學(xué)與結(jié)構(gòu)分析

在含50 μg重組蛋白的體外反應(yīng)體系中，通過(guò)添加底物IPP和GPP反應(yīng)，經(jīng)GC色譜檢測(cè)并與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，發(fā)現(xiàn)添加HbFPS1-His重組蛋白和HbFPS2-His重組蛋白的反應(yīng)中檢測(cè)到法尼基焦磷酸脫磷酸化產(chǎn)物法尼醇的產(chǎn)生(圖4A、B)，而僅含有反應(yīng)底物的對(duì)照組沒(méi)有檢測(cè)到該產(chǎn)物(圖4B)，這從酶學(xué)層面證明了HbFPS1-His重組蛋白和HbFPS2-His重組蛋白確實(shí)能夠催化IPP和GPP的聚合反應(yīng)，HbFPS1和HbFPS2確實(shí)為橡膠樹(shù)乳管細(xì)胞中活性的法尼基焦磷酸合成酶。特別的是，在重組蛋白的體外酶促反應(yīng)體系中還發(fā)現(xiàn)HbFPS1-His重組蛋白和HbFPS2-His重組蛋白能夠催化IPP與DMAPP直接合成FPP(圖4B)，說(shuō)明在同一酶內(nèi)IPP和DMAPP合成的GPP僅作為中間產(chǎn)物繼續(xù)與IPP進(jìn)行聚合反應(yīng)生成FPP。為了明晰該酶的催化機(jī)制，采用同源模建的方法構(gòu)建了HbFPS1和HbFPS2的蛋白結(jié)構(gòu)模型，發(fā)現(xiàn)HbFPS1和HbFPS2蛋白的活性中心確實(shí)能夠容納并實(shí)現(xiàn)IPP和DMAPP分子的催化合成(圖5A、B)，所生成的GPP能夠駐留在其活性中心繼續(xù)與IPP進(jìn)行接合生成最終產(chǎn)物FPP(圖5C、D)。

圖4 橡膠樹(shù)HbFPS1重組蛋白和HbFPS2重組蛋白的活性檢測(cè)Fig.4 The catalytic reaction assay of rubber tree HbFPS1 and HbFPS2 recombinant proteins under different conditionsA:FPP聚合反應(yīng)歷程和其脫磷酸化產(chǎn)物；B:HbFPS1重組蛋白和HbFPS2重組蛋白的體外催化反應(yīng)檢測(cè)圖，其中不同顏色對(duì)應(yīng)的Peak 1為法尼醇。A:The generation of FPP and its dephosphorylated derivative are realized by consecutive enzymatic reactions;B:The GC results exhibited the enzymatic products of HbFPS1 and HbFPS2 as well as the negative controls and standard positive control,all the Peak 1 in different colors represent the farnesol.

圖5 HbFPS1蛋白和HbFPS2蛋白與不同對(duì)底物結(jié)合的同源模建分析Fig.5 The homologous modelling analysis of HbFPS1 and HbFPS2 proteins with different pairs of substrates

2.4 法尼基焦磷酸合成酶對(duì)橡膠合成效率的影響

既然酶學(xué)研究證實(shí)橡膠樹(shù)HbFPS1和HbFPS2是能夠催化FPP生成的法尼基焦磷酸合成酶，那么該酶是否或在多大程度上影響了天然橡膠合成將是評(píng)判HbFPS1和HbFPS2在天然橡膠生物合成中能否發(fā)揮調(diào)控作用的前提依據(jù)。而利用基于橡膠樹(shù)膠乳中天然的小橡膠粒子的體外橡膠合成效率體系可以評(píng)價(jià)HbFPS1和HbFPS2在天然橡膠合成中的調(diào)控作用。在該系統(tǒng)中僅通過(guò)添加IPP和DMAPP合成的前體13C-MVA甲羥戊酸和體外重組酶反應(yīng)后，通過(guò)提取天然橡膠并檢測(cè)該天然橡膠中13C的含量變化來(lái)評(píng)價(jià)其影響天然橡膠合成效率的能力。結(jié)果(圖6)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，添加不同量的HbFPS1和HbFPS2重組酶能夠不同程度地提升體外橡膠合成效率，而且在100 μg含量下的體外橡膠合成效率最高，這表明橡膠樹(shù)HbFPS1和HbFPS2蛋白確實(shí)參與并促進(jìn)了天然橡膠生物合成過(guò)程，并且其含量的高低與天然橡膠合成效率相關(guān)，但是較優(yōu)的天然橡膠合成效率可能依賴(lài)于酶量與橡膠粒子含量處于比較合適的比例。

圖6 不同添加量的橡膠樹(shù)HbFPS1和HbFPS2蛋白對(duì)體外橡膠合成效率的影響Fig.6 The effects of different amounts of HbFPS1 and HbFPS2 proteins supplementation on the efficiency of in vitro rubber synthesis“*”和“**”分別表示HbFPS1重組蛋白或HbFPS2重組蛋白添加組與對(duì)照組的差異顯著(P <0.05)及差異極顯著(P <0.01)。The single asterisk (*)represents the significant difference between the HbFPS1 recombinant protein or HbFPS2 recombinant protein addition treatment and the controls (P <0.05),and the double asterisks (**)represent the extremely significant difference between HbFPS1 or HbFPS2 recombinant protein addition treatment and the controls (P <0.01).

3 討論

產(chǎn)膠植物天然橡膠生物合成是典型的植物類(lèi)異戊二烯代謝，與其他非產(chǎn)膠植物相比，都共有生成IPP和DMAPP基本合成原料的MVA途徑和MEP途徑，但是產(chǎn)膠植物形成了特化的乳管組織結(jié)構(gòu)與具備天然橡膠合成的功能化橡膠粒子。解析天然橡膠生物合成與調(diào)控機(jī)制是調(diào)控橡膠樹(shù)產(chǎn)量和質(zhì)量性狀的理論基礎(chǔ)，天然橡膠生物合成酶的功能驗(yàn)證與評(píng)價(jià)及其組織形式是解析該機(jī)制的基本前提。通過(guò)正反向遺傳學(xué)技術(shù)已經(jīng)證明該合成途徑中的HMGS、HMGR、FPS和CPT等蛋白能影響天然橡膠的合成。譬如過(guò)表達(dá)橡膠草FPS基因促進(jìn)了根中天然橡膠的含量提升(曹新文等，2016)；而下調(diào)橡膠草CPT基因的表達(dá)水平減少了天然橡膠的含量(Postetal.,2012)。過(guò)表達(dá)橡膠樹(shù)HbHMGS2基因與過(guò)表達(dá)HbHMGR1基因皆促進(jìn)了天然橡膠的合成(Jayashreeetal.,2018；Yuetal.,2020)。盡管在遺傳學(xué)層面上，從“質(zhì)”的角度證明了這些在代謝途徑的不同節(jié)點(diǎn)上的基因有助于天然橡膠的生物合成，但是未能提供這些基因編碼的蛋白是否具備相應(yīng)節(jié)點(diǎn)上酶催化的功能及性質(zhì)，而且也未能夠從“量”的角度去探究這些蛋白與天然橡膠合成的關(guān)系，因?yàn)橥ㄟ^(guò)基因的過(guò)表達(dá)來(lái)研究基因功能屬于定性的范疇，難以給出相對(duì)應(yīng)的蛋白含量變化信息。

本研究從“質(zhì)”和“量”的角度嘗試研究橡膠合成關(guān)鍵酶的酶學(xué)功能及其含量的變化對(duì)天然橡膠合成的影響，并獲得了新的發(fā)現(xiàn)。法尼基焦磷酸(FPP)合成酶(FPS)合成天然橡膠合成的起始物FPP，在某種程度上起著天然橡膠合成的開(kāi)關(guān)作用，因此法尼基焦磷酸合成酶的功能十分重要。本研究從“質(zhì)”的角度證明了HbFPS1和HbFPS2蛋白確實(shí)具有利用IPP和GPP底物合成FPP的酶學(xué)功能。一般認(rèn)為香葉基焦磷酸合成酶(GPPS)催化IPP和DMAPP聚合生成的GPP與一分子IPP作為雙底物被法尼基焦磷酸合成酶(FPS)催化生成FPP，HbFPS1和HbFPS2蛋白對(duì)IPP和GPP的這一催化結(jié)果與該一般認(rèn)識(shí)基本相符。與此同時(shí)本研究又發(fā)現(xiàn)HbFPS1和HbFPS2重組蛋白具備直接催化IPP和DMAPP生成FPP的能力(圖4B)，這一發(fā)現(xiàn)拓展了對(duì)橡膠樹(shù)FPS酶的功能認(rèn)知，GPP很可能是FPS酶在催化一分子IPP和一分子DMAPP聚合過(guò)程中的中間產(chǎn)物，隨后繼續(xù)結(jié)合一分子IPP生成終產(chǎn)物FPP。這一發(fā)現(xiàn)將有助于重新理解乳管細(xì)胞中天然橡膠生物合成的精細(xì)生化過(guò)程及其調(diào)控機(jī)制。雖然橡膠樹(shù)GPPS基因可能也與天然橡膠合成相關(guān)(鄧小敏等，2018b)，但是GPPS和FPS蛋白在乳管細(xì)胞中并存的生物學(xué)意義還有待進(jìn)一步闡明。而且GPP和FPP也是其他萜類(lèi)物質(zhì)合成的底物，而乳管細(xì)胞中GPP和FPP等底物在天然橡膠合成與萜類(lèi)物質(zhì)合成中的分配機(jī)制還不清楚。相比經(jīng)過(guò)GPPS合成GPP后作為底物供給FPS酶催化，本研究更傾向于認(rèn)為橡膠樹(shù)HbFPS1和HbFPS2酶能直接原位聚合DMAPP和IPP生成天然橡膠合成起始物FPP，這種特性能夠明顯地加快天然橡膠合成速率，提升其合成效率(圖5B、D，圖6)，而不同F(xiàn)PS蛋白的亞細(xì)胞器分布可能與上述分配機(jī)制有關(guān)(Wangetal.,2019)。本研究從“量”的角度，發(fā)現(xiàn)在底物13C-MVA和橡膠粒子等含量一定的條件下，隨著FPS酶含量的增加，反應(yīng)體系的橡膠合成效率也增加直到達(dá)到檢測(cè)峰值，蛋白含量的繼續(xù)增加反而有所下降，這說(shuō)明在底物13C-MVA和橡膠粒子等含量一定的條件下，酶與底物在較為合適的配比下才能達(dá)到較優(yōu)的反應(yīng)效率，才能促使該體系中目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成。

綜上所述，基于目前的研究結(jié)果，推測(cè)從“質(zhì)”和“量”的角度調(diào)控橡膠樹(shù)FPS酶的性質(zhì)與含量將有助于提升橡膠樹(shù)天然橡膠的合成能力。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，后續(xù)將從這2個(gè)角度入手利用本研究建立的基于天然橡膠粒子的體外蛋白功能研究平臺(tái)，深入開(kāi)展天然橡膠生物合成途徑中包括FPS和CPT等在內(nèi)的關(guān)鍵酶酶學(xué)功能與活性調(diào)節(jié)機(jī)制解析。通過(guò)驗(yàn)證這一假設(shè)可為橡膠樹(shù)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)新品種選育提供新穎的思路和方法。

4 結(jié)論

法尼基焦磷酸(FPP)合成酶(FPS)是天然橡膠合成代謝途徑中合成起始底物FPP的關(guān)鍵酶。本研究證明了橡膠樹(shù)膠乳中預(yù)測(cè)的2個(gè)高表達(dá)的同源法尼基焦磷酸合成酶HbFPS1和HbFPS2不僅能夠利用IPP和GPP為底物合成FPP，而且能夠直接聚合IPP和DMAPP生成FPP，拓展了對(duì)橡膠樹(shù)FPS酶催化機(jī)理的認(rèn)知。本研究建立了基于天然橡膠粒子的體外蛋白功能研究平臺(tái)，并證明HbFPS1和HbFPS2酶在一定的含量下能夠更好地提升天然橡膠合成效率。通過(guò)調(diào)控橡膠樹(shù)FPS酶的性質(zhì)和含量來(lái)調(diào)控天然橡膠的合成，這為橡膠樹(shù)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種的選育提供了新的思路和方法。