何詠怡，古汶玉，湯敏兒，鄧常繼，鐘國才，陳 威*

（廣東省糧食科學(xué)研究所,廣州 510000）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol）又稱為嘔吐毒素（Vomitoxin），是典型的B型單端孢霉烯族毒素，攝入其高污染食物會引起急性胃腸道癥狀，如腹瀉、拒食和嘔吐，長期接觸嘔吐毒素還可導(dǎo)致厭食癥、生長遲緩和免疫功能受抑制等[1-3]。嘔吐毒素是谷物及其制品最易感染的天然真菌毒素之一，在小麥、玉米、大麥、黑麥和燕麥等谷物中均有檢出[2]，如2018年一項(xiàng)涵蓋全球77個國家共13 629個樣本的調(diào)查顯示亞洲地區(qū)樣品的嘔吐毒素污染率達(dá)到80%[4]。因此，監(jiān)測食品和飼料中的嘔吐毒素含量，對保障消費(fèi)者健康及減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

目前嘔吐毒素常用檢測方法包括：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法和膠體金快速檢測等[2，5]。其中膠體金快速檢測是一種將膠體金顆粒作為示蹤物，兼?zhèn)涿庖叻治雠c色譜層析分離優(yōu)點(diǎn)的檢測技術(shù)[6,7]，具有制備成本低、操作簡單、結(jié)果肉眼可判斷及無需額外專業(yè)人員和儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣泛應(yīng)用于檢測食品中的嘔吐毒素[8-10]。

GB 2761-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中規(guī)定食品中嘔吐毒素限量為1 000 μg/kg，《糧食質(zhì)量安全監(jiān)管辦法》明確規(guī)定真菌毒素是糧食收購和儲存的質(zhì)量安全指標(biāo)之一。但由于我國是產(chǎn)糧大國，2020年我國全年小麥和玉米產(chǎn)量分別達(dá)到13 425萬t和26 067萬t[11]，在具體實(shí)施的過程中，檢驗(yàn)人員檢測任務(wù)重時間緊，因此選擇合適的糧食嘔吐毒素現(xiàn)場快速篩查手段對于提高糧食安全監(jiān)督和收購效率具有實(shí)際意義。據(jù)此，本文從靈敏度、特異性、重復(fù)性和一致性的方面對嘔吐毒素膠體金現(xiàn)場快速檢測試劑盒性能進(jìn)行評價(jià)，以期為嘔吐毒素膠體金快速檢測產(chǎn)品的質(zhì)量和檢測可靠性評價(jià)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本試驗(yàn)選取2019年收獲小麥和玉米作為試樣。嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品（編號：GBW(E)100304）、玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品（編號：GBW(E)100301）、黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品（編號：GBW(E)100302）和赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品（編號：GBW(E)100303）購于國家糧食局科學(xué)研究院。試驗(yàn)用水為超純水，甲醇和乙腈為色譜純（德國默克）。膠體金嘔吐毒素快速檢測盒生產(chǎn)批號為S00J018。

1.2 儀器與設(shè)備

伯利恒BLH-560K高速全自動錘式旋風(fēng)磨；梅特勒-托利多 AL204-IC天平（d=0.0001 g）；艾本森MixPlus渦旋震蕩儀；Sigma 2-16PX離心機(jī)；安捷倫1260型高效液相色譜儀（配備紫外檢測器）。

1.3 檢測方法

1.3.1 嘔吐毒素膠體金快速檢測

樣品處理：稱取1.00±0.05 g粉碎樣品于10 mL離心管中，加入5.0 mL嘔吐毒素提取液，渦旋震蕩 3 min，4 000 r/min離心 3 min， 取 50 μL上清液于2 mL離心管中，加入1000μL樣本稀釋液，混勻。

樣品檢測：移取100 μL待測液至加樣孔中，加樣5～8 min后可目測判斷結(jié)果。若檢測線（T線）顯色比質(zhì)控線（C線）深或一樣深，表示樣本中不含嘔吐毒素或其濃度低于檢測限（陰性）；若T線比C線淺或無顯色，表示樣本中嘔吐毒素濃度高于檢測限（陽性）；若C線不顯色則表明存在不正確操作或檢測卡變質(zhì)，檢測結(jié)果無效。

1.3.2 高效液相色譜法檢測玉米嘔吐毒素含量

依據(jù)GB5009.111-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》的第二法驗(yàn)證小麥和玉米樣品嘔吐毒素含量。液相色譜條件：流動相為水-甲醇-乙腈（體積比為70:15:15），流速為 0.8 mL/min，C18 柱（25 cm×4.6 mm×5 μm），柱溫 35 ℃，進(jìn)樣體積為 50 μL，檢測波長為218 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度

使用膠體金快速檢測試劑盒檢測含量相當(dāng)于0、200、500、1 000、2 000 和 5 000 μg/kg 的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果如圖1，隨著嘔吐毒素濃度增加，T線顏色變淺。對于含量大于或等于食品中嘔吐毒素限量（1 000 μg/kg）標(biāo)準(zhǔn)品T線顏色明顯淺于C線，呈陽性；對于含量相當(dāng)于5 000 μg/kg濃度的標(biāo)準(zhǔn)品T線依然有顯色，說明該試劑盒檢測嘔吐毒素含量極限大于5 000 μg/kg，能夠滿足市面檢測要求。

圖1 膠體金測試卡的靈敏度

2.2 特異性

抗體能與目標(biāo)物結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，造成結(jié)果假陽性率高[12]，使得膠體金測試卡特異性差。小麥和玉米易受多種真菌毒素污染[13]，因此試驗(yàn)利用試劑盒分別檢測空白對照樣品及濃度為100 ng/mL的黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品，以考察測試卡的特異性，結(jié)果如圖2。檢測黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品的T線顏色與空白對照相近（陰性），說明該測試卡與黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A無交叉反應(yīng)，該嘔吐毒素膠體金快速檢測試劑卡檢測受非目標(biāo)真菌毒素干擾較少，特異性強(qiáng)。

圖2 膠體金測試卡的特異性

2.3 重復(fù)性

為評價(jià)試劑盒重復(fù)性，利用試劑盒分別檢測含量為 500 μg/kg的玉米樣品和 2 400 μg/kg的小麥樣品，每個樣品重復(fù)6次，結(jié)果如圖3。檢測500 μg/kg的玉米樣品的T線顏色深于C線或相近，檢測結(jié)果均為陰性；檢測2 200 μg/kg的小麥樣品檢測T線顏色均明顯淺于C線，檢測結(jié)果均為陽性；總體誤判率為0%，該試劑盒重復(fù)性符合技術(shù)要求。

圖3 膠體金試劑盒的重復(fù)性

2.4 與仲裁方法一致性

利用膠體金快速檢測試劑盒和免疫親和層析凈化高效液相色譜（HPLC）法（參比方法）分別檢測16個小麥和玉米樣品的嘔吐毒素含量，并根據(jù)《食品快速檢測方法評價(jià)技術(shù)規(guī)范》計(jì)算膠體金試劑盒檢測結(jié)果的顯著性差異（x2）、假陰性率、假陽性率和相對準(zhǔn)確率（表1）。膠體金試劑盒對小麥和玉米樣品檢測結(jié)果的顯著性差異（x2）分別為 0.5 和 0（x2＜3.84），說明兩種方法的陽性確證比率在95%置信區(qū)間內(nèi)沒有顯著性差異。膠體金試劑盒檢測小麥和玉米樣品的假陰性率均為0%；對小麥和玉米樣品假陽性率分別為13%和6%；總體誤判率小于15%，符合LS/T 6110-2014《糧油檢測 谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定 膠體金快速測試卡法》的準(zhǔn)確性要求。利用膠體金法顏色的變化難以識別小范圍內(nèi)抗原濃度的變化[9]，且檢驗(yàn)人員間對顏色的敏感程度不同，是導(dǎo)致膠體金法出現(xiàn)假陽性檢測結(jié)果的重要原因。在實(shí)際操作中，對難以判別的樣品可借助讀數(shù)儀判別、多次重復(fù)檢測或利用免疫親和層析凈化高效液相色譜法復(fù)檢，以減少誤判，提高檢測準(zhǔn)確性。

表1 膠體金試劑盒和HPLC對小麥和玉米樣品的檢測結(jié)果

3 結(jié)論

利用嘔吐毒素膠體金快速檢測試劑盒能在短時間（30 min）內(nèi)獲得15個以上樣品的較準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，檢測結(jié)果與參比方法一致性好，重復(fù)性佳，并且無需借助大型儀器。該方法可以有效縮短嘔吐毒素檢測時間，減輕檢測人員工作負(fù)擔(dān)，適合大批量樣品現(xiàn)場篩查，實(shí)現(xiàn)糧谷嘔吐毒素污染風(fēng)險(xiǎn)快速預(yù)警。