金 武，曹靜越，馬 騁，馬學(xué)艷，呂國(guó)華，聞海波1,,3，顧若波1,,3

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214081；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214128；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，中美淡水貝類種質(zhì)資源保護(hù)及利用國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214081；4.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

梨形環(huán)棱螺()是腹足綱(Gastropoda)田螺科(Viviparidae)環(huán)棱螺屬()中個(gè)體最大的種，該種分布廣、產(chǎn)量大、用途多，是青魚()、寬體金線蛭(Whitman)、中華絨螯蟹()和中華鱉()等水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物及部分水禽的餌料之一，同時(shí)也是廣大居民“菜籃子”的重要組成部分。以中華絨螯蟹需求為例，全國(guó)每年平均約需100～150萬(wàn)噸梨形環(huán)棱螺，但2019年全國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量?jī)H為9.289萬(wàn)噸，市場(chǎng)缺口巨大。對(duì)梨形環(huán)棱螺的研究集中在形態(tài)特征、生長(zhǎng)性狀遺傳參數(shù)、殼色、水體修復(fù)等方面，對(duì)梨形環(huán)棱螺種群遺傳多樣性和遺傳分化的研究仍較少。

微衛(wèi)星(microsatellite)即短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats，STRs)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)，它廣泛應(yīng)用在三角帆蚌()、釘螺(Gredler)、橄欖蟶蚌()等淡水貝類種群遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)方面的研究。與傳統(tǒng)分子標(biāo)記相比，它具有分辨率高，可以檢測(cè)共顯性遺傳的顯著優(yōu)點(diǎn)。已有對(duì)梨形環(huán)棱螺種群遺傳多樣性的研究集中于少數(shù)幾個(gè)群體，為了進(jìn)一步對(duì)更大范圍內(nèi)梨形環(huán)棱螺遺傳多樣性進(jìn)行系統(tǒng)背景研究，采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記分析目前我國(guó)梨形環(huán)棱螺群體的遺傳資源多態(tài)性并篩選最適合養(yǎng)殖和育種的群體，從而為資源實(shí)現(xiàn)有序合理開(kāi)發(fā)、開(kāi)展苗種規(guī)?；嘤峁┲?。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2021年3-4月，梨形環(huán)棱螺樣本采集于山東微山湖(SDWS)、江蘇高郵湖(JSTZ)、上海明珠湖(SHCM)、浙江淳安(ZJCA)、安徽黃陂湖(AHLJ)、湖北長(zhǎng)湖(HBQJ)、江西仙女湖(JXYC)、湖南耒水(HNHY)、貴州夜郎湖(GZAS)、廣西千畝湖(GXLZ)、廣東榕江(GDJY)11個(gè)不同水域，每個(gè)群體30個(gè)個(gè)體。根據(jù)采集時(shí)間不同，在貝類養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)至所有群體采集完成。具體采集地點(diǎn)如圖1所示。

圖1 梨形環(huán)棱螺采樣點(diǎn)分布圖

1.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增與測(cè)序

剪取約50 mg新鮮腹足肌肉，利用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司)提取DNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)總體積為10 μL：模板1.5 μL，Buffer 1 μL，DNA聚合酶0.3 μL，dNTP 0.8 μL，ddHO 5.4 μL，引物1 μL。引物序列來(lái)自文獻(xiàn)[20]，上游引物5′端進(jìn)行熒光修飾，詳細(xì)信息如表1所示。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，退火90 s(退火溫度見(jiàn)表1)，72 ℃延伸60 s，共40循環(huán)，72 ℃補(bǔ)齊延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將目的片段送上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司，用ABI Prism 3730 XI測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，采用Genemapper V3.0分析各個(gè)位點(diǎn)的基因型。

表1 梨形環(huán)棱螺7對(duì)微衛(wèi)星引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Popgene32軟件分析各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在11個(gè)地理種群的等位基因數(shù)()、有效等位基因數(shù)()、觀測(cè)雜合度()、期望雜合度()、Shannon信息指數(shù)()，并計(jì)算群體間的Nei′s遺傳距離。Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)()按照以下公式計(jì)算：

=(-)/

用Cervus 3.2 軟件計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量()?；谌后w間的Nei′s遺傳距離用Mega X軟件繪制NJ聚類圖。用Arlequin3.1軟件計(jì)算兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)()，采用分子方差分析(AMOVA)計(jì)算群體的遺傳結(jié)構(gòu)，通過(guò)1 000次模擬重復(fù)抽樣檢驗(yàn)群體間的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性

7對(duì)微衛(wèi)星引物在11個(gè)群體中檢測(cè)到96個(gè)等位基因(表2)，11個(gè)群體的介于8～20，為5.882～9.783，平均和為13.714和6.809。其中ATG146位點(diǎn)最多(20個(gè))，CAG41最少(8個(gè))。Shannon信息指數(shù)介于1.895～2.614。7個(gè)位點(diǎn)的介于0.4～0.8，介于0.844～0.913，7個(gè)位點(diǎn)全部偏離Hardy-weinberg平衡(<0)。多態(tài)信息含量為0.848～0.980，平均是0.915。7個(gè)位點(diǎn)均為高度多態(tài)位點(diǎn)(>0.5)。

表2 梨形環(huán)棱螺7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多態(tài)性

2.2 梨形環(huán)棱螺11個(gè)群體的遺傳多樣性

梨形環(huán)棱螺11個(gè)群體的遺傳多樣性見(jiàn)表3。11個(gè)群體的平均為9.286～20.429，為4.766～11.175。為1.723～2.606。平均和平均分別為0.510～0.535和0.772～0.905。從看，11個(gè)群體的均較高(>0.5)，遺傳多樣性均較豐富。

表3 梨形環(huán)棱螺11個(gè)群體的遺傳多樣性

2.3 遺傳分化

梨形環(huán)棱螺11個(gè)群體間的Nei′s遺傳相似度和遺傳距離見(jiàn)表4。11個(gè)群體間的遺傳距離介于0.143～0.937，Nei′s遺傳相似度介于0.392～0.867之間。HBQJ和JXYC之間遺傳距離最短，GZAS和HNHY之間的遺傳距離最長(zhǎng)?；谌后w間Nei′s遺傳距離的NJ聚類樹(shù)結(jié)果如圖2所示。AMOVA分析結(jié)果顯示(表5)，11個(gè)群體內(nèi)的遺傳變異占總體變異的94.84%。群體間的遺傳變異占5.16%，11個(gè)群體的遺傳分化指數(shù)為0.052，說(shuō)明這11個(gè)群體之間遺傳分化較小，且變異的來(lái)源主要是各個(gè)群體內(nèi)的個(gè)體之間。

表4 梨形環(huán)棱螺11個(gè)群體的遺傳距離(下三角)和群體間遺傳相似度(上三角)

表5 梨形環(huán)棱螺11個(gè)群體的AMOVA分析

圖2 基于Nei′s遺傳距離構(gòu)建的梨形環(huán)棱螺11個(gè)群體的NJ聚類樹(shù)

3 討論

3.1 梨形環(huán)棱螺的遺傳多樣性

山東微山湖為南四湖水域的組成之一，本研究中發(fā)現(xiàn)SDWS群體的7個(gè)位點(diǎn)的平均多態(tài)信息含量(=0.845)和文獻(xiàn)[19]中NS群體同樣7個(gè)位點(diǎn)的平均多態(tài)信息含量(=0.832)無(wú)顯著差異。對(duì)洞庭湖(DT)、鄱陽(yáng)湖(PY)、梁子湖(LZ)等8地的梨形環(huán)棱螺的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)平均遺傳多樣性在0.832～0.888之間，且各個(gè)種群內(nèi)部表現(xiàn)出明顯的遺傳變異，但是種群間的遺傳變異差別不大。此外，各個(gè)群體顯著偏離Hardy-weinberg平衡，這和本研究中11個(gè)地理種群的分析結(jié)論一致，且雜合體缺失和無(wú)效等位基因的存在是各個(gè)群體顯著偏離Hardy-weinberg平衡的原因。截至目前，對(duì)全國(guó)梨形環(huán)棱螺的19個(gè)群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，說(shuō)明梨形環(huán)棱螺種群雖然分布廣，但其遺傳多樣性仍處于較高水平，且不同地理種群之間的遺傳變異不大。長(zhǎng)江水系在很長(zhǎng)一段時(shí)間與兩岸湖泊相互連通，湖泊水系連通性好，以及長(zhǎng)江流域頻發(fā)的洪水可能促進(jìn)了長(zhǎng)江流域梨形環(huán)棱螺的擴(kuò)散和種群之間的交流。根據(jù)BOTSTEIN等提出的衡量基因變異程度高低的指標(biāo)可見(jiàn)，表明這7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均具有高度多態(tài)性，能確切提供遺傳信息，可以應(yīng)用于梨形環(huán)棱螺的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、種質(zhì)鑒定等分析。對(duì)銅銹環(huán)棱螺的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行種間擴(kuò)增也表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，為我國(guó)環(huán)棱螺遺傳多樣性研究提供依據(jù)。

遺傳分化指數(shù)是衡量群體間遺傳分化的重要指標(biāo)，群體間遺傳距離越小，遺傳分化程度越低，群體間的親緣關(guān)系越近。一般而言，當(dāng)<0.05時(shí)，群體間遺傳分化較??；0.05<<0.15時(shí)群體間有中等程度的遺傳分化；當(dāng)0.15<<0.25時(shí)，群體間遺傳分化程度較大；當(dāng)>0.25時(shí)，群體間遺傳分化顯著。以長(zhǎng)江為界，大尺度范圍內(nèi)對(duì)長(zhǎng)江以北、長(zhǎng)江流域、長(zhǎng)江以南三大區(qū)域進(jìn)行AMOVA分析也發(fā)現(xiàn)，種群間的遺傳變異比例很低，主要的遺傳變異(91.57%)來(lái)自群體內(nèi)，與本研究結(jié)論一致。

3.2 梨形環(huán)棱螺繁殖方式

螺類的一些種具有孤雌生殖的繁殖方式，這有利于種群快速擴(kuò)散，即使只有一個(gè)個(gè)體也能快速占領(lǐng)特定的生態(tài)位并形成種群，孤雌生殖的同一世代個(gè)體絕大多數(shù)都是雌性個(gè)體，少數(shù)是雄性個(gè)體。梨形環(huán)棱螺幼體能夠倒吸在水體表面下進(jìn)行漂浮，也能吸附在漂浮物上進(jìn)行水平移動(dòng)，從而促進(jìn)了梨形環(huán)棱螺的擴(kuò)散和交流，可能是不同地理種群遺傳多樣性得以保持的原因之一。盡管孤雌生殖會(huì)導(dǎo)致群體遺傳多樣性降低，但營(yíng)孤雌生殖的生物(包括部分螺類)進(jìn)化出了兩套生殖方式，即有性生殖和孤雌生殖并存，但有性生殖和孤雌生殖在何種條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)換的機(jī)制仍未能得到完全解釋，梨形環(huán)棱螺是否也存在類似系統(tǒng)以及這兩套系統(tǒng)在何種條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化仍需進(jìn)一步深入研究。