袁榮美， 丁 祥， 譚秀梅， 魯 艷， 周麗倩， 劉欣嵐， 侯怡鈴*

(1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009；2.四川省疾病預(yù)防控制中心，四川 成都 610044；3.西華師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637009；4.四川宜賓南溪經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)管理委員會(huì)，四川 南溪 644100)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究所用粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)野生型(WT)以及構(gòu)建的菌株均保存于四川省南充市西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株及編號(hào)Table 1 Experimental strains and numbers

1.1.2 培養(yǎng)基 ①YE5S培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 30，酵母提取物 5，腺嘌呤 0.225，尿嘧啶 0.225，賴氨酸 0.225，亮氨酸0.225，組氨酸0.225，瓊脂 20(固體培養(yǎng)基添加)；②YE5S-G418培養(yǎng)基：YE5S培養(yǎng)基+遺傳霉素G418 0.225 g；③EMM-N培養(yǎng)基(g/L)：EMM-N粉末 7.32，葡萄糖30，瓊脂20。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 葡萄糖、酵母提取物、遺傳霉素(G418)、脫水EMM-N培養(yǎng)基粉末、腺嘌呤、尿嘧啶、賴氨酸、亮氨酸、組氨酸、蝸牛酶。II級(jí)生物安全柜(MSC-AdvantageTM，賽默飛世爾科技公司)；恒溫培養(yǎng)箱(IGS60，賽默飛世爾科技公司)；激光共聚焦顯微鏡(TCS-SP8，萊卡)；熒光顯微鏡(DMI3000B，萊卡)；奧林巴斯顯微鏡(BX51，奧林巴斯(中國)有限公司)；恒溫?fù)u床(THZ-Q，上海百典儀器設(shè)備有限公司)；全自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-30FA，上海申安醫(yī)療器械廠)；冷凍離心機(jī)(5418R，上海艾本德國際貿(mào)易有限公司)；酶標(biāo)儀(Epoch，美國基因有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將活化后的野生型(wt)和sgf73Δ菌株接入YE5S培養(yǎng)液，置于25 ℃、200 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，OD595達(dá)到0.5～0.8時(shí)稀釋至0.1，每隔2 h測(cè)1次OD595，連續(xù)12 h，收集數(shù)據(jù)繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.2 產(chǎn)孢實(shí)驗(yàn) 將菌株HY 1003-1和HY 1003-2在YE5S固體培養(yǎng)基上活化后，分別刮取適量菌體，混和均勻后涂布在EMM-N固體培養(yǎng)基上，24 h后鏡檢，觀察產(chǎn)孢情況并收集數(shù)據(jù)。

1.2.3 熒光蛋白構(gòu)建 將菌株P(guān)T4436與HY 1003-1混合均勻，菌株P(guān)T3850與HY 1003-2混合均勻，涂布于EMM-N固體培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后觀察到有孢子產(chǎn)生，48 h后觀察到有大量孢子產(chǎn)生。將產(chǎn)生孢子的混合菌體懸浮于蝸牛酶工作液中，室溫靜置至子囊壁破裂，收集孢子。用無菌水洗滌孢子后稀釋孢子，取10 μL均勻涂布于YE5S-G418固體培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d。待長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落至YE5S-G418固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，菌株長(zhǎng)出后通過熒光顯微鏡鏡檢，選擇同時(shí)帶有綠色微管和紅色染色體的敲除株[19-20]。

1.2.4 活細(xì)胞成像 將菌株HY 1003-3和HY 1003-4經(jīng)YE5S固體培養(yǎng)基活化后接入YE5S液體培養(yǎng)基，待OD595達(dá)到0.5～0.8時(shí)收集菌體制片，用萊卡SP8激光共聚焦進(jìn)行延時(shí)掃描。參數(shù)為7個(gè)切面，間距1 μm，時(shí)間間隔60 s，總時(shí)間90 min。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 23.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(mean±SD)進(jìn)行單因素方差分析和t-test檢驗(yàn)。*P<0.05代表差異顯著，**P<0.01代表差異極顯著。使用Fiji圖像處理軟件對(duì)孢子圖像和活細(xì)胞成像的圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。孢子統(tǒng)計(jì)500個(gè)/次，生物學(xué)重復(fù)3次，共計(jì)1 500個(gè)，按照公式計(jì)算產(chǎn)孢率。采用GraphPad Prism 8和Office 2019版Excel做圖。

[7]http://blog.sina.com.cn/s/blog_64e e90340100zjtf.html.

式中：P為產(chǎn)孢率；B為不同孢子數(shù)量的子囊孢子個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 sgf73基因缺失對(duì)裂殖酵母生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

將野生型(wt)和sgf73Δ菌株在25 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)12 h，進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0～6 h野生型菌株與sgf73Δ菌株均處于緩慢生長(zhǎng)期，野生型菌株在0～6 h的OD595分別為(0.13±0.01)、(0.17±0.02)、(0.21±0.03)、(0.26±0.03)；sgf73Δ菌株0～6 h的OD595分別為(0.12±0.01)、(0.13±0.01)、(0.15±0.01)、(0.21±0.01)，其中在2～6 h內(nèi)sgf73Δ菌株與野生型菌株具有顯著差異(P<0.05)。6 h后，野生型菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在8～12 h的OD595分別為(0.36±0.03)、(0.50±0.03)、(0.66±0.03)；sgf73Δ菌株依然處于緩慢生長(zhǎng)期，8～12 h的OD595分別為(0.26±0.02)、(0.33±0.02)、(0.37±0.03)，均與野生型菌株有極顯著差異(P<0.01)(圖1A、1B)。以上生長(zhǎng)曲線結(jié)果提示，sgf73基因敲除極顯著地影響了裂殖酵母的生長(zhǎng)。

接合生殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1C～1E)，野生型(wt)菌株99.2%產(chǎn)生4個(gè)子囊孢子，(0.53±0.31)%產(chǎn)生3個(gè)子囊孢子，(0.27±0.31)%產(chǎn)生2個(gè)子囊孢子。與野生型(wt)菌株相比，sgf73Δ菌株(95.13±1.72)%產(chǎn)生4個(gè)子囊孢子，與野生型具有顯著差異(P<0.05)，(2.8±0.6)%產(chǎn)生3個(gè)子囊孢子，與野生型具有極顯著差異(P<0.01)，(0.47±0.46)%產(chǎn)生2個(gè)子囊孢子，(0.47±0.46)%產(chǎn)生5個(gè)子囊孢子，(0.6±0.53)%產(chǎn)生6個(gè)子囊孢子。值得注意的是，有(0.33±0.23)%的sgf73Δ菌株產(chǎn)生8個(gè)子囊孢子。

圖1 野生型(wt)和sgf73Δ菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)孢結(jié)果Fig.1 Results of growth and spores of wild type (wt) and sgf73Δ strainsA：野生型(wt)和sgf73Δ菌株生長(zhǎng)曲線圖； B：野生型(wt)和sgf73Δ菌株OD595值差異性分析圖；C：野生型(wt)子囊孢子形態(tài)圖；D：sgf73Δ菌株子囊孢子形態(tài)圖；E：野生型(wt)與sgf73Δ菌株子囊孢子數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(n=1 500，n是細(xì)胞數(shù))；*：P<0.05表示差異顯著，**：P<0.01表示差異極顯著A: Growth curves of wild type (wt) and sgf73Δ strains; B: The results of OD595 value between wild type (wt) and sgf73Δ strains; C: Ascospores morphology of wild type (wt); D: Ascospores morphology of sgf73Δ strains; E: Statistical analysis of spore number of wild type (wt) and sgf73Δ strains (n=1 500, n is the number of cells); *P<0.05 means a significant difference, and **P<0.01 means a very significant difference, respectively

2.2 sgf73基因敲除對(duì)裂殖酵母有絲分裂間期微管的影響

微管是真核細(xì)胞中普遍存在的一種纖維結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞骨架的重要組成部分，參與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)遞質(zhì)的傳遞，小泡以及色素的運(yùn)輸，對(duì)細(xì)胞器(如線粒體、核糖體)定位有一定的支持作用，對(duì)細(xì)胞生理形態(tài)的維持也具有重要作用[21]。以GFP-Atb2作為檢測(cè)信號(hào)，研究了野生型(wt)和sgf73Δ菌株微管在有絲分裂間期的數(shù)量、長(zhǎng)度和形態(tài)(圖2A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野生型菌株微管平均長(zhǎng)度為(6.19±2.00) μm，其中(11.67±2.89)%的野生型菌株在有絲分裂間期有3條微管，(70±5)%的菌株有4條微管，(18.33±2.89)%野生型菌株有5條微管。sgf73Δ菌株微管平均長(zhǎng)度為(6.26±2.27) μm(圖2B)，其中(43.33±10.41)%的sgf73Δ菌株有4條微管，與野生型菌株具有顯著差異(P<0.05)，(56.67±10.41)%的sgf73Δ菌株有5條微管，與野生型菌株具有極顯著差異(P<0.01)(圖2C)。

圖2 野生型(wt)和sgf73Δ菌株有絲分裂間期微管結(jié)果Fig.2 Results of microtubules in wild type (wt) and sgf73Δ strains at the mitotic interphaseA：野生型(wt)和sgf73Δ菌株微管形態(tài)；B：野生型和sgf73Δ菌株微管長(zhǎng)度(n=80，n是微管數(shù))；C：野生型和sgf73Δ菌株微管數(shù)目(n=60，n是細(xì)胞數(shù))；*：P<0.05表示差異顯著，**：P<0.01表示差異極顯著A: Morphology of microtubules in wild type (wt) and sgf73Δ strains; B: Statistical analysis of the length of microtubules in wild type (wt) and sgf73Δ strains (n=80, n is the number of microtubules); C: Statistical analysis of the number of microtubules in wild type (wt) and sgf73Δ strains (n=60, n is the number of cells); *P<0.05 means a significant difference, **P<0.01 means a very significant difference, respectively

2.3 sgf73基因敲除對(duì)裂殖酵母中染色體紡錘體動(dòng)力學(xué)的影響

熒光蛋白標(biāo)記和活細(xì)胞成像相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法是研究細(xì)胞有絲分裂的重要手段之一，其優(yōu)勢(shì)是對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記后即可在特定波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。將GFP-Atb2和Hht1-RFP作為檢測(cè)信號(hào)，觀察紡錘體和染色體在有絲分裂中的行為。由圖3可知，進(jìn)入有絲分裂的分裂期后，分裂間期的微管消失并形成紡錘體；在中期紡錘體維持一定的長(zhǎng)度；后期紡錘體伸長(zhǎng)，染色體分離，將染色體拉向細(xì)胞兩極。值得注意的是，sgf73Δ菌株在sgf73基因敲除后出現(xiàn)圖3中sgf73Δ(b)的現(xiàn)象，在分裂期紡錘體沒有伸長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間處于單極紡錘體的狀態(tài)，沒有進(jìn)入有絲分裂中后期，并且處于細(xì)胞兩極的染色體大小不均。以上結(jié)果提示，sgf73基因敲除導(dǎo)致菌株紡錘體組裝和染色體分離不均的缺陷。

圖3 野生型(wt)和sgf73Δ菌株有絲分裂期細(xì)胞動(dòng)力學(xué)成像結(jié)果Fig.3 Imaging results of dynamics of wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosiswt為野生型菌株細(xì)胞動(dòng)力學(xué)成像結(jié)果；sgf73Δ(a)-sgf73Δ(b)為sgf73Δ菌株細(xì)胞動(dòng)力學(xué)成像結(jié)果(熒光標(biāo)記為GFP-Atb2(tubulin)和Hht1-RFP (chromosome))；箭頭所指從左至右是虛線部分的放大圖片wt is the imaging results of dynamics of wild type during mitosis, sgf73Δ(a)-sgf73Δ (b) is the imaging results of dynamics of sgf73Δ strains during mitosis (fluorescent protein markers were GFP-Atb2(tubulin) and Hht1-RFP (chromosome)). The picture of the arrow refers to the enlarged picture of the dashed part from left to right

2.4 sgf73基因敲除對(duì)裂殖酵母有絲分裂紡錘體總時(shí)間及長(zhǎng)度的影響

對(duì)有絲分裂中紡錘體長(zhǎng)度的變化進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(圖4)，野生型(wt)菌株有絲分裂中紡錘體從形成到斷裂的總時(shí)間為(30.15±2.48)min，總長(zhǎng)度為(12.30±0.71)μm；sgf73Δ菌株有絲分裂中紡錘體總長(zhǎng)度為(13.0±1.52)μm，總時(shí)間為(38.78±8.03)min，與野生型(wt)菌株具有極顯著差異(P<0.01)。結(jié)果提示，sgf73基因缺失后有絲分裂時(shí)間極顯著延長(zhǎng)(P<0.01)。

圖4 有絲分裂中野生型(wt)和sgf73Δ菌株紡錘體伸長(zhǎng)結(jié)果Fig.4 Spindle results in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosisA：野生型(wt)菌株紡錘體伸長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)圖(n=20，n是細(xì)胞數(shù))；B：sgf73Δ菌株紡錘體伸長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)圖(n=20，n是細(xì)胞數(shù))；C： 野生型(wt)和sgf73Δ菌株紡錘體伸長(zhǎng)時(shí)間統(tǒng)計(jì)圖；D：野生型(wt)和sgf73Δ菌株紡錘體終長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)圖(n=20，n是細(xì)胞數(shù))；**：P<0.01表示差異極顯著A: Statistical analysis of spindle elongation in wild type (wt) during mitosis (n=20, n is number of cells); B: Statistical analysis of spindle elongation in sgf73Δ strains during mitosis (n=20, n is number of cells); C: Statistical analysis of spindle elongation time in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosis; D: Statistical analysis of spindle length in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosis (n=20, n is the number of cells); **P<0.01 means a very significant difference

2.5 sgf73基因敲除對(duì)裂殖酵母有絲分裂不同時(shí)期紡錘體的影響

進(jìn)一步對(duì)野生型(wt)和sgf73Δ菌株有絲分裂各時(shí)期時(shí)間和紡錘體伸長(zhǎng)速率的分析見圖5，野生型(wt)菌株有絲分裂前期時(shí)間為(4.28±1.22) min，紡錘體伸長(zhǎng)速率為(0.27±0.05) μm/min；sgf73Δ菌株有絲分裂前期的時(shí)間為(4.88±1.53) min，紡錘體伸長(zhǎng)速率為(0.23±0.07) μm/min，sgf73Δ前期紡錘體伸長(zhǎng)速率顯著慢于野生型(P<0.01)。有絲分裂中期，野生型(wt)菌株的時(shí)間為(9.83±1.91) min，紡錘體伸長(zhǎng)速率為(0.12±0.05) μm/min；sgf73Δ菌株的時(shí)間為(12.98±5.23) min，紡錘體伸長(zhǎng)速率為(0.08±0.04) μm/min，與野生型(wt)相比均有顯著差異(P<0.05)。有絲分裂后期，野生型菌株的時(shí)間為(16.05±1.76) min，紡錘體伸長(zhǎng)速率為(0.65±0.06) μm/min；sgf73Δ菌株的時(shí)間為(20.91±4.20) min，紡錘體伸長(zhǎng)速率為(0.54±0.12) μm/min，均具有極顯著差異(P<0.01)。

圖5 野生型(wt)和sgf73Δ菌株中有絲分裂各時(shí)期分裂時(shí)間和速率Fig.5 Time and velocity during mitosis prophase, metaphase and anaphase in wild type (wt) and sgf73Δ strainsA：有絲分裂前期時(shí)間；B：有絲分裂前期速率；C：有絲分裂中期時(shí)間；D：有絲分裂中期速率；E：有絲分裂周期時(shí)間；F：有絲分裂后期速率(n=20，n是細(xì)胞數(shù))；*：P<0.05表示差異顯著，**：P<0.01表示差異極顯著A: Time of prophase in mitosis; B: Velocity of prophase in mitosis; C: Time of metaphase in mitosis; D: Velocity of prophase in msitosis; E: Time of anaphase in mitosis； F: Velocity of prophase in mitosis (n=20, n is the number of cells)； *P<0.05 means a significant difference, **P<0.01 means a very significant difference, respectively

2.6 sgf73基因敲除對(duì)裂殖酵母細(xì)胞周期中細(xì)胞形態(tài)的影響

細(xì)胞長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(圖6)，在有絲分裂紡錘體形成點(diǎn)、前期和中期過渡點(diǎn)、中期和后期過渡點(diǎn)、紡錘體斷裂點(diǎn)和分裂末期野生型(wt)菌株的細(xì)胞長(zhǎng)度分別為(12.79±1.20)、(12.96±1.21)、(13.09±1.23)、(13.26±1.30)和(6.98±0.75) μm；sgf73Δ菌株的細(xì)胞長(zhǎng)度分別為(14.04±1.71)、(14.25±1.80)、(14.52±1.81)、(14.68±1.86)和(8.78±0.95) μm，在有絲分裂每個(gè)時(shí)期都與野生型具有顯著差異(P<0.05)，其中在中期和后期過渡點(diǎn)、紡錘體斷裂點(diǎn)和分裂末期具有極顯著差異(P<0.01)。

圖6 野生型(wt)和sgf73Δ菌株中有絲分裂各時(shí)期細(xì)胞形態(tài)和長(zhǎng)度Fig.6 Cell morphology and length of different phases during mitosis in wild type (wt) and sgf73Δ strainsA：野生型(wt)和sgf73Δ菌株中有絲分裂各時(shí)期細(xì)胞形態(tài)；B：紡錘體形成點(diǎn)的細(xì)胞長(zhǎng)度；C：前期和中期過渡點(diǎn)的細(xì)胞長(zhǎng)度；D：中期和后期過渡點(diǎn)的細(xì)胞長(zhǎng)度；E：紡錘體斷裂點(diǎn)的細(xì)胞長(zhǎng)度；F：分裂末期的細(xì)胞長(zhǎng)度(n=20，n是細(xì)胞數(shù))；*：P<0.05表示差異顯著，**：P<0.01表示差異極顯著A: Cell morphology of different phases during mitosis in wild type (wt) and sgf73Δ strains; B: Cell length in spindle formation; C: Cell length in prophase-metaphase transition; D: Cell length in metaphase-anaphase transition; E: Cell length in anaphase-spindle breakage transition; F: Cell length in the end point of mitosis (n=20, n is the number of cells); *P<0.05 means a significant difference, **P<0.01 means a very significant difference, respectively

細(xì)胞寬度統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(圖7)，在有絲分裂紡錘體形成點(diǎn)、前期和中期過渡點(diǎn)、中期和后期過渡點(diǎn)、紡錘體斷裂點(diǎn)和分裂末期野生型(wt)菌株的細(xì)胞寬度分別為(3.45±0.24)、(3.46±0.24)、(3.49±0.24)、(3.51±0.25)和(3.48±0.22) μm；sgf73Δ菌株的細(xì)胞寬度分別為(3.69±0.38)、(3.72±0.37)、(3.75±0.36)、(3.78±0.37)、(3.51±0.30) μm，在紡錘體形成點(diǎn)、前期和中期過渡點(diǎn)、中期和后期過渡點(diǎn)sgf73Δ菌株與野生型菌株相比具有顯著差異(P<0.05)，在紡錘體斷裂點(diǎn)與野生型相比具有極顯著差異(P<0.01)。

圖7 野生型(wt)和sgf73Δ菌株有絲分裂各時(shí)期細(xì)胞的寬度Fig.7 Cell width of different phases during mitosis in wild type (wt) and sgf73Δ strainsA：紡錘體形成點(diǎn)的細(xì)胞寬度；B：前期和中期過渡點(diǎn)的細(xì)胞寬度；C：中期和后期過渡點(diǎn)的細(xì)胞寬度；D：紡錘體斷裂點(diǎn)的細(xì)胞寬度；E：分裂末期的細(xì)胞寬度(n=20，n是細(xì)胞數(shù))；*：P<0.05表示差異顯著，**：P<0.01表示差異極顯著A: Cell width in spindle formation; B: Cell width in prophase-metaphase transition; C: Cell width in metaphase-anaphase transition; D: Cell width in anaphase-spindle breakage transition； E: Cell width in the end point of mitosis (n=20, n is the number of cells); *P<0.05 means a significant difference, **P<0.01 means a very significant difference, respectively

在有絲分裂的紡錘體形成點(diǎn)、前期和中期過渡點(diǎn)、中期和后期過渡點(diǎn)、紡錘體斷裂點(diǎn)和分裂末期野生型(wt)菌株的細(xì)胞長(zhǎng)寬比分別為(3.77±0.41)、(3.76±0.40)、(3.77±0.41)、(3.80±0.42)和(2.02±0.30)，sgf73Δ菌株的細(xì)胞長(zhǎng)寬比分別為(3.84±0.59)、(3.87±0.61)、(3.90±0.56)、(3.91±0.55)、(2.53±0.40)，在前期和中期過渡點(diǎn)以及分裂末期sgf73Δ菌株的細(xì)胞長(zhǎng)寬比與野生型相比具有極顯著差異(P<0.01)(圖8)。

圖8 野生型(wt)和sgf73Δ菌株有絲分裂各時(shí)期細(xì)胞長(zhǎng)寬比Fig.8 Cell length-width ratio of different phases during mitosis in wild type (wt) and sgf73Δ strainsA：紡錘體形成點(diǎn)的細(xì)胞長(zhǎng)寬比；B：前期和中期過渡點(diǎn)的細(xì)胞長(zhǎng)寬比；C：中期和后期過渡點(diǎn)的細(xì)胞長(zhǎng)寬比；D：紡錘體斷裂點(diǎn)的細(xì)胞長(zhǎng)寬比；E：分裂末期的細(xì)胞長(zhǎng)寬比(n=20，n是細(xì)胞數(shù))；**：P<0.01表示差異極顯著A: Cell length-width ratio in spindle formation; B: Cell length-width ratio in prophase-metaphase transition; C: Cell length-width ratio in metaphase-anaphase transition; D:Cell length-width ratio in anaphase-spindle breakage transition; E: Cell length-width ratio in the end point of mitosis (n=20, n is the number of cells); **P<0.01 means a very significant difference

2.7 sgf73基因敲除對(duì)裂殖酵母有絲分裂中紡錘體形成及斷裂的影響

通過活細(xì)胞成像觀察到野生型(wt)菌株(81.67±2.89)%在有絲分裂開始時(shí)微管形成棒狀(Bar)紡錘體，10%先形成點(diǎn)狀(Dot)紡錘體再形成棒狀紡錘體，(8.33±2.89)%微管形成單極紡錘體(Mono)；sgf73Δ菌株(56.67±5.77)%菌株形成棒狀紡錘體，(16.67±2.89)%形成點(diǎn)狀紡錘體，(26.66±2.89)%形成單極紡錘體。以上結(jié)果中，sgf73Δ菌株形成棒狀和單極紡錘體的菌株與野生型菌株具有極顯著差異(P<0.01)，形成點(diǎn)狀紡錘體的具有顯著差異(P<0.05)(圖9A、9B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，sgf73基因敲除導(dǎo)致紡錘體形成缺陷，單極紡錘體增加，不利于有絲分裂中染色體的正確分離，提示sgf73基因可能參與雙極紡錘體的組裝。

在有絲分裂后期，紡錘體將染色體拉向細(xì)胞兩極后會(huì)發(fā)生斷裂，分裂完成后重新在子細(xì)胞中以微管的形式存在[22]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，野生型(wt)菌株中(21.67±7.64)%紡錘體是直線型(Linear-type)斷裂，(66.67±2.89)%是拱型(Arch-type)斷裂，(11.66±5.77)%是S型斷裂；sgf73Δ菌株中(20±8.66)%為直線型斷裂，(80±8.66)%為拱型斷裂(圖9C、9D)。結(jié)果提示，sgf73基因缺失不會(huì)顯著影響紡錘體斷裂形式。

圖9 野生型(wt)和sgf73Δ菌株有絲分裂中紡錘體形成及斷裂分析結(jié)果Fig.9 Analysis results of formation and fracture of spindle results in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosisA：野生型(wt)和sgf73Δ菌株有絲分裂紡錘體形成方式形態(tài)圖；B：野生型(wt)和sgf73Δ菌株有絲分裂紡錘體形成方式統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=60，n是細(xì)胞數(shù))；C：野生型(wt)和sgf73Δ菌株有絲分裂紡錘體斷裂方式統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=60，n是細(xì)胞數(shù))；D：野生型(wt)和sgf73Δ菌株有絲分裂紡錘體斷裂方式形態(tài)圖；*：P<0.05表示差異顯著，**：P<0.01表示差異極顯著A: Morphology of spindle formation types in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosis; B: Statistical results of spindle formation types in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosis (n=60, n is the number of cells); C: Statistical results of spindle breakage types in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosis (n=60, n is the number of cells); D: Morphology of spindle breakage types during mitosis in wild type (wt) and sgf73Δ strains; *P<0.05 means a significant difference, **P<0.01 means a very significant difference, respectively

2.8 sgf73基因敲除對(duì)裂殖酵母有絲分裂中肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的影響

肌動(dòng)蛋白是真核細(xì)胞的細(xì)胞骨架中重要組成部分，在各種基本細(xì)胞過程中起重要作用，包括維持細(xì)胞形狀、極性、分裂、遷移、內(nèi)吞和囊泡運(yùn)輸?shù)萚23-34]，在有絲分裂時(shí)形成分裂環(huán)，將兩個(gè)細(xì)胞分開。對(duì)sgf73Δ菌株肌動(dòng)蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過活細(xì)胞成像，觀察野生型(wt)以及sgf73Δ菌株有絲分裂中肌動(dòng)蛋白的形態(tài)和行為(圖10A、10B)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，野生型菌株在有絲分裂中肌動(dòng)蛋白的收縮環(huán)直徑為(3.70±0.27) μm，從形成到消失的時(shí)間為(29.6±3.07) min，速率為(0.10±0.01) μm/min；sgf73Δ菌株收縮環(huán)的直徑為(3.56±0.31) μm，從形成到消失的時(shí)間為(21.95±3.55) min，速率為(0.08±0.01) μm/min，在時(shí)間與速率上與野生型具有極顯著差異(P<0.01)(圖11A～C)。

圖10 野生型(wt)和sgf73Δ菌株有絲分裂中肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)結(jié)果Fig.10 Kinetic results of actin during mitosis in wild type (wt) and sgf73Δ strainsA：有絲分裂中野生型和sgf73Δ菌株肌動(dòng)蛋白形態(tài)圖；B：有絲分裂中野生型和sgf73Δ菌株肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)；C：野生型菌株肌動(dòng)蛋白收縮統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=30，n是細(xì)胞數(shù))；D：sgf73Δ菌株肌動(dòng)蛋白收縮統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=30，n是細(xì)胞數(shù))A: Actin morphology in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosis; B: Actin dynamics in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosis;C: Statistical results of actin contraction during mitosis in wt (n=30, n is number of cells); D: Statistical results of actin contraction during mitosis in sgf73Δ strains (n=30, n is number of cells)

分裂環(huán)在有絲分裂期間會(huì)維持一段時(shí)間后進(jìn)入收縮期，有絲分裂結(jié)束后將細(xì)胞一分為二[25]。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，野生型維持時(shí)間為(12.90±2.66) min，sgf73Δ菌株分裂環(huán)維持時(shí)間為(16.8±2.88) min，與野生型具有顯著差異(P<0.01)。在分裂環(huán)收縮過程中，野生型收縮時(shí)間為(16.80±3.19) min，收縮速率為(0.18±0.04) μm/min，sgf73Δ菌株收縮時(shí)間為(15.15±1.98) min，收縮速率為(0.18±0.03) μm/min，sgf73Δ菌株收縮時(shí)間顯著長(zhǎng)于野生型(P<0.05)(圖11D～E)。結(jié)果提示，sgf73基因敲除導(dǎo)致分裂環(huán)在有絲分裂中從形成到消失的總時(shí)間極顯著延長(zhǎng)，總速率顯著降低，維持時(shí)間極顯著延長(zhǎng)，收縮時(shí)間顯著延長(zhǎng)。

圖11 野生型(wt)和sgf73Δ菌株有絲分裂肌動(dòng)蛋白收縮數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Fig.11 Statistical results of actin contraction in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosisA：有絲分裂野生型和sgf73Δ菌株肌動(dòng)蛋白長(zhǎng)度；B：有絲分裂野生型和sgf73Δ菌株肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)總時(shí)間；C：有絲分裂野生型和sgf73Δ菌株肌動(dòng)蛋白從形成到消失的總速率；D：有絲分裂野生型和sgf73Δ菌株肌動(dòng)蛋白長(zhǎng)度維持不變的時(shí)間；E：有絲分裂野生型和sgf73Δ菌株肌動(dòng)蛋白收縮時(shí)間；F：有絲分裂野生型和sgf73Δ菌株肌動(dòng)蛋白收縮速率(n=30，n是細(xì)胞數(shù))*：P<0.05表示差異顯著，**：P<0.01表示差異極顯著A: Actin length in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosis; B: Total actin kinetic time in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosis; C: Actin dwell velocity in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosis; D: Actin dwell time in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosis; E: Actin shrinkage time in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosis; F: Actin shrinkage velocity in wild type (wt) and sgf73Δ strains during mitosis (n=30, n is number of cells); *P<0.05 means a significant difference, and **P<0.01 means a very significant difference, respectively

3 討 論

微管和肌動(dòng)蛋白作為細(xì)胞骨架，在細(xì)胞中具有重要作用。在分裂間期，微管蛋白組成微管，幫助細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器定位和物質(zhì)運(yùn)輸；在分裂期，微管蛋白形成紡錘體，幫助染色體分離。Kapitein等[26]研究發(fā)現(xiàn)，微管缺陷會(huì)導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)系統(tǒng)異常，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾種人類神經(jīng)發(fā)育障礙與微管介導(dǎo)的過程改變有關(guān)。在細(xì)胞分裂中紡錘體的組裝是一個(gè)復(fù)雜但精確調(diào)節(jié)的過程，與中心體周期相關(guān)。Wang等[27]發(fā)現(xiàn)，在脊椎動(dòng)物中，有絲分裂激酶異常導(dǎo)致的中心體功能異常通常會(huì)誘導(dǎo)中心體周期異常，并伴隨有絲分裂紡錘體的形成異常，包括單極和多極紡錘體，這將導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定并可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Olmsted等研究發(fā)現(xiàn)，在人類，果蠅，非洲爪蟾卵和裂殖酵母中，抑制驅(qū)動(dòng)蛋白5會(huì)導(dǎo)致單極紡錘體的產(chǎn)生[28-30]，驅(qū)動(dòng)蛋白5的缺失、失活或錯(cuò)誤定位會(huì)導(dǎo)致持久的單極紡錘體。Blackwell等[28]發(fā)現(xiàn)，驅(qū)動(dòng)蛋白14數(shù)量多也會(huì)導(dǎo)致紡錘體持久的單極性狀態(tài)，敲除驅(qū)動(dòng)蛋白14或動(dòng)力蛋白可以消除單極紡錘體。持久的單極紡錘體導(dǎo)致染色體的不分離或不均分，Cooper等[31]證明，染色體的不均分會(huì)導(dǎo)致有絲分裂末期兩個(gè)子細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)不等，引發(fā)疾病，如癌癥等。sgf73基因除了參與染色質(zhì)的組裝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在細(xì)胞有絲分裂中還參與中心粒周期、雙極紡錘體的組裝和染色體的分離。本研究結(jié)果顯示，sgf73Δ菌株形成棒狀和單極紡錘體的菌株與野生型菌株具有極顯著差異(P<0.01)，形成點(diǎn)狀紡錘體的具有顯著差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，sgf73基因敲除導(dǎo)致紡錘體形成缺陷，單極紡錘體增加，不利于有絲分裂中染色體的正確分離，提示sgf73基因編碼的蛋白可能參與雙極紡錘體的組裝。

肌動(dòng)蛋白除了作為細(xì)胞骨架，在分裂中還會(huì)形成分裂環(huán)，在分裂結(jié)束后將兩個(gè)細(xì)胞分離。Asadi等[32]發(fā)現(xiàn)了影響胞質(zhì)分裂和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的基因ain1、acp2、acp1等，其中ain1基因編碼α-actin，缺失后導(dǎo)致細(xì)胞收縮環(huán)裝配、形態(tài)、收縮異常[33]；acp2基因編碼F-肌動(dòng)蛋白帽β亞基Acp2，缺失導(dǎo)致acp2Δ菌株出現(xiàn)肌動(dòng)蛋白減少、組織和融合異常、收縮環(huán)形成延遲、收縮速率降低、收縮環(huán)形態(tài)異常、在細(xì)胞中呈分散的斑塊狀等缺陷[34-35]；acp1基因編碼F-肌動(dòng)蛋白帽α亞基，缺失導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白絲解聚速率降低[36]。本研究結(jié)果顯示，sgf73基因缺失后導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白形成的分裂環(huán)在有絲分裂中從形成到消失的總時(shí)間極顯著延長(zhǎng)，總速率顯著降低，維持時(shí)間極顯著延長(zhǎng)，收縮時(shí)間顯著延長(zhǎng)，提示sgf73基因編碼的蛋白可能參與肌動(dòng)蛋白形成分裂環(huán)及分裂環(huán)收縮的系列過程。

sgf73基因缺失后菌株的缺陷一方面可通過活細(xì)胞成像進(jìn)行觀察，另一方面，也會(huì)表現(xiàn)在菌株的宏觀生長(zhǎng)情況上。有研究表明，red1Δ、gls1Δ、bub1Δfin1Δ、dcr1Δreb1Δ、fin1Δmad2Δ菌株在基因敲除后均生長(zhǎng)緩慢[37-41]，sgf73Δ基因敲除后造成了菌株紡錘體組裝缺陷和染色體分離缺陷，并且肌動(dòng)蛋白分裂環(huán)的收縮速率受到影響，從而極顯著的延長(zhǎng)了sgf73菌株有絲分裂時(shí)間，在生長(zhǎng)曲線測(cè)定時(shí)表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢。有性生殖是裂殖酵母另一種生殖方式，Sun等[42]和Nielsen[43]發(fā)現(xiàn)與裂殖酵母有性生殖相關(guān)的基因有數(shù)十個(gè)，其中byr1/ste1、ste4、ras1/ste5、ste6、ste7、byr2/ste8、ste20、ral2、scd2/ral3基因敲除株會(huì)導(dǎo)致菌株產(chǎn)孢異常；klp5Δ、klp6Δ、mug1Δ、mug5Δ菌株在氮缺乏條件下產(chǎn)生少于或多于4個(gè)的孢子；Kovar等[35]發(fā)現(xiàn)acp1Δ和acp2Δ菌株僅有58%、61%產(chǎn)生了4個(gè)孢子，且孵育時(shí)間越長(zhǎng)，形成的孢子越少；Dudin等[44]研究發(fā)現(xiàn)SAGA復(fù)合物中Ubp8缺失導(dǎo)致菌株產(chǎn)孢效率低。本研究結(jié)果顯示，sgf73基因敲除極顯著影響裂殖酵母的生長(zhǎng)，并導(dǎo)致子囊孢子數(shù)目顯著減少，提示sgf73基因還可能與裂殖酵母有性生殖相關(guān)。

本研究為探究sgf73基因缺失后導(dǎo)致微管、染色體和肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)缺陷的影響及相關(guān)疾病提供了一定參考。但影響細(xì)胞動(dòng)力學(xué)變化的上下游互作蛋白的研究還需進(jìn)一步探究。