陳 杰， 何洛迪， 魏 杰， 趙 文， 馬悅欣， 王 宇， 張 灣， 尹東鵬

(大連海洋大學(xué) 遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

綜合養(yǎng)殖是利用生物不同的營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位，使養(yǎng)殖系統(tǒng)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)多次反復(fù)利用而提高其利用率的一種養(yǎng)殖模式[1]，也稱(chēng)生態(tài)養(yǎng)殖。近年來(lái)，主養(yǎng)“海蜇-縊蟶”的生態(tài)養(yǎng)殖模式在遼東地區(qū)得到了推廣和普及，如遼寧省東港市2019年海水池塘養(yǎng)殖面積約0.67×104hm2，其中池塘立體養(yǎng)殖面積超0.47×104hm2，產(chǎn)值過(guò)億元[2]。目前，對(duì)該模式生態(tài)養(yǎng)殖研究主要圍繞食物網(wǎng)關(guān)系[3-4]、生源要素即碳、氮和磷[5]、懸浮顆粒物和有機(jī)碳[6]等方面展開(kāi)，對(duì)細(xì)菌群落的研究鮮有報(bào)道。細(xì)菌群落可以反映養(yǎng)殖環(huán)境的健康狀況，并參與生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)[7]。同時(shí)養(yǎng)殖生物也受到細(xì)菌群落的影響，如某些有益菌可參與水質(zhì)調(diào)控，將氨、亞硝酸鹽和硫化氫這類(lèi)有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為低毒或無(wú)毒結(jié)構(gòu)，以利于養(yǎng)殖生物生存與生長(zhǎng)[8]；此外，某些致病菌在達(dá)到其適宜生長(zhǎng)條件時(shí)會(huì)呈爆發(fā)性增長(zhǎng)導(dǎo)致養(yǎng)殖生物疾病發(fā)生[9]。因此，研究養(yǎng)殖池塘中細(xì)菌群落特征，能更好地監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境和防控養(yǎng)殖生物發(fā)生疾病。有關(guān)養(yǎng)殖池塘細(xì)菌群落多樣性的研究多集中于傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式，如暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)[10]、大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)[11]，南美白對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[12]，凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[13]等單一生物養(yǎng)殖池塘的細(xì)菌群落多樣性，而對(duì)生態(tài)養(yǎng)殖池塘的報(bào)道較少[14-16]。本研究采用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)，研究“海蜇-縊蟶”生態(tài)養(yǎng)殖池塘水體與沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征及其主要環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子，旨在為海水生態(tài)養(yǎng)殖模式微生態(tài)環(huán)境調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 綜合養(yǎng)殖池塘概況 試驗(yàn)養(yǎng)殖池塘位于遼寧省東港市北井子鎮(zhèn)(39°84′99″N；123°82′89″E)，池塘面積120 hm2，平均水深1.99 m。以海蜇和縊蟶為主要養(yǎng)殖種類(lèi)，4月投放體長(zhǎng)3～5 cm蟶子苗45筐，20～30萬(wàn)粒/筐，投放1 cm左右蝦苗70萬(wàn)尾；5月放3～5 cm規(guī)格海蜇苗90萬(wàn)尾和7～8 cm規(guī)格牙鲆魚(yú)苗10萬(wàn)尾。投喂餌料為碎末玉筋魚(yú)、沙蠶和人工配合飼料。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 鉬酸銨(天津市化工三廠有限公司)，氯化銨、硫酸銨、硫酸錳和EDTA二鈉(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)。便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀(HQ30d，美國(guó)Hach公司)；采水裝置為水生80型采水器；采泥裝置為蚌斗式采泥器；抽濾所需設(shè)備及用具為循環(huán)水式多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ)，河南省予華儀器有限公司)；玻璃過(guò)濾器(T-50，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；微孔濾膜(孔徑0.2 μm，直徑25 mm，上海興亞凈化材料廠)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及處理 為了全面掌握細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化情況，2021年4月至8月對(duì)養(yǎng)殖池塘進(jìn)行水樣和沉積物樣品采集，每月一次。每個(gè)池塘采用3點(diǎn)采樣法，即進(jìn)水口、中間和出水口三個(gè)位點(diǎn)。分別于每個(gè)位點(diǎn)表(水下0.5 m)、中、底(距底0.5 m)三層采水，由于池塘水深變化不大，采用混合采集方式，分層采水5 L混合，取500 mL混合水樣裝入已滅菌采樣瓶中，依次命名為ZCW4、ZCW5、ZCW6、ZCW7、ZCW8；同時(shí)每個(gè)位點(diǎn)采集池塘底部表層(5 cm內(nèi))沉積物，分別取5 mL混合泥樣裝入已滅菌EP管內(nèi)。養(yǎng)殖周期內(nèi)共采集樣品30個(gè)。水樣和沉積物于低溫冰箱儲(chǔ)存，盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室處理。室內(nèi)水樣經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，將過(guò)濾后的濾膜和沉積物分裝于1.5 mL離心管中，經(jīng)液氮處理5 min后于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 水樣和沉積物樣品由北京諾禾致源生物公司進(jìn)行高通量測(cè)序。采用CTAB法對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行提取，細(xì)菌16S rDNA基因V3～V4片段的擴(kuò)增引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′)。下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾和質(zhì)控后按照97%一致性進(jìn)行OTUs聚類(lèi)，再進(jìn)行物種注釋和分類(lèi)。構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)后在NovoMagic平臺(tái)上進(jìn)行多樣性分析、UPGMA聚類(lèi)分析和Spearman相關(guān)分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖池塘細(xì)菌群落多樣性

30個(gè)樣品共得到平均有效序列657 428條，按照97%的相似性構(gòu)建OTUs并獲得注釋信息的Tags數(shù)目平均為28 216個(gè)。水體中OTUs數(shù)目為786～2 141，平均為1 579個(gè)；沉積物中OTUs數(shù)目為3 515～4 729，平均為4 045個(gè)。水體與沉積物中細(xì)菌分布花瓣圖(圖1)所示，水體中不同月份OTUs共享數(shù)目為288個(gè)，而沉積物中OTUs共享數(shù)目為2 035個(gè)。

圖1 養(yǎng)殖池塘水體與沉積物中細(xì)菌分布花瓣圖Fig.1 Distribution of bacteria in water and sediment of aquaculture pondA：水樣，B：沉積物樣品，數(shù)字4～8分別代表采樣月份A：the water sample,B：the sediment sample, and the numbers 4-8 represent the sampling months respectively

利用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)比較分析養(yǎng)殖池塘水體與沉積物中細(xì)菌多樣性(表1)。結(jié)果表明，沉積物中細(xì)菌多樣性指數(shù)均明顯高于水體中細(xì)菌多樣性，從時(shí)間上來(lái)看，5月水體與沉積物中細(xì)菌多樣性指數(shù)均最高，而8月則最低。

表1 養(yǎng)殖池塘水體與沉積物中細(xì)菌多樣性指數(shù)Table 1 Bacterial diversity index in water and sediment of aquaculture pond

物種注釋養(yǎng)殖池塘共發(fā)現(xiàn)細(xì)菌112門(mén)、173綱、361目、526科、1 076屬、494種，對(duì)OTUs豐富度前10的門(mén)水平物種相對(duì)豐度進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析(圖2)，結(jié)果表明，浮游細(xì)菌和沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似度低，各聚為一類(lèi)。變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和未分類(lèi)的菌門(mén)為水體與沉積物中共有優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。其中，水體中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)主要為變形菌門(mén)46%、藍(lán)細(xì)菌門(mén)16%、擬桿菌門(mén)11%、放線桿菌門(mén)8%和未分類(lèi)的菌門(mén)7%；沉積物中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)主要為變形菌門(mén)22%、未分類(lèi)的菌門(mén)16%、脫硫桿菌門(mén)14%、擬桿菌門(mén)12%、彎曲桿菌門(mén)6%、酸桿菌門(mén)(Acidobacteriota)4%和厚壁菌門(mén)2%。

圖2 養(yǎng)殖池塘水與沉積物中細(xì)菌門(mén)水平上的物種相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of species at the level of bacterial phylum in aquaculture pond water and sediment

水體中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)變形菌門(mén)為α-變形菌，其包含的優(yōu)勢(shì)屬分別為Planktomarina(4月為4.7%、5月為4.14%)、慢桿菌屬(Lentibacter)(5月為7%、6月為8.55%)、HIMB11(6月為5.06%、7月為10.35%)、荔枝菌屬(Litorimicrobium)(6月為7.7%、8月為3.29%)、海命菌屬(Marivita)(4月為5.26%、5月為5.78%、6月為1.5%)、雷辛格氏菌屬(Leisingera)(6月為1.83%、7月為7.22%、8月為3.33%)和CladeIa(4月為9.36%、5月為9.15%、6月為9.4%、7月為3.22%和8月為6.99%)，以上除CladeIa外均為紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)。沉積物中變形菌門(mén)為γ-變形菌，其包含的優(yōu)勢(shì)菌群分別為伍斯菌屬(Woeseia)(4月為4.26%、5月為6.16%、6月為3.15%、7月為1.36%和8月為3.93%)、弧菌屬(Vibrio)(4月為1.88%)、麗弧菌屬(Aliivibrio)(4月為1.87%)、假單胞菌屬(Pseudomonadaceae)(7月為5.36%)和MND1(6月為2.23%)。

2.2 細(xì)菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性

用Spearman相關(guān)研究環(huán)境因子與門(mén)水平菌群間相互關(guān)系，得到兩兩之間的相關(guān)性和顯著性(圖3)。在OTUs豐富度前10的菌群門(mén)類(lèi)中，變形菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)和放線桿菌門(mén)與TN呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與TP呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；未分類(lèi)菌門(mén)與TN呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與TP呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；彎曲桿菌門(mén)與TN呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與TP呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；脫硫桿菌門(mén)與TN呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，厚壁菌門(mén)與TP呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其他門(mén)類(lèi)與環(huán)境因子相關(guān)性不明顯。

圖3 養(yǎng)殖池塘細(xì)菌門(mén)水平Spearman相關(guān)性分析Fig.3 Spearman correlation analysis of bacterial phyla level in aquaculture pond縱向?yàn)榄h(huán)境因子，橫向?yàn)榫洪T(mén)類(lèi)，中間熱圖對(duì)應(yīng)的值為Spearman相關(guān)系數(shù)，介于-1～1之間，r>0為正相關(guān)，r<0為負(fù)相關(guān)，*表示有顯著性差異(P<0.05)，**表示極顯著差異(P<0.01)The vertical is environmental factors, the horizontal is flora, and the corresponding value of the intermediate heat map is Spearman correlation coefficient, which is between - 1-1,r>0 is positive correlation, r<0 is negative correlation, * indicates significant difference (P<0.05), * * indicates very significant difference (P<0.01)

3 討 論

本研究池塘沉積物主要采集表層底泥，其微生物與水體中環(huán)境因子相互作用密切相關(guān)，基于此，本研究比較分析了在同一水環(huán)境下水中與沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異。通過(guò)16S rDNA高通量測(cè)序結(jié)果表明，“海蜇-縊蟶”生態(tài)養(yǎng)殖池塘沉積物中細(xì)菌多樣性指數(shù)明顯高于水體中浮游細(xì)菌多樣性，這與現(xiàn)有研究報(bào)道相一致[18-19]。分析原因，主要由于養(yǎng)殖池塘中動(dòng)物糞便、餌料殘?jiān)痛x物質(zhì)等多富集于沉積物中[20]，給細(xì)菌提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適宜的環(huán)境條件，使其大量生長(zhǎng)繁殖。

變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是水體與沉積物共有優(yōu)勢(shì)菌群，變形菌門(mén)普遍存在于海洋環(huán)境中，且在數(shù)量上占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。這可能是一方面基于現(xiàn)代分子序列數(shù)據(jù)分析，原核生物中變形菌的規(guī)模和數(shù)量是最大和最多的分支[21]；另一方面由于養(yǎng)殖環(huán)境中氮磷濃度較高，而變形菌具有脫氮除磷的功能，參與水質(zhì)調(diào)控，維持養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能[22-24]。本研究結(jié)果表明，水體中變形菌的主要類(lèi)群為α-變形菌綱紅細(xì)菌目，此類(lèi)細(xì)菌是一類(lèi)紫色非硫細(xì)菌，通過(guò)自身的光合色素(葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素)，利用硫化氫、硫代硫酸鈉和分子氫進(jìn)行光合自養(yǎng)，也能用不同基質(zhì)做碳源進(jìn)行異養(yǎng)光合代謝[25]。γ-變形菌為沉積物中變形菌的主要類(lèi)群，其能利用不同類(lèi)型和濃度的碳源，參與厭氧氨氧化過(guò)程[25]。因此，變形菌在養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)過(guò)程中扮演著重要角色。擬桿菌門(mén)為水體和沉積物中共有的第二大優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，能分解有機(jī)物和參與碳循環(huán)[26]，擬桿菌門(mén)中黃桿菌(Flavobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌群，除對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境有積極影響外，也可能造成威脅，在高氨氮低溶氧條件下可使魚(yú)類(lèi)誘發(fā)疾病[27]。水中藍(lán)細(xì)菌門(mén)未鑒定的Chloroplast菌群豐度也位居前列，在中國(guó)明對(duì)蝦研究中也有報(bào)道[28]，譯為“葉綠體”，因此推測(cè)其可參與光合作用。沉積物中彎曲桿菌門(mén)主要為硫卵菌(Sulfurovum)，這是一類(lèi)硫氧化化能細(xì)菌，在有機(jī)物高度富集的海洋沉積物的硫、氮和氫循環(huán)中起關(guān)鍵作用[12]。此外，值得注意的是沉積物中脫硫桿菌門(mén)也占有較大優(yōu)勢(shì)，且出現(xiàn)于整個(gè)養(yǎng)殖周期。它是一種嚴(yán)格厭氧硫化細(xì)菌，在缺氧條件下轉(zhuǎn)化硫化氫，對(duì)環(huán)境和養(yǎng)殖生物造成威脅[29]。

生物與環(huán)境相互作用，共同維持生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能。研究表明，化學(xué)需氧量和有機(jī)碳是影響夏季仿刺參養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌群落構(gòu)成的主導(dǎo)環(huán)境因子[13]，pH、溫度和溶氧量是影響中華絨螯蟹養(yǎng)殖池塘水體菌群結(jié)構(gòu)與功能的主要環(huán)境因子[30]，斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖池塘沉積物菌群結(jié)構(gòu)與透明度和溶解性懸浮物顯著相關(guān)[27]。氮和磷是生物生長(zhǎng)所需的主要兩類(lèi)元素[31]，且海洋浮游細(xì)菌對(duì)氮磷的需求高[32]。本研究結(jié)果也表明，水體中優(yōu)勢(shì)菌群變形菌、藍(lán)細(xì)菌和放線桿菌與總氮呈顯著正相關(guān)，與總磷呈顯著負(fù)相關(guān)；沉積物中優(yōu)勢(shì)菌群為未分類(lèi)的菌門(mén)、脫硫桿菌和彎曲桿菌與總氮呈顯著負(fù)相關(guān)，與總磷呈顯著正相關(guān)。由此可看出，總氮和總磷是影響“海蜇-縊蟶”養(yǎng)殖池塘細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征的主要環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子。然而，這些菌群與氮、磷如何相互作用還需進(jìn)一步深入探究。