張貝貝，曾夢楠，賈菊芳，郭彭莉，劉 萌，張欽欽，馮衛(wèi)生，鄭曉珂

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南省中藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046)

膿毒癥是一種系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重可導(dǎo)致器官功能障礙，腎臟往往是膿毒癥最易受累靶器官之一[1]。急性腎損傷 (acute kidney injury，AKI)是常見的腎功能快速下降的臨床綜合征，是膿毒癥常見的致死性并發(fā)癥，而且膿毒癥引起的AKI超過50%[2]。脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的AKI是研究膿毒癥急性腎損傷的常見模型[3]。到目前為止，還沒有明確闡明LPS誘導(dǎo)毒性的機(jī)理，但其本質(zhì)上是多因素的，涉及活性氧 (reactive oxygen species，ROS)、細(xì)胞凋亡和炎癥因子等[4]。此外，腎小管上皮細(xì)胞損傷是膿毒癥急性腎損傷發(fā)生發(fā)展較為重要的機(jī)制之一，常出現(xiàn)腎單位中腎小管上皮細(xì)胞凋亡[5]。

山藥的記載最早出現(xiàn)在《山海經(jīng)》，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，其味甘、性平，歸脾、肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精等功效[6]，且有療五勞七傷，治諸百病之說。本課題組前期對山藥進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，并發(fā)現(xiàn)從山藥中分離得到的熊果苷(arbutin,Ar)通過雌激素受體β (estrogen receptor β，ERβ)和G蛋白偶聯(lián)受體30 (G protein coupled receptor 30，GPR30)發(fā)揮雌激素樣活性[7]，且對急性腎損傷也具有較好的保護(hù)作用[8]。Ar常用于美白化妝品中，具有抗炎、抗氧化等藥理活性[9]，但是Ar對急性腎損傷的作用與雌激素樣活性之間的關(guān)系仍未明確，因此本研究通過LPS誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52e細(xì)胞損傷構(gòu)建膿毒癥急性腎損傷體外模型，探究Ar干預(yù)急性腎損傷與雌激素樣活性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑NRK-52e大鼠腎小管上皮細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；LPS(批號:L2880)購自Sigma公司；THC(批號:HYB0151)購自MCE公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(批號:2082064)購自Gibco Invitrogen公司；胎牛血清(批號:1011-881)購自杭州四季青公司；PBS(批號:SH30256107)購自Hyclone公司；Ar(批號:A7380)，胰蛋白酶 (批號:T1350)，MTT(批號:M8180)，DMSO(批號:D8370)，氨芐青霉素(批號:A6920)，鏈霉素(批號:S8290)，F(xiàn)luo-4 AM(批號:F8500)，ROS試劑盒(批號:CA1410)，4%組織細(xì)胞固定液(批號:P1110)，TritonX-100 (批號:T8200)，PBST(批號:G4207-500)，DPBS(批號:G4200)購自北京索萊寶科技有限公司；BSA(批號:9423010160)北京鼎國昌盛生物技術(shù)責(zé)任有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒(批號:559763)購自BD Biosciences公司；caspase-3一抗(ab13847)、caspase-9一抗(ab32539)、Bax一抗(ab32503)、Bcl-2一抗(ab59348)、ERβ一抗 (ab3576)、β-actin一抗(ab8227)購自Abcam公司；兔源熒光二抗 (925-68071)、鼠源熒光二抗(925-32210)購自LI-COR Biosciences公司。

1.2 儀器與設(shè)備BioTek全功能酶標(biāo)儀 (美國伯騰儀器有限公司)，流式細(xì)胞儀 (美國BD Biosciences)，Amnis FlowSight成像流式細(xì)胞儀 (美國Luminex有限公司)，雙色近紅外成像系統(tǒng) (美國LI-COR Biosciences)，90-3型雙向定時恒溫磁力攪拌器 (上海楚定分析儀器有限公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組NRK-52e細(xì)胞培養(yǎng)在高糖DMEM+0.1 FBS的培養(yǎng)液中(含青、鏈霉素為100 kU·L-1)。培養(yǎng)箱條件為37 ℃，5% CO2，飽和濕度。取對數(shù)生長期NRK-52e細(xì)胞，以2 000個細(xì)胞/孔接種于96孔板，24 h后分為正常組(CON)、不同濃度的模型組(LPS,0.1、0.5、1、5、10 mg·L-1)，培養(yǎng)24 h后，MTT檢測細(xì)胞活力。同樣NRK-52e細(xì)胞接種于96孔板24 h后，分為正常組(CON)、模型組(LPS,1 mg·L-1)、不同濃度的Ar組(Ar,0.1、1、5、10、20、50 μmol·L-1+LPS,1 mg·L-1)，MTT檢測細(xì)胞活力。

1.4 Amnis FlowSight成像流式細(xì)胞儀檢測ROS水平取對數(shù)生長期NRK-52e細(xì)胞以20 000個細(xì)胞/孔接種于6孔板，通過處理分為正常組(CON)、模型組 (LPS,1 mg·L-1)、低劑量Ar組 (LAr,5 μmol·L-1+LPS,1 mg·L-1)、高劑量Ar組 (HAr,10 μmol·L-1+LPS,1 mg·L-1)、正常+THC組(CON+THC,1 μmol·L-1)、模型+THC組(LPS,1 mg·L-1+ THC,1 μmol·L-1)、低劑量Ar+THC組(LAr,5 μmol·L-1+LPS,1 mg·L-1+THC,1 μmol·L-1)、高劑量Ar+THC組(HAr,10 μmol·L-1+LPS,1 mg·L-1+THC,1 μmol·L-1)，使用活性氧檢測試劑盒(CA1410;Beijing Solarbio Science &Technology Co.,Ltd.)，按照說明書進(jìn)行染色處理，通過Amnis FlowSight成像流式細(xì)胞儀檢測NRK-52e細(xì)胞中ROS水平。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測Ca2+水平經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)得到細(xì)胞樣本之后，使用Fluo-4 AM(F8500；Beijing Solarbio Science &Technology Co.，Ltd.)檢測NRK-52e細(xì)胞中Ca2+濃度。操作如下：收集細(xì)胞，PBS洗滌，離心并棄上清；加入500 μL工作液(Fluo-4 AM 1 mg+Pluronic 1.65 mg+HBSS 200 μL)于37 ℃避光孵育20 min；加入5倍體積的含有1% FBS的HBSS培養(yǎng)40 min；用HEPEs buffer saline 洗滌細(xì)胞1次，離心并棄上清，HEPEs buffer saline重懸細(xì)胞并制成1×108個細(xì)胞·L-1的細(xì)胞懸液；37 ℃培養(yǎng)10 min用于流式細(xì)胞儀檢測NRK-52e細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平同樣經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)得到細(xì)胞樣本之后，使用PE Annexin V/7-AAD凋亡檢測試劑盒(559763；BD PharmingenTM)檢測細(xì)胞凋亡水平，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行染色，用于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位 (MMP)水平同樣經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)得到細(xì)胞樣本之后，使用具有5,5′,6,6′-四氯-1,1,3,3′-四乙基苯并咪唑-碳氰化物碘的染料 (JC-1；GK3610；Genview;北京)進(jìn)行染色，并使用流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位水平。各組NRK-52e細(xì)胞用JC-1在37 ℃下染色20 min并使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。JC-1(紅色)代表正常細(xì)胞，線粒體膜電位降低后，JC-1解離，單體JC-1(藍(lán)色)代表其中線粒體膜電位降低的細(xì)胞。

1.8 In cell western檢測細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白及ERβ表達(dá)水平取對數(shù)生長期NRK-52e細(xì)胞，以2 000個細(xì)胞/孔接種于96孔黑板中(165305;Thermo fisher scientific，USA)，通過處理分組如“1.4”，小心吸凈培養(yǎng)液，加入細(xì)胞組織固定液150 μL后室溫孵育20 min，棄去細(xì)胞組織固定液，加入0.1% Triton-X-100 200 μL，在室溫慢搖5 min后棄去，重新加入0.1% Triton-X-100 200 μL后室溫慢搖5 min后棄去，連續(xù)重復(fù)5次；加入150 μL封阻液(含5% BSA的PBST)，在室溫進(jìn)行封閉60 min后加入50 μL一抗Bcl-2 (1 ∶200)、Bax (1 ∶250)、caspase-3 (1 ∶200)、caspase-9 (1 ∶200)，ERβ (1 ∶200)，室溫孵育30 min后于4 ℃冰箱過夜；PBST 200μL洗滌5遍，加入熒光二抗50 μL，室溫避光孵育1 h后，PBST洗滌4遍后，PBS洗滌1遍，采用近紅外雙色成像系統(tǒng)(ODSSEY)成像，Image studio軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.9 分子對接技術(shù)模擬Ar與ERβ的親和作用通過Chem Office制作化合物Ar的3D結(jié)構(gòu)，基于PDB數(shù)據(jù)庫 (https://www.rcsb.org/)下載ERβ的3D結(jié)構(gòu)，采用PyMOL軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行去水，提取配體等處理，Auto Dock 1.5.6軟件將關(guān)鍵蛋白及化合物pdb格式轉(zhuǎn)為pdbqt格式并尋找活性口袋，最后通過Vina進(jìn)行對接。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的LPS對NRK-52e細(xì)胞損傷的影響如Tab 1所示，與正常對照組相比，LPS(0.1、0.5、1、5、10 mg·L-1)可明顯降低NRK-52e細(xì)胞活力(P<0.01)，并且1 mg·L-1效果較為明顯。因此，選擇LPS(1 mg·L-1)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 Ar對NRK-52e細(xì)胞活力的影響如Tab 2所示，與LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞組相比，Ar(5、10、20、50 μmol·L-1)可明顯增強(qiáng)NRK-52e細(xì)胞活力(P<0.01或P<0.05)，并且5 μmol·L-1和10 μmol·L-1效果較好。因此，選擇Ar(5、10 μmol·L-1)用于進(jìn)一步機(jī)制探討。

Tab 1 Effect of LPS on NRK-52e cell viability n=4)

Tab 2 Effect of arbutin on LPS-induced

2.3 Ar對LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞ROS水平的影響運(yùn)用FlowSight成像流式細(xì)胞術(shù)檢測Ar對LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞中ROS水平的影響，結(jié)果如Fig 1所示，LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞中ROS水平明顯升高，Ar可有效降低模型組NRK-52e細(xì)胞中ROS水平。但是，在加入ERβ阻斷劑THC后，Ar作用明顯降低。

2.4 Ar對LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞Ca2+濃度的影響采用Fluo-4 AM探針檢測Ar對LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞Ca2+濃度的影響，結(jié)果如Fig 2所示，LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞Ca2+濃度明顯升高，Ar可有效降低LPS誘導(dǎo)的NRK-52e細(xì)胞中Ca2+濃度，但是THC可有效減弱Ar的作用。

2.5 Ar對LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞凋亡水平的影響采用Annexin V-PE/7-AAD進(jìn)行染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測Ar對LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞凋亡水平的影響，結(jié)果如Fig 3A所示，LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞凋亡水平明顯升高，Ar可有效抑制LPS誘導(dǎo)的NRK-52e細(xì)胞凋亡，但是THC可減弱Ar的作用；此外，通過成像流式細(xì)胞儀檢測Ar對LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響，結(jié)果如圖3B所示，LPS組NRK-52e細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞固縮，且Annexin V-PE/7-AAD熒光表達(dá)增強(qiáng)，Ar可有效改善細(xì)胞形態(tài)，并降低Annexin V-PE/7-AAD熒光表達(dá)，同樣，Ar的作用被THC減弱。

Fig 1 Effect of arbutin on level of ROS in LPS-induced

Fig 2 Effect of arbutin on levels of Ca2+ in LPS-induced NRK-52e cells n=3)

Fig 3 Effect of arbutin on apoptosis in LPS-induced NRK-52e cells n=3)

2.6 Ar對LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞線粒體膜電位的影響采用JC-1染色并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中線粒體膜電位水平，檢測原理為：細(xì)胞在正常狀態(tài)下，JC-1在線粒體中聚集并發(fā)出紅色熒光；一旦線粒體的膜電位發(fā)生改變，JC-1將會在線粒體中解離，產(chǎn)生綠色熒光，F(xiàn)CM可以很容易地監(jiān)測到熒光強(qiáng)弱的變化。結(jié)果如Fig 4所示，用LPS (1 mg·L-1)處理NRK-52e細(xì)胞24 h會導(dǎo)致線粒體膜電位降低，Ar可明顯提高NRK-52e細(xì)胞線粒體膜電位的水平。此外，THC可以阻斷Ar的作用。

2.7 Ar對LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞凋亡標(biāo)志物表達(dá)的影響通過In cell western技術(shù)檢測Ar對LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2表達(dá)水平，結(jié)果如Fig 5所示，LPS可誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞中caspase-3、caspase-9、Bax表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2表達(dá)水平明顯降低，Ar可明顯降低促凋亡蛋白caspase-3、caspase-9、Bax表達(dá)水平，提高抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平，但是在加入THC后Ar作用被阻斷。

2.8 分子對接模擬Ar與雌激素受體親和力分子對接結(jié)果如Fig 6所示，Ar與ERβ的親和力為-7.4 kJ·mol-1，其中Ar 1-OH、2′-OH、6′-OH分別與ERβ的305-GLU、298-LEU、472-GLY形成氫鍵相互作用。以結(jié)合能 ≤ -5.0 kJ·mol-1為標(biāo)準(zhǔn)[10]，該結(jié)果表明Ar和ERβ具有較好的結(jié)合活性。

2.9 Ar對LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞ERβ表達(dá)的影響結(jié)果如Fig 7所示，LPS可抑制NRK-52e細(xì)胞中ERβ表達(dá)，Ar可明顯誘導(dǎo)LPS引起的NRK-52e細(xì)胞中ERβ表達(dá)增加，但是在加入THC后Ar作用被阻斷。進(jìn)一步表明，Ar可能通過ERβ抑制LPS誘導(dǎo)的NRK-52e細(xì)胞凋亡。

3 討論

腎小管上皮細(xì)胞損傷是膿毒癥急性腎損傷發(fā)生發(fā)展較為重要的機(jī)制之一，常出現(xiàn)腎單位中腎小管上皮細(xì)胞凋亡[5]。LPS可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡而造成細(xì)胞損傷，細(xì)胞凋亡包括死亡受體途徑和線粒體途徑，線粒體凋亡途徑是主要的內(nèi)源性途徑，其起始于氧化應(yīng)激反應(yīng)[11]，膿毒癥急性腎損傷發(fā)生時，ROS在短時間內(nèi)大量產(chǎn)生，且抗氧化酶活性降低，誘導(dǎo)線粒體內(nèi)膜脂質(zhì)過氧化，促使Bax/Bcl-2進(jìn)入線粒體并誘導(dǎo)線粒體內(nèi)膜通透性增加[12]，開放線粒體轉(zhuǎn)換孔并釋放AIF后激活caspase-3，從而直接或間接地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；此外線粒體受損導(dǎo)致線粒體膜電位下降，同樣會進(jìn)一步激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究基于流式細(xì)胞術(shù)和In cell western技術(shù)檢測Ar對LPS誘導(dǎo)的NRK-52e細(xì)胞中ROS水平、線粒體膜電位和細(xì)胞凋亡水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ar可有效增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的NRK-52e細(xì)胞活力，降低模型組NRK-52e細(xì)胞中ROS水平，抑制cspase-3、caspase-9和Bax表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)增加并提高線粒體膜電位，從而表明Ar可抑制LPS誘導(dǎo)的NRK-52e細(xì)胞線粒體途徑凋亡。細(xì)胞中ROS大量增加會導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流[13]，且細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載會導(dǎo)致DNA鏈斷裂降解，并誘發(fā)腎組織功能損傷，參與急性腎損傷過程中的細(xì)胞凋亡反應(yīng)[14]。通過檢測Ca2+濃度結(jié)果表明，Ar可有效降低LPS誘導(dǎo)的NRK-52e細(xì)胞中Ca2+濃度。提示，Ar通過線粒體途徑并降低Ca2+濃度抑制LPS誘導(dǎo)的NRK-52e細(xì)胞凋亡。

Fig 4 Effect of arbutin on level of MMP in LPS-induced

Fig 5 Effects of arbutin on level of apoptosis markers in LPS-induced NRK-52e cells n=3)

Fig 6 The molecular docking mode for arbutin and ERβ

Fig 7 Effect of arbutin on level of ERβ in LPS-induced NRK-52e cells n=3)

前期研究結(jié)果表明，Ar通過ERβ發(fā)揮植物雌激素樣活性，是山藥發(fā)揮雌激素樣活性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[7]。雌激素是人體內(nèi)重要的甾體激素，具有保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[15]、心血管系統(tǒng)[16]，且可以改善LPS誘導(dǎo)的膿毒癥損傷[17]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌激素受體β特異性拮抗劑THC可減弱Ar對LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞損傷的干預(yù)作用，且Ar與ERβ具有較好的結(jié)合活性，由此可以推出，Ar可能通過ERβ抑制LPS誘導(dǎo)NRK-52e細(xì)胞凋亡。本研究為Ar用于急性腎損傷的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床治療急性腎損傷提供理論基礎(chǔ)。