張曉楓，姚 瑤，宋孝雄，邢婉青，喻 斌

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)是存在于腦和脊髓中的未分化細胞，具備自我更新和向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞分化的潛能[1]。1992年,Reynolds[2]從成鼠腦紋狀體分離得到NSCs，而且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在成年和胚胎哺乳動物腦中均有NSCs分布，此后，NSCs用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病及腦損傷修復(fù)的研究受到重視。離體細胞評價是藥理學(xué)研究的重要組成部分，但至今還沒有理想的可以替代原代NSCs的細胞株，因此獲得穩(wěn)定而高效的原代NSCs是進行后繼生理和藥理學(xué)研究的重要基礎(chǔ)和保障。原代細胞培養(yǎng)的困難主要在于細胞的純度、得率以及活性方面的控制，雖然已有文獻對NSCs的原代分離和細胞純化方法進行介紹[3]，但這些研究往往是對某一種既定的方法進行改良，而并沒有對不同分離方法，以及不同純化方法進行全面的評估。此外各文獻報道的培養(yǎng)條件差異很大[4-5]，這也必然導(dǎo)致其他研究者在條件選擇中的困惑。鑒于此，本次實驗對三種分離方法和兩種純化的方法進行比較，其結(jié)果可為其他學(xué)者的體外NSCs培養(yǎng)體系構(gòu)建提供技術(shù)支持。

1 材料

1.1 實驗動物出生24 h內(nèi)的ICR/Gpt小鼠，雌雄不限，由江蘇省集萃藥康生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK(蘇)2018-0008。

1.2 試劑和儀器Neurobasal培養(yǎng)基(批號：21177670)、B-27 Supplements(批號：2175187)、GlutaMAX(批號：2164675)、雙抗(批號：2145460)、胰酶(批號：2120917)均購于Gibco公司；堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)(批號：0315395-1)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)(批號：0819179)均購于PeproTech公司；小鼠巢蛋白(Nestin)抗體(批號：31016A32)、小鼠Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG(批號：2018207)均購于Invitrogen公司；多聚賴氨酸(Poly-L-lysine solution,PLL)(批號：RNBJ2237)、層粘連蛋白(Laminin)(批號：049M4183V)均購于Sigma公司；肝素鈉(批號：722I024)、胰蛋白酶抑制劑(批號：1028D062)、脫氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)(批號：623X034)、中性蛋白酶(Dispase)(批號：325U012)、木瓜蛋白酶(Papain)(批號：628L021)、D-無水葡萄糖(批號：526J022)、臺盼藍(批號：722I024)、曲拉通(Trition-100)(批號：829I0210)、細胞核染色液(DAPI)(批號：20200715)購于索萊寶公司。

超凈臺(SW-CJ-1F，蘇州市凈化公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(MCO-20AIC，日本SANYO公司)；熒光倒置顯微鏡(Ti-S，日本NIKON公司)；解剖顯微鏡(SZ51型日本OLYMPUS公司)；細胞計數(shù)儀(美國Countstar公司)；ImageQuant LAS4000mini成像系統(tǒng)(美國GE公司)。

2 方法

2.1 NSCs不同分離方法比較研究

2.1.1NSCs的分離 將新生24 h乳鼠分為3組，分別為機械吹打組(mechanical pipetting)、胰酶消化組(trypsin digestion)和PDD混合酶消化組[5](木瓜蛋白酶2.5 kU·L-1，中性蛋白酶1 kU·L-1，DNaseⅠ 250 kU·L-1，Papain-Dispase-DNase enzyme digestion，PDD)。各組乳鼠脫頸處死，75%乙醇中消毒5 min，剪開顱骨取出大腦，置于冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中，在解剖顯微鏡下去除腦膜、小腦、嗅球等，用預(yù)冷的PBS沖洗組織，吸去多余的PBS，隨后按照組別進行不同的分離操作。

(1)機械吹打組：腦組織用手術(shù)刀切碎至1 mm3，轉(zhuǎn)移到含有37 ℃預(yù)熱的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，用巴氏滴管吹打至無肉眼可見組織，過400目細胞篩得單細胞懸液，1 000 rpm，離心5 min，棄上清，加入1 mL完全培養(yǎng)基重懸細胞；(2)胰酶消化組：相同體積的碎腦組織轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的0.05%的胰酶[6]中，37 ℃消化7 min，加入0.125 g·L-1胰蛋白酶抑制劑(含0.01 g·L-1DNaseⅠ)混勻，離心，棄上清，加入5 mL完全培養(yǎng)基過篩，離心，加入1 mL完全培養(yǎng)基重懸細胞；(3)PDD混合酶消化組：相同體積的碎腦組織轉(zhuǎn)移至37 ℃預(yù)熱的PDD混合酶中，37 ℃消化20 min，輕輕吹打細胞后再次37 ℃消化20 min，用巴氏滴管吹打細胞，離心，棄上清，用混合緩沖液(1× HBSS，30 mmol·L-1葡萄糖，2 mmol·L-1HEPES緩沖液，26 mmol·L-1NaHCO3)重懸細胞并過篩，離心，加入1 mL完全培養(yǎng)基重懸細胞。

以上重懸細胞分別用臺盼藍染色，計數(shù)總細胞數(shù)及存活率。

2.1.2NSCs的培養(yǎng)和神經(jīng)球直徑的檢測 采用無血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，其中Neurobasal培養(yǎng)基中包含2%B27、1%GlutaMAX、2 mg·L-1肝素、20 μg·L-1EGF、20 μg·L-1bFGF和1%青鏈霉素。將分離出的單細胞密度調(diào)整為1.0×109·L-1，于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)原代培養(yǎng)5 d，每2 d半量換液，并于1、3、5 d檢測神經(jīng)球直徑。

2.1.3NSCs的活性和增殖檢測 在96孔板內(nèi)把三種不同分離方法總細胞數(shù)以2×108·L-1密度接種，每組5個復(fù)孔，分別在1、5 d向細胞懸液中加入10%CCK-8試劑，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。

2.1.4Western blot檢測Nestin蛋白含量 將培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)5 d的細胞取出，RAPI裂解液提取細胞總蛋白后進行蛋白質(zhì)定量(BCA法)，等量蛋白進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，4 ℃孵育一抗過夜，TBST洗膜后室溫孵育二抗，再次洗膜3次，顯色成像，利用ImageJ進行灰度和面積計算。以NSCs標(biāo)志物Nestin和Actin的比值代表Nestin相對表達量，以間接反映NSCs的純度。

2.2 NSCs不同純化方法比較研究為了讓純化方法的結(jié)果齊同可比，我們選擇機械吹打法分離原代NSCs，然后分別采用過篩法和差速離心法純化NSCs。

2.2.1過篩法 原代神經(jīng)球直徑達100 μm左右，通過200目細胞篩去除雜細胞，顛倒篩子，基礎(chǔ)培養(yǎng)基將神經(jīng)球沖洗下來，離心，棄上清，0.05%胰酶消化，以5×107·L-1密度接種到包被的24孔板的爬片內(nèi)，待細胞貼壁成球后，熒光鑒定雜細胞數(shù)。

2.2.2差速離心法 每2～3 d換液時，分別使用1 000、800、500 rpm離心，獲得神經(jīng)球，去除雜細胞，最后同樣使用0.05%胰酶消化成單細胞懸液，以5×107·L-1密度接種，待細胞貼壁成球后，熒光鑒定雜細胞數(shù)。

2.2.3Nestin/DAPI雙染法檢測NSCs純度 提前用PLL/Laminin包被24孔板內(nèi)的蓋玻片，將單細胞以5×107·L-1的密度接種，培養(yǎng)5 d后，PBS洗去殘留培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗后加0.25%Trition-100室溫下透膜15 min，清洗，用1%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h，吸去封閉液，加入一抗(1 ∶100兔抗鼠Nestin抗體)4 ℃孵育過夜，PBS清洗，加入二抗(1 ∶500山羊抗兔488抗體)，37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗，滴加DAPI避光染色10 min，PBS清洗，滴加抗熒光淬滅液封片，在熒光顯微鏡下觀察并隨機選取5個視野拍照，以Nestin陽性細胞數(shù)與DAPI陽性細胞數(shù)的比值反應(yīng)NSCs的純度。

3 結(jié)果

3.1 不同分離方法的原代NSCs生長情況比較原代培養(yǎng)5 d，分別觀察1、3和5 d神經(jīng)球生長情況(Fig 1A)并測量神經(jīng)球的直徑(Fig 1B)，提示PDD混合酶消化組得到的NSCs成球速度較機械吹打組和胰酶消化組更快(P<0.01)。

Fig 1 Comparison of three separation methods in neurosphere’s growth situation on day 1,day 3 and day 5 n=3)

3.2 不同分離方法的原代NSCs活性和增殖情況比較3種分離方法都能得到大量的NSCs，臺盼藍染色計數(shù)后，與機械吹打組相比，胰酶消化組(P<0.05)和PDD混合酶消化組得到細胞的存活率更高(P<0.01)(Tab 1)，CCK-8活性檢測結(jié)果顯示(Fig 2)，機械吹打組和胰酶消化組的吸光度低于PDD混合酶消化組，且差異具有顯著性(P<0.01)；Fig 3結(jié)果顯示，d 5，機械吹打組和胰酶消化組的吸光度明顯低于PDD混合酶消化組，差異具有顯著性(P<0.01)，提示PDD混合酶消化所得細胞活性更高，增殖更快。

Tab 1 Total cell count and survival rate of three primary

3.3 不同分離方法的原代NSCs的Western Blot檢測結(jié)果如Fig 4所示，d 5，Western blot結(jié)果顯示，胰酶消化法和PDD酶消化法Nestin蛋白含量表達高于機械吹打法(P<0.05)。

Fig 2 Activity of primary cells on day 1 n=3)

Fig 3 Activity of primary cells on day 5 n=3)

Fig 4 The protein expression of Nestin and Actin by each separation method on day 5 n=3)

3.4 不同分離方法的原代NSCs純度比較結(jié)果對原代培養(yǎng)5 d的細胞進行Nestin/DAPI雙染，觀察到Alexa Fluor 488標(biāo)記Nestin發(fā)綠光，有細胞染色為陽性，確定為NSCs，只標(biāo)記DAPI發(fā)藍色熒光的細胞為雜細胞，其中3種分離方法的雜細胞數(shù)差異沒有顯著性(Fig 5A,B)。

Fig 5 Immunofluorescence staining of nestin in separating and purifing primary n=3)

3.5 兩種純化方法的NSCs熒光鑒定結(jié)果對兩種純化方法得到的NSCs進行Nestin免疫熒光染色，如Fig 5C,D所示，兩種純化方法的Nestin陽性率均高于原代NSCs(P<0.05)。

4 討論

目前，分離NSCs常用的方法包括機械吹打法、胰酶消化法，但前者的分離方法得到的細胞存活率低，后者酶的濃度、消化時間難控制；純化方法包括連續(xù)傳代法、有限稀釋法[5]、免疫磁珠法[12]等，但這些純化方法周期長、價格昂貴。本文在現(xiàn)有的分離和純化方法上進行比較，得到原代NSCs存活率更高的分離方法和操作簡便且純度高的純化方法。

3種分離方法中，機械吹打法雖然獲得的細胞數(shù)多，但細胞的存活率低、NSCs成球速度慢，在實驗操作中吹打至肉眼見不到組織即可，不可過度吹打；胰酶消化法中使用0.05%的胰酶，對乳鼠疏松的腦組織損傷更??；PDD混合酶[7]消化作用溫和，對NSCs的損傷較其他兩種方法小，且得到的NSCs成球速度快，且這次研究對該方法進行了優(yōu)化，現(xiàn)有的該方法用于成年小鼠DG區(qū)域NSCs的分離，步驟繁瑣耗時，因此，優(yōu)化其步驟，縮短分離時間可以最大限度保證細胞活性。此次研究采用過篩法和差速離心法純化NSCs，兩種純化方法Nestin鑒定證實兩種方法均能有效純化NSCs，為了減少過篩法中細胞的損失，多次使用培養(yǎng)基吹打收集篩網(wǎng)上的神經(jīng)球；換液時可以根據(jù)神經(jīng)球的大小改變離心速度，從而差速離心出神經(jīng)球，去除單細胞或組織碎片，純化NSCs。Nestin是神經(jīng)干細胞特異性標(biāo)志物，文中主要使用免疫熒光雙染法鑒定神經(jīng)干細胞，具有特異性強、速度快的優(yōu)點，較傳統(tǒng)的DAB顯色法[13]得到的圖片更清晰。

目前，大量實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn),NSCs移植可以分化為神經(jīng)元并逐漸替代變性神經(jīng)元，保護神經(jīng)元免受興奮性毒性損傷，還可以通過產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子，改善疾病癥狀，從而治療各種神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷性疾病，如帕金森病[7-8]、阿爾茨海默病[9]、亨廷頓病[10]、中風(fēng)[11]等。因此，比較神經(jīng)干細胞在體外分離、維持、擴增的最佳培養(yǎng)方法，能夠更詳細地探索其性質(zhì)以及調(diào)節(jié)它們的機制，把基礎(chǔ)研究應(yīng)用到臨床。