何 彬,高藝源,施聲淦,蔣培都

(1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610054；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院/電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072)

常染色體顯性遺傳性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是一種遺傳性腎囊腫疾病，其病理特征為腎小管上皮細(xì)胞異常增殖，逐漸形成充滿液體的囊泡，導(dǎo)致雙側(cè)腎臟進(jìn)行性增大。ADPKD的致病機(jī)制復(fù)雜，PKD1基因突變(約占85%)和PKD2基因突變(約占15%)均可引起ADPKD。它多于成年后發(fā)病，發(fā)病率高(約為1/400～1/1 000)，是終末期腎病的主要病因之一，同時(shí)伴有多種腎外并發(fā)癥，包括肝囊腫、顱內(nèi)動脈瘤和心臟瓣膜病等[1]。目前，ADPKD發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，確切的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

自噬是細(xì)胞中一類依賴于溶酶體的物質(zhì)降解途徑，是在應(yīng)激狀態(tài)下維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和存活的重要機(jī)制。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激刺激，如輻射、饑餓、缺氧和細(xì)菌入侵等多種情況下，自噬降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生氨基酸和脂肪酸，用于合成新的蛋白質(zhì)或?yàn)槟芰垦h(huán)再利用提供原料[2]。近年來研究表明，自噬活性的失調(diào)已成為影響ADPKD發(fā)生、發(fā)展的重要因素。因此，明確自噬在ADPKD疾病過程中發(fā)揮的作用，有助于促進(jìn)ADPKD研究的進(jìn)一步發(fā)展。

1 自噬與ADPKD

自噬是指細(xì)胞內(nèi)的長壽蛋白、錯(cuò)誤折疊蛋白和受損細(xì)胞器經(jīng)溶酶體途徑被降解的過程，在進(jìn)化上高度保守。自噬分為3種類型：大自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)：1)大自噬：大自噬是最典型的自噬形式。當(dāng)細(xì)胞受到環(huán)境和生理刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)隔離膜，并延伸包裹需要降解的胞質(zhì)成分，形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。自噬體與溶酶體融合產(chǎn)生自噬溶酶體，其中的溶酶體水解酶將降解自噬溶酶體內(nèi)膜和包被物；2)微自噬：是指溶酶體膜直接通過膜內(nèi)陷包裹并轉(zhuǎn)運(yùn)底物到腔內(nèi)降解的過程；3)CMA：具體形式是胞質(zhì)內(nèi)的底物與分子伴侶結(jié)合，被溶酶體膜上的特異性受體識別，隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中降解[2]。CMA的特征是底物直接通過溶酶體膜上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物到溶酶體腔內(nèi)。自噬作為一種主要的降解途徑，在多種情況下發(fā)揮著重要作用，包括腫瘤抑制、病原體消除、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞存活等[3]。自噬受損的細(xì)胞中，損傷的細(xì)胞器和變性蛋白質(zhì)將會持續(xù)蓄積，繼而破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；自噬過度誘導(dǎo)的細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)和正常的細(xì)胞器將會降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡。因此，自噬功能失調(diào)可能影響包括ADPKD在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展。

1.1 ADPKD中的自噬受損現(xiàn)象目前，就ADPKD與自噬關(guān)系的研究結(jié)論還不是非常確定，Zhu等[4]從胚胎期14.5 dPkd1-/-小鼠和Pkd1+/+小鼠胚內(nèi)分離腎上皮細(xì)胞，經(jīng)自噬抑制劑巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1)處理后，發(fā)現(xiàn)與Pkd1+/+小鼠腎上皮細(xì)胞相比，Pkd1-/-小鼠腎上皮細(xì)胞中自噬體標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)減弱，自噬功能受損。Rowe等[5]從Pkd1-/-和Pkd1+/+小鼠胚胎中分離出小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast cells,MEFs)，Pkd1+/+MEF細(xì)胞在經(jīng)饑餓培養(yǎng)后，細(xì)胞通過誘導(dǎo)自噬以維持細(xì)胞存活，具體表現(xiàn)為LC3-Ⅱ的表達(dá)增強(qiáng)和自噬小體數(shù)量增加，而Pkd1-/-MEF細(xì)胞中自噬水平并無變化，凋亡反應(yīng)增強(qiáng)。研究者用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin)處理Pkd1-/-細(xì)胞部分恢復(fù)自噬后，提高了饑餓培養(yǎng)的細(xì)胞存活率，證明多囊腎細(xì)胞中正常自噬功能發(fā)生障礙。在Pkd1基因缺失的動物模型中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，Belibi等[6]使用雄性Han:SPRD(cy/+)大鼠(ADPKD模型)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)巴弗洛霉素A1抑制自噬后，可提高野生型Han:SPRD(+/+)大鼠腎臟中LC3-Ⅱ的表達(dá)，但對Han:SPRD(cy/+)大鼠腎臟中的LC3-Ⅱ表達(dá)并無明顯影響。Chou等[7]通過構(gòu)建Pkd1-miRNA轉(zhuǎn)基因小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在小鼠腎臟中自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)降低，并且腎囊腫襯里細(xì)胞中的自噬性底物p62蛋白出現(xiàn)蓄積，證明小鼠腎囊腫襯里細(xì)胞中正常自噬流受阻。上述研究表明，ADPKD發(fā)生發(fā)展過程中存在自噬受損現(xiàn)象。

1.2 ADPKD中的自噬增強(qiáng)現(xiàn)象另有研究表明,ADPKD發(fā)生發(fā)展過程中存在自噬增強(qiáng)現(xiàn)象。Tanaka等[8]使用基因靶向技術(shù)破壞小鼠Aqp11基因構(gòu)建小鼠多囊腎模型，通過PCR分析發(fā)現(xiàn)，小鼠形成腎囊腫后，編碼LC3和其他自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)增加，在使用綠色熒光蛋白標(biāo)記LC3的Aqp11-/-小鼠近段小管細(xì)胞中GFP-LC3陽性點(diǎn)的數(shù)量也增加了。這一證據(jù)表明細(xì)胞自噬增強(qiáng)現(xiàn)象存在于Aqp11-/-小鼠腎囊腫的形成過程中。Morleo等[9]觀察到出生14 d后的Ofd1fl/y;creKsp小鼠腎小管逐漸擴(kuò)張，隨后生成腎囊腫，并伴隨有細(xì)胞自噬水平升高現(xiàn)象；為確定自噬在腎囊腫生成中的作用，研究者敲除了Ofd1fl/y;creKsp小鼠的自噬關(guān)鍵基因Atg7，發(fā)現(xiàn)與對照組小鼠相比，Ofd1fl/y;Atg7fl/fl;creKsp小鼠的腎囊腫數(shù)量顯著減少。Lee等[10]使用來自人類ADPKD樣本的微陣列數(shù)據(jù)集(GSE7869和GSE35831)檢測了自噬相關(guān)基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)幾乎2/3的ATG基因在ADPKD人類樣本中高表達(dá)，通過免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)LC3蛋白在ADPKD樣本中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在非ADPKD組織中LC3蛋白較少表達(dá)，但在某些ADPKD樣本中LC3蛋白表達(dá)較強(qiáng)，在使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)處理Ift46f/f;HoxB7cre小鼠(ADPKD小鼠模型)后，小鼠腎囊腫體積顯著減小。這些研究證明，在ADPKD的發(fā)生發(fā)展過程中自噬增強(qiáng)使腎囊腫數(shù)量增加，而抑制自噬水平增加能延緩囊腫生成。

2 影響自噬相關(guān)途徑的抗ADPKD藥物

ADPKD是最常見的單基因遺傳性腎臟疾病之一，其主要致病基因是PKD1(編碼PC1)和PKD2(編碼PC2)[1]。在ADPKD患者體內(nèi)的PKD1和PKD2突變將會引起多囊蛋白1(polycystin-1，PC1)與多囊蛋白2(polycystin-2，PC2)缺陷，從而影響了參與自噬調(diào)節(jié)的多條信號通路。ADPKD模型中自噬功能失調(diào)現(xiàn)象也啟發(fā)研究者進(jìn)行了一系列關(guān)于藥物調(diào)節(jié)自噬的研究。針對調(diào)節(jié)自噬信號途徑(Fig 1)的抗ADPKD藥物在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出巨大治療潛力。

2.1 經(jīng)mTOR依賴性途徑影響自噬的藥物哺乳動物雷帕霉素靶標(biāo)(mammalian target of rapamycin，mTOR)是PI3K相關(guān)蛋白激酶家族中的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，組成mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合物。mTOR在自噬誘導(dǎo)的早期過程中起關(guān)鍵作用，其活性主要受生長因子、饑餓等因素調(diào)節(jié)[11]。目前在多種ADPKD動物模型中發(fā)現(xiàn)mTOR途徑被激活，而抑制mTOR途徑可調(diào)節(jié)自噬活性，有效減少動物模型中的腎臟細(xì)胞增殖與囊腫生長。

Fig 1 Major autophagy pathway

Tab 1 Effects of autophagy regulatory medicines in ADPKD

2.1.1mTOR抑制劑 mTOR抑制劑可通過抑制mTOR活性，上調(diào)自噬標(biāo)記因子如ULK1、Beclin-1、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Atg3/5/7/12等誘導(dǎo)自噬。盡管在動物實(shí)驗(yàn)中mTOR抑制劑表現(xiàn)出可延緩腎臟囊腫腫大的作用，但是在兩個(gè)使用不同mTOR抑制劑的臨床試驗(yàn)中，mTOR抑制劑并沒有顯著延緩患者的疾病進(jìn)程。Perico等[12]將21例患者隨機(jī)納入6個(gè)月的雷帕霉素治療組和常規(guī)治療組。結(jié)果表明，與治療前相比，雷帕霉素治療后總腎體積(total kidney volume,TKV)平均增加大小小于常規(guī)治療，但兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Walz等[13]將433例ADPKD患者隨機(jī)分配給安慰劑組或mTOR抑制劑依維莫司組，接受每天兩次2.5 mg劑量的依維莫司或等量片劑的安慰劑;結(jié)果顯示,依維莫司治療1年后，TKV下降，但在治療2年后TKV并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。出現(xiàn)以上結(jié)果的原因可能是mTOR抑制劑使用劑量過高，患者無法耐受高劑量mTOR抑制劑的腎毒性和非腎副作用。但mTOR抑制劑在ADPKD的治療中仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的治療潛力，研究發(fā)現(xiàn)自噬誘導(dǎo)劑姜黃素通過抑制STAT3途徑和mTOR途徑來抑制Pkd1-/-小鼠的囊腫發(fā)生，可有效延緩Pkd1-/-小鼠的腎功能衰竭，相關(guān)研究表明,這兩個(gè)信號通路在自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮主要作用，使用姜黃素抑制mTOR調(diào)節(jié)自噬活性有助于ADPKD的治療[14]。由此可見，使用mTOR抑制劑增強(qiáng)腎細(xì)胞中的自噬水平可能是治療ADPKD的有效策略之一。

2.1.2經(jīng)PI3K/Akt-mTOR途徑影響自噬的藥物 生長因子主要通過PI3K/Akt-mTOR途徑調(diào)節(jié)mTOR活性。磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)是由調(diào)節(jié)亞基(p85)和催化亞基(p110)組成的異二聚體。正常情況下，生長因子激活酪氨酸受體，活化的酪氨酸激酶通過磷酸化其底物蛋白來聚集PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85激活PI3K?；罨腜I3K在磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(phosphoinositide dependent kinase-1，PDK1)的協(xié)同下磷酸化Akt，進(jìn)一步激活mTORC1，最終促進(jìn)細(xì)胞生長和蛋白合成。研究表明,熱休克蛋白(heat shock protein,Hsp)抑制劑可通過抑制Akt-mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬，Seeger-Nukpezah等[15]使用Cre-loxP系統(tǒng)條件性敲除Pkd1基因獲得Pkd1-/-小鼠，通過每周給予Hsp90抑制劑STA-2842，持續(xù)時(shí)間超過10周可顯著減少初始腎囊腫的形成和腎臟腫大，表明Hsp抑制劑對疾病進(jìn)程的延緩作用可能與自噬調(diào)節(jié)有關(guān)。此外，奧曲肽可通過Akt/mTOR/p70S6K信號通路誘導(dǎo)自噬，顯著增加腎臟細(xì)胞中自噬體的形成；Perico等[16]將100例成人ADPKD患者隨機(jī)分為長效緩釋奧曲肽治療組(51例)和安慰劑組(49例)，治療組每28 d肌肉注射20 mg長效緩釋奧曲肽；對照組每28 d肌肉注射0.9%氯化鈉溶液，分別觀察1年和3年。結(jié)果顯示治療組患者TKV增長速率均明顯減緩。由此可見，使用藥物通過PI3K/Akt-mTOR途徑上調(diào)自噬水平可有效減輕腎臟囊腫的形成。

2.1.3經(jīng)AMPK-mTOR途徑影響自噬的藥物 營養(yǎng)物質(zhì)、能量對mTOR的調(diào)節(jié)主要通過AMPK-mTOR途徑。AMPK是重要的能量傳感器，AMPK分子由催化α亞基和調(diào)節(jié)性β、γ亞基以異三聚體復(fù)合物的形式組成。α活化環(huán)內(nèi)的Thr172的磷酸化可使AMPK活化程度最大化，該位點(diǎn)可被上游激酶肝激酶B1(liver kinase B1，LKB1)和Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶激酶β(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase-β，CaMKKβ)直接磷酸化，影響下游通路。有研究[17]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)AMP/ATP比值或者升高Ca2+的濃度時(shí)，鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶CaMKKβ會出現(xiàn)磷酸化，從而產(chǎn)生磷酸化的AMPK，進(jìn)而通過抑制結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1/2(tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2)和mTORC1的活性，提高細(xì)胞內(nèi)的自噬水平。Shi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，人永生化囊腫襯里上皮細(xì)胞(OX161細(xì)胞)在使用肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP酶泵抑制劑柴胡皂苷d處理后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子積累，進(jìn)而激活CaMKK-AMPK-mTOR信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，抑制了細(xì)胞增殖。Sun等[19]在使用一種組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)曲古抑菌素A(TSA)處理Pkd-/-細(xì)胞后，AMPK被激活，進(jìn)而抑制mTOR活性，導(dǎo)致細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平增加，減慢了Pkd-/-細(xì)胞的囊腫生長速度。Chang等[20]在pkd2-/-斑馬魚中觀察到，二甲雙胍處理后前腎中AMPK的磷酸化水平和自噬水平顯著提高，斑馬魚42%～61%的前腎囊腫形成被抑制，前腎導(dǎo)管中細(xì)胞增殖減少。這些研究證明，多種經(jīng)AMPK-mTOR途徑影響自噬活性的藥物，具有抑制ADPKD囊腫生成的作用。

2.2 mTOR非依賴性途徑影響自噬的藥物盡管mTOR依賴性途徑在ADPKD的治療中表現(xiàn)出較強(qiáng)的治療潛力，但是藥物靶向mTOR途徑誘導(dǎo)自噬會產(chǎn)生很多不良反應(yīng)，因此靶向其他途徑調(diào)節(jié)自噬是一個(gè)新選擇。最新的研究[4]顯示，在pkd1a-/-斑馬魚模型中聯(lián)合應(yīng)用低劑量西羅莫司和卡馬西平可有效延緩疾病的發(fā)展，治療效果與高劑量西羅莫司相當(dāng)，提示使用低劑量mTOR抑制劑和其他非mTOR作用靶點(diǎn)的藥物聯(lián)合調(diào)節(jié)自噬活性可能是一個(gè)新的ADPKD治療方向。

2.2.1經(jīng)Beclin-1途徑影響自噬的藥物 哺乳動物beclin 1蛋白是酵母自噬相關(guān)蛋白(autophagy associated protein，Atg)6/液泡分選蛋白30(vacuolar protein sorting 30，Vps30)的同源蛋白。Beclin 1主要位于反面高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，通過與Vps34相互作用，介導(dǎo)了自噬體的形成。Beclin 1與PI3KC3/VPS34復(fù)合體的激酶激活將會促進(jìn)了PI3KC3的產(chǎn)生，從而在隔離膜的延伸、貨物的募集和自噬體的成熟中發(fā)揮重要作用?？沟蛲龅鞍譈cl-2可通過調(diào)節(jié)beclin 1和VSP34之間的解離作用，以此來影響自噬活性[21]。Pea-Oyarzun等[22]最近報(bào)道了PC2過表達(dá)可增加其與beclin 1的相互作用來誘導(dǎo)自噬。Zhu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在pkd1a-/-斑馬魚模型中，通過敲低自噬相關(guān)基因Atg5抑制自噬會增加囊腫的形成，而使用Beclin-1肽誘導(dǎo)自噬可有效延緩囊腫的形成。以上研究表明，通過Beclin-1途徑增強(qiáng)自噬也是延緩ADPKD中囊腫形成的有效策略之一。

2.2.2經(jīng)自噬-溶酶體途徑影響自噬的藥物 當(dāng)細(xì)胞遭受饑餓、溶酶體應(yīng)激、線粒體損傷等因素刺激時(shí)，定位于溶酶體膜上的TFEB發(fā)生去磷酸化和核易位，顯著增加了下游包括LC3、組織蛋白酶、溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP1)等自噬-溶酶體途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了溶酶體生成。溶酶體與自噬體融合形成自噬溶酶體，其中的溶酶體酶會降解自噬溶酶體內(nèi)膜和包被物，最終產(chǎn)生的降解產(chǎn)物通過膜滲透回到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行再利用[23]。Peintner等[24]使用Pkd1-/-小鼠的腎髓內(nèi)集合管細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了Pkd1缺失使鈣蛋白酶(calpain，CAPN)的活性增加，從而導(dǎo)致溶酶體酸化減少，LAMP1降解以及組織蛋白酶的活性降低，影響自噬溶酶體融合，抑制細(xì)胞中的正常自噬流。有趣的是，TFEB介導(dǎo)的溶酶體發(fā)生途徑并不受Pkd1缺失的影響，這可能解釋了為什么通過TFEB誘導(dǎo)自噬的海藻糖不能減緩Pkd1-/-小鼠的腎囊腫生長[7]。盡管這些證據(jù)表明，減少ADPKD模型中對自噬-溶酶體途徑的抑制可能是抑制腎囊腫生成的有效手段，但仍存在與以上結(jié)論相矛盾的證據(jù)。Hofher等[25]發(fā)現(xiàn)ADPKD錯(cuò)義突變體PC2/TRPP2(D511V)會極大地降低TRPP2蛋白的穩(wěn)定性，通過自噬抑制劑氯喹抑制自噬體與溶酶體的融合，可提高TRPP2的蛋白水平，改善了突變體的表型。由此可見，ADPKD囊腫生成過程與自噬密切相關(guān)，調(diào)節(jié)自噬-溶酶體途徑可有效地影響ADPKD的疾病進(jìn)程。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，自噬作為一種重要的細(xì)胞內(nèi)降解途徑，在ADPKD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，使用藥物調(diào)節(jié)和干預(yù)自噬信號通路可有效地延緩ADPKD的囊腫生成。但是目前大量研究表明ADPKD進(jìn)程中存在著自噬受損和自噬誘導(dǎo)兩種相矛盾的現(xiàn)象，可能影響自噬調(diào)節(jié)藥物在ADPKD治療上的使用。造成這些研究存在差異的原因可能是以下兩方面：①不同的研究使用了不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停m然這些模型的表型都是腎臟形成腎囊腫，最終導(dǎo)致腎臟進(jìn)行性增大，但是不同模型的造模方式不同，可能導(dǎo)致研究結(jié)果存在不同。②在以往的研究中LC3是主要考察指標(biāo)，然而考慮到不同研究之間的差異，單一考察指標(biāo)不足以反映真實(shí)的自噬水平。因此，需要在以后的研究中使用更加合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停訌?qiáng)對ADPKD發(fā)病機(jī)制的理解；同時(shí)在蛋白水平上分析更多的自噬相關(guān)蛋白，以全面了解ADPKD中的自噬水平。這將有助于明確自噬在ADPKD疾病過程中發(fā)揮的作用，吸引研究者做出更進(jìn)一步的研究，為ADPKD的藥物治療開辟新的領(lǐng)域。