張忠平,叢 宇,張海月,馬政濤,劉芷妤,尹繼芳

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院,黑龍江 哈爾濱150036)

中風(fēng)為全球常見(jiàn)病之一,具有高發(fā)病率、高殘疾率、高死亡率和不良預(yù)后特點(diǎn)[1]。缺血性中風(fēng)(ischemic stroke,IS)患病率逐年上升[2]。目前,影響中風(fēng)后恢復(fù)的主要因素是感染[3],針對(duì)IS后感染的相關(guān)研究仍未闡明其發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制。針刺療法普遍應(yīng)用于IS的恢復(fù)期治療,效果良好[4],但其科學(xué)內(nèi)涵尚不清楚。因此,尋找IS預(yù)防與治療的新靶點(diǎn),開(kāi)展有效的個(gè)體化治療是亟須開(kāi)展的工作。本研究基于腦-腸-脊髓軸探討針刺療法對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型大鼠腸道菌群的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～10 周齡的雄性Wistar 大鼠50只,體質(zhì)量250～300 g,SPF 級(jí)。所有大鼠由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(黑)2019-001],飼養(yǎng)在黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的動(dòng)物養(yǎng)殖室,并按照實(shí)驗(yàn)要求,控溫、給食、給水,適應(yīng)飼養(yǎng)7 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào):H20201001),按照研究方案進(jìn)行。適應(yīng)飼養(yǎng)后按照隨機(jī)數(shù)字表法分成針刺組、手法組、電針組、對(duì)照組、假手術(shù)組,每組10只,體質(zhì)量(280±20)g。若大鼠中途死亡則另選備用。

2 模型制備

針刺組、手法組、電針組采用改良線栓法[5]誘發(fā)局灶性腦缺血,制備MCAO 模型,制備后2 h拔出制備線恢復(fù)灌注。假手術(shù)組:進(jìn)行MCAO 模型制備的手術(shù)操作,但不進(jìn)行再灌注。對(duì)照組:未執(zhí)行任何操作。

3 穴位、針具選擇

穴位:百會(huì)、膈俞、脾俞、腎俞、后三里。穴位選擇和針刺方法參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]。根據(jù)大鼠的分組和編號(hào),每組大鼠將在每日的固定時(shí)間按順序進(jìn)行干預(yù)。針具:0.25 mm×25 mm 安迪牌一次性使用無(wú)菌針灸針[貴州安迪藥械有限公司,黔食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第2270027號(hào)]。電針:華佗牌SDZ-V 型電針治療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司,蘇械注準(zhǔn)20172270675)。

3 干預(yù)方案

3.1 針刺組 固定MCAO 模型大鼠,選取以上穴位,75%乙醇溶液常規(guī)皮膚消毒,術(shù)者右手持針灸針,推針?biāo)俅倘胙?行捻轉(zhuǎn)行針?lè)? min,針下有緊滯感后,不做任何操作,留針15 min,每日1次,連續(xù)14 d。

3.2 手法組 固定MCAO 模型大鼠,選穴同上,消毒同上。術(shù)者右手持針,推針?biāo)俅倘胙?行捻轉(zhuǎn)行針?lè)? min。針下得氣后,行搓針手法,達(dá)到氣滿針搖為宜。留針15 min,每日1次,連續(xù)14 d。

3.3 電針組 固定MCAO 模型大鼠,選穴同上,消毒同上。術(shù)者右手持針,推針?biāo)俅倘胙?行捻轉(zhuǎn)行針?lè)? min,針下有緊滯感后,給予同側(cè)膈俞、腎俞穴接電針治療儀,膈俞接正極,腎俞接負(fù)極,斷續(xù)波,頻率2～10 Hz,通電15 min,每日1次,連續(xù)治療14 d。

3.4 假手術(shù)組 每日陪同抓取、捆綁固定15 min,不進(jìn)行針刺操作,連續(xù)14 d。

3.5 對(duì)照組 每日陪同抓取、捆綁固定每次15 min,不做任何針刺治療,連續(xù)14 d。

4 實(shí)驗(yàn)觀察

4.1 標(biāo)本采集 干預(yù)后,收集不同組大鼠的糞便和肺組織,并采用16 S r DNA 測(cè)序技術(shù)檢測(cè)腸和肺菌群的豐度和多樣性。

4.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料不符合正態(tài)分布時(shí)以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(QR)]表示,采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以只(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4.3 結(jié)果

(1)腸道菌群豐度結(jié)構(gòu)變化情況 在糞便組織中主要檢測(cè)到的前5類(lèi)菌門(mén),依次為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)。針刺組、手法組、電針組厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、梭桿菌門(mén)豐度均高于假手術(shù)組和對(duì)照組(P＜0.05),且手法組高于針刺組、電針組(P＜0.05)。針刺組、手法組、電針組擬桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)豐度均低于假手術(shù)組和對(duì)照組(P＜0.05),且手法組低于針刺組、電針組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 5組大鼠腸道菌群豐度結(jié)構(gòu)變化情況[%,M(QR)]

(2)肺內(nèi)菌群豐度變化情況 在肺組織中主要檢測(cè)到的前5類(lèi)菌屬,依次為乳酸桿菌、放線菌、瘤胃球菌、梭桿菌、大腸桿菌。針刺組、手法組、電針組乳酸桿菌、放線菌、瘤胃球菌、梭桿菌、大腸桿菌豐度均低于假手術(shù)組和對(duì)照組(P＜0.05),且手法組低于針刺組、電針組(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 5組大鼠肺內(nèi)菌群豐度變化情況[%,M(QR)]

5 討論

中風(fēng)病在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率逐年增高,中風(fēng)主要并發(fā)癥是肺炎或肺部感染[7]。細(xì)菌感染在中風(fēng)患者中非常普遍。盡管微量吸入物在中風(fēng)后肺炎中有潛在的作用,但研究發(fā)現(xiàn),在中風(fēng)后發(fā)生感染的患者身上檢測(cè)到的多數(shù)微生物是腸道中常見(jiàn)的共生細(xì)菌,通過(guò)高通量16 S rDNA 基因擴(kuò)增序列的確定和生物信息學(xué)分析,證明針刺療法可以有效地調(diào)節(jié)腸道菌群[8]?；诖?筆者課題組推測(cè)“針刺療法可以通過(guò)腦-腸-脊髓軸調(diào)節(jié)大腦,腸道和菌群”。腦-腸-脊髓軸由腸道菌群、腸道和神經(jīng)系統(tǒng)組成,包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、下丘腦-垂體-腎上腺軸、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽、腸道微生態(tài)、血腦屏障。這3個(gè)系統(tǒng)相互作用,調(diào)節(jié)一系列的病理、生理活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)系統(tǒng)可通過(guò)腸固有層的神經(jīng)元、免疫細(xì)胞直接影響腸道菌群分泌信號(hào)傳導(dǎo)因子,從而間接調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)和分泌功能,有效調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境[9]。由于DNA測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,近年來(lái)對(duì)微生物區(qū)系的研究,特別是對(duì)腸道微生物區(qū)系的研究,引起了醫(yī)學(xué)界的高度重視。研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群失衡是影響IS的重要代謝機(jī)制,通過(guò)有效調(diào)節(jié)腸道菌群可以影響腸外靶器官(如心、腦、腎等)的功能[10]。調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的新方法將成為IS治療的新方向,但是腸道菌群介導(dǎo)的免疫炎癥細(xì)胞因子和神經(jīng)遞質(zhì)如何調(diào)控IS的病理過(guò)程,具體機(jī)制仍不清楚[11]。

在IS動(dòng)物模型中,腸道菌群種類(lèi)明顯降低,致病桿菌過(guò)度增生[12]。腸道菌群失調(diào)通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能影響IS的炎性反應(yīng)和預(yù)后。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),與無(wú)癥狀的動(dòng)脈粥樣硬化患者相比,IS患者有更多的機(jī)會(huì)感染致病菌,如腸桿菌和巨球菌,而共生菌如類(lèi)桿菌、普魯斯氏菌和糞鏈球菌的數(shù)量減少[13]。另一項(xiàng)臨床研究中表明,與腦缺血人群和正常人群相比,IS人群腸道菌群多樣性顯著降低,其中大腸埃希菌、巨單胞菌、桿菌、雙歧桿菌和瘤胃球菌屬數(shù)量顯著增加,而埃克曼菌、布氏桿菌和糞便桿菌數(shù)量顯著減少[14]。這些研究已充分證實(shí)IS與腸道菌群關(guān)系密切,但在IS發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的菌株和代謝物的變化仍需進(jìn)一步挖掘和分析。

相關(guān)研究證明,針刺療法可以通過(guò)穴位配伍和針刺手法,改善腸道菌群多樣性和有益菌群數(shù)量,從而調(diào)節(jié)機(jī)體功能,起到治療作用[15]。本研究選取百會(huì)、膈俞、脾俞、腎俞、后三里穴,采用搓針手法,鼓舞氣血生化。百會(huì)穴位于顛頂,為諸陽(yáng)之會(huì),經(jīng)脈于此入絡(luò)于腦,溝通十二經(jīng)氣血,針刺百會(huì)可抑制血管性癡呆模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡及改善其神經(jīng)元突觸功能[16]；電針后三里穴能顯著上調(diào)腸道益生菌豐度水平[17]；膈俞、脾俞、腎俞位于脊柱兩側(cè),可調(diào)節(jié)腸道的運(yùn)動(dòng)、分泌,達(dá)到調(diào)控腸道微環(huán)境的目的[18]。通過(guò)不同穴位配伍,有效溝通腦-腸-脊髓軸通路,可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群變化而起到改善腦功能的作用。

本研究使用16S rDNA 測(cè)序技術(shù)分析IS后的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在糞便組織中主要檢測(cè)到的前5類(lèi)菌門(mén),依次為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)。針刺組、手法組、電針組厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、梭桿菌門(mén)豐度均高于假手術(shù)組和對(duì)照組(P＜0.05),且手法組高于針刺組、電針組(P＜0.05)。針刺組、手法組、電針組擬桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)豐度均低于假手術(shù)組和對(duì)照組(P＜0.05),且手法組低于針刺組、電針組(P＜0.05)。在肺組織中主要檢測(cè)到的前5類(lèi)菌屬,依次為乳酸桿菌、放線菌、瘤胃球菌、梭桿菌、大腸桿菌。針刺組、手法組、電針組乳酸桿菌、放線菌、瘤胃球菌、梭桿菌、大腸桿菌豐度均低于假手術(shù)組和對(duì)照組(P＜0.05),且手法組低于針刺組、電針組(P＜0.05),表明針刺可以改善模型大鼠的菌群失調(diào)。腸道菌群豐度的下降和菌群結(jié)構(gòu)的變化是IS發(fā)生的重要原因。以上結(jié)果均表明,采用針刺療法治療IS過(guò)程中腸道微生物的多樣性發(fā)生變化,提示該法可能對(duì)菌群的變化具有一定的抑制作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),針刺可以增加腸道中雙歧桿菌和乳酸菌等有益細(xì)菌的數(shù)量,減少大腸桿菌的數(shù)量[19]。電針百會(huì)、腰奇穴可提高大鼠腸道厚壁菌門(mén)豐度,其機(jī)制可能與腸道菌群結(jié)構(gòu)得到調(diào)節(jié)和恢復(fù)有關(guān)[20]。

綜上所述,本研究通過(guò)腦-腸-脊髓軸,觀察針刺療法干預(yù)MCAO 大鼠后的腸道菌群變化和移位變化情況,實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)差錯(cuò),但在相關(guān)課題的延伸上應(yīng)需完善,如增加實(shí)驗(yàn)樣本量以驗(yàn)證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,在臨床進(jìn)行入組研究以評(píng)估腸道菌群隨針刺調(diào)節(jié)的變化情況。