周媛媛，劉寧雨，馬丹娜，高蕙蕊，張曉娟，劉雨新，方振興

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.日本島根大學(xué)醫(yī)學(xué)部，日本 島根縣 6938501；3.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040)

青龍衣為胡桃科植物胡桃楸(JuglansMandshuricaMaxim)的果實(shí)青皮，又名胡桃青皮，青龍衣一名始見于《山東中草藥手冊(cè)》[1-3]。《中藥大辭典》記載其味辛、苦，性澀、平，以清熱解毒、祛風(fēng)療癬、止痛止痢等功效入藥[4-5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，青龍衣的主要化學(xué)成分包括萘醌類、黃酮類、二芳基庚烷類、三萜類、有機(jī)酸類及多糖類等，其中部分類型化合物穩(wěn)定性差、具有揮發(fā)性或易氧化的特點(diǎn)[6-7]，如一些小分子萘醌苷元、鞣質(zhì)類成分等。青龍衣的抗腫瘤活性強(qiáng)，且治療范圍廣，目前臨床上已用于治療胃癌、肺癌、食管癌等疾病[8-9]。李彩霞等[10]研究表明，核桃青皮粗提物可以引發(fā)KYSE150人食管癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并且可以通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)KYSE150細(xì)胞凋亡。高啟龍等[11]研究證明，青龍衣含藥血清通過(guò)誘導(dǎo)凋亡與抑制Wnt/β-catenin通路的活化對(duì)人胃癌細(xì)胞 SGC-7901細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。王爽等[12]發(fā)現(xiàn)青龍衣提取物能明顯抑制Lewis肺癌細(xì)胞的增殖，抑制率為85.4%(P<0.05)。為了進(jìn)一步研究青龍衣中抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)青龍衣中分離出的6個(gè)單體化合物進(jìn)行了細(xì)胞毒性、急性毒性相關(guān)研究，也為進(jìn)一步開展抗腫瘤機(jī)制研究提供參考。

1 材料

1.1 藥材

本實(shí)驗(yàn)所用青龍衣藥材于2018年采集自吉林長(zhǎng)白山山脈，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室王振月教授鑒定為胡桃科胡桃屬植物胡桃楸(JuglansMandshuricaMaxim)的未成熟外果皮，目前樣品保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 細(xì)胞株

人胃癌BGC-823細(xì)胞、腸癌HCT-15細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。

1.3 動(dòng)物

昆明小鼠180只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001，自由飲水，定時(shí)通風(fēng)，濕度保持40%～60%，平衡飼養(yǎng)1周后進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；倒置顯微鏡(日本Tokyo公司)；超凈工作臺(tái)(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；超低溫冰箱(美國(guó) Thermo公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胰蛋白酶(美國(guó)HyClone公司)；青霉素-鏈霉素雙抗(美國(guó)Thermo公司)；二甲基亞砜(DMSO，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；96孔培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)；噻唑藍(lán)(MTT，大連美侖生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)

取96孔培養(yǎng)板，四周培養(yǎng)孔設(shè)置為空白組，加入PBS 200 μL/孔，剩下的孔進(jìn)行正常接種，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化使其脫壁，再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使其濃度范圍在(4×104)～(7×104)個(gè)/mL，按100 μL/孔加入孔板內(nèi)，每一個(gè)篩選條件均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置不加細(xì)胞的完全培養(yǎng)基孔為空白對(duì)照，向每孔分別加入濃度為8、6、4、2、1 mg/L的待測(cè)樣品溶液20 μL。于37 ℃ 5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)4 h后，每孔加入MTT液20 μL(5 mg/mL)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入120 μL DMSO，然后進(jìn)行顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定OD值。以配置各化合物的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制濃度效應(yīng)曲線，計(jì)算IC50值。

2.2 急性毒性試驗(yàn)

按寇氏法每組10只小鼠，以正常小鼠為空白對(duì)照，胡桃醌、3-乙氧基胡桃醌、12β,20(R),24(R)-三羥基達(dá)瑪烷-25-烯-3-酮、20(S)-原人參二醇、2α,3β,23-三羥基-12-烯-28-熊果酸、Juglanin A藥物溶液以0.2 mL/10 g體質(zhì)量腹腔注射，各組藥物濃度根據(jù)小鼠平均體質(zhì)量(20 g)水平計(jì)算，腹腔注射后觀察動(dòng)物行為、攝食、分泌物、排泄物以及中毒死亡情況，連續(xù)觀察2周。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)BGC-823 細(xì)胞、HCT-15細(xì)胞形態(tài)的影響

在光學(xué)顯微鏡下空白組的BGC-823和 HCT-15細(xì)胞數(shù)量明顯增多，胞質(zhì)豐富、胞核較大，相鄰細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片，貼壁牢固，折光性好。分別給予化合物胡桃醌、3-乙氧基胡桃醌、12β,20(R),24(R)-三羥基達(dá)瑪烷-25-烯-3-酮、20(S)-原人參二醇、2α,3β,23-三羥基-12-烯-28-熊果酸、Juglanin A處理后的BGC-823細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞相對(duì)較小，胞漿減少，核固縮，部分細(xì)胞碎裂，具體情況如圖1所示。

注:A.對(duì)照組;B.胡桃醌組;C.3-乙氧基胡桃醌組;D.12β,20(R),24(R)-三羥基達(dá)瑪烷-25-烯-3-酮組;E.20(S)-原人參二醇組;F.2α,3β,23-三羥基-12-烯-28-熊果酸;G.Juglanin A組。圖1 顯微鏡下觀察空白組及各藥物組的BGC-823、HCT-15細(xì)胞形態(tài)(×200)

3.2 對(duì)各瘤株細(xì)胞IC50值測(cè)定

胡桃醌、3-乙氧基胡桃醌、12β,20(R),24(R)-三羥基達(dá)瑪烷-25-烯-3-酮、20(S)-原人參二醇、2α,3β,23-三羥基-12-烯-28-熊果酸以及Juglanin A對(duì)BGC-823細(xì)胞和HCT-15細(xì)胞均有細(xì)胞毒作用，且敏感度具有差異性。且針對(duì)BGC-823細(xì)胞和HCT-15細(xì)胞均以胡桃醌的IC50值最小分別為(9.6±2.35)μmo1/L和(27.8±2.66)μmo1/L，說(shuō)明胡桃醌對(duì)人胃癌BGC-823和人腸癌HCT-15細(xì)胞的抗體外增殖作用均表現(xiàn)最強(qiáng)，抑制率情況見表1。

表1 6個(gè)單體化合物對(duì)BGC-823和HCT-15的IC50值比較

3.3 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

最高劑量組給藥6 h后發(fā)現(xiàn)胡桃醌組小鼠出現(xiàn)不安，呼吸急促，隨后0.5 h內(nèi)死亡。其他給藥組高劑量組僅見運(yùn)動(dòng)遲緩，精神萎靡，嗜睡不食等現(xiàn)象。通過(guò)觀察死亡情況，計(jì)算小鼠LD50值情況及置信區(qū)間見表2。

表2 6個(gè)單體活性成分LD50(n=10，mg/kg)

4 討論

實(shí)驗(yàn)對(duì)青龍衣的6種化學(xué)成分胡桃醌、3-乙氧基胡桃醌、12β,20(R),24(R)-三羥基達(dá)瑪烷-25-烯-3-酮、20(S)-原人參二醇、2α,3β,23-三羥基-12-烯-28-熊果酸、Juglanin A分別進(jìn)行了細(xì)胞毒活性和急性毒性試驗(yàn)。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6種化合物均有細(xì)胞毒作用，其中胡桃醌細(xì)胞毒作用最強(qiáng)，IC50值為(9.6±2.35)μmo1/L和(27.8±2.66)μmo1/L。而急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，6種化合物均有急性毒性作用，其中胡桃醌毒性作用最強(qiáng)，LD50值為33.57 mg/kg，95%置信區(qū)間為29.53～38.16 mg/kg。本研究進(jìn)行了青龍衣的急性毒性試驗(yàn)研究，從而為初步判斷青龍衣的毒性大小及可能存在的危害提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為后續(xù)的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)以及藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)提供了劑量參考，而且也可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)中小鼠的急性毒性反應(yīng)癥狀，來(lái)推測(cè)青龍衣在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)變化，為青龍衣的藥動(dòng)學(xué)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

研究結(jié)果表明，這些化合物均為青龍衣中抗腫瘤活性成分，其中胡桃醌表現(xiàn)出良好的體外抗腫瘤活性，但是胡桃醌同樣具有明顯的毒性作用，提示雖然胡桃醌在開發(fā)抗腫瘤新藥方面有較大研究?jī)r(jià)值，但需要進(jìn)行適當(dāng)結(jié)構(gòu)修飾改造或?qū)ふ移渌案咝У投尽被瘜W(xué)成分進(jìn)行替代，本實(shí)驗(yàn)中三萜類成分如20(S)-原人參二醇既具有較好的細(xì)胞毒活性又兼具低毒性特點(diǎn)，具有良好的抗腫瘤研究前景。