李為民，胡成琛，吳 蓉，沈惠琳，李國棟，李國熊

(1.杭州師范大學附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 杭州 310015；2.杭州市丁橋醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 杭州 310021)

0 前言

胃癌(gastric cancer, GC)作為全球第五大常見惡性腫瘤，其致死率在癌癥中高達第三位。盡管在過去的幾十年里，人們越來越關(guān)注胃癌的篩查和治療，但大多數(shù)患者的生存率仍低于5年，術(shù)后生活質(zhì)量仍得不到改善，且常見的化療藥物還存在不完善、非特異性及副作用大等缺點。因此，我們迫切需要尋找新型、有前途的胃癌治療藥物，并分析其生物學機制。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)是真核細胞中重要的細胞器，它參與真核細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、折疊及運輸過程。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到外界干擾，導致穩(wěn)態(tài)被破壞，如酸中毒、缺氧和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，從而改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容量與蛋白質(zhì)折疊負荷之間的不平衡，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累未折疊蛋白，這種狀態(tài)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激開始時，未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)的激活可通過細胞調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。在長期持續(xù)的壓力作用條件下，ERS和UPR可使細胞直接進入凋亡途徑。越來越多的研究表明，ERS及由其引發(fā)的UPR與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

褪黑素(melatonin，MLT)作為一種吲哚類物質(zhì)，由松果體、視網(wǎng)膜、大腦、心臟和胃腸道系統(tǒng)合成。據(jù)報道，褪黑素在胃腸道分泌量是松果體的400多倍。早年研究發(fā)現(xiàn)褪黑素作為一種抗氧化酶，可以清除氧自由基，保護氧化損傷。隨著對褪黑素認識加深，褪黑素還可抑制多種人類癌癥的增殖，包括白血病、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺腺癌及胃癌。然而，關(guān)于胃癌中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應與褪黑素抗癌作用之間的分子機制研究罕有報道。因此，我們擬進一步探究褪黑素與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的相關(guān)性，以期為胃癌的新治療靶點的研究提供更多科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人胃癌AGS細胞株購自上海中科院細胞庫。

1.1.2 主要試劑 F12K培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶/EDTA、褪黑素(MLT)和4-苯基丁酸(4-PB)均購自美國Sigma公司，CCK-8細胞增殖分析試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所，Annexin V FITC/PI凋亡試劑盒購自浙江杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，GRP78和Cleaved-caspase-3購自美國CST公司，ATF6和TRAF-2購自杭州華安生物技術(shù)有限公司，-actin抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)AGS細胞，置于37℃、5%CO恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞的生長情況、培養(yǎng)基消化情況進行換液，平均2～3天換液一次。若細胞生長到80%時需進行傳代培養(yǎng)。判斷細胞活力使用臺盼藍染色。

1.3 細胞處理和形態(tài)學觀察 MLT和4-PB均使用二甲基亞砜(DMSO)溶解。細胞處理先棄去細胞廢液，PBS清洗2遍，再將含有MLT或4-PB的培養(yǎng)基加入細胞，用于干預研究。本研究團隊既往研究已證實MLT作用AGS存在時間依賴性，48 h干預細胞表型變化明顯，故本研究時間節(jié)點選擇48 h。取不同濃度褪黑素作用AGS胃癌細胞48 h，通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，并拍照分析形態(tài)差異。

1.4 實驗分組 ①正常對照組：對AGS細胞只使用含血清F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)；②褪黑素組：加入MLT，使在培養(yǎng)基中濃度為2 mmol/L；③4-PB組：加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-PB，使在培養(yǎng)基中濃度為200 μmol/L；④褪黑素+4-PB組：先加入4-PB常氧條件下培養(yǎng)24 h，再加入褪黑素進行干預。

1.5 細胞增殖檢測 取對數(shù)生長期的人胃癌AGS細胞，用0.25%胰酶消化并收集細胞。以F12K完全培養(yǎng)液制成細胞懸液，按4×10個/mL接種于96孔培養(yǎng)板中(每孔100 μL)，細胞培養(yǎng)過夜后，分別給予不同濃度MLT(1～4 mmol/L)和4-PB(濃度200 μmol/L)干預。細胞干預48 h后，棄去廢液，用PBS輕輕清洗2次后，每孔加入含有10 μL CCK-8的培養(yǎng)基100 μL，在37℃、5% CO及相對濕度95%條件下，繼續(xù)孵育2 h，經(jīng)振蕩器振蕩混勻后采用酶標儀(波長450 nm)，按照下列公式計算腫瘤細胞增殖抑制率。腫瘤細胞增殖抑制率=(各加藥孔吸光度均值-空白孔吸光度均值)/(對照組吸光度均值-空白孔吸光度均值)×100%。通過SPSS計算藥物IC50值，分析比對后選擇2 mmol/L作為后續(xù)實驗濃度。

1.6 細胞集落試驗檢測 經(jīng)MLT和4-PB處理AGS細胞，繼續(xù)培養(yǎng)5～8天(每2～3天更換新鮮培養(yǎng)液)。實驗結(jié)束后，用PBS輕輕清洗2次，4%多聚甲醛固定15～20 min、再PBS輕輕清洗2次，結(jié)晶紫染色(1mL/孔，染色15～20 min)，最后再PBS小心沖洗殘余染液，晾干，相機拍攝記錄各組細胞形成集落數(shù)量。

1.7 細胞凋亡檢測 取生長狀態(tài)良好的細胞，以4×10/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后通過MLT和4-PB干預，于48 h時間點收集細胞，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2次，每孔加入1 mL胰酶消化，提取單細胞懸液。按3×10個細胞加入1.5 mL Ep管中，PBS輕洗1遍，1 000 rpm離心5 min后，加1×Binding Buffer 緩沖液500 μL重懸細胞，后各管中加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻，室溫避光15 min后，使用流式細胞儀上機測定。最后采用波長488 nm，分別以紅色和綠色熒光通道檢測細胞凋亡，并用FlowJo軟件分析。

1.8 Western blot檢測蛋白表達 經(jīng)MLT和4-PB處理AGS細胞48 h，PBS清洗2次后收集細胞。首先加入RIPA細胞裂解液，冰浴30 min，低溫高速離心，吸取上層澄清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，置于冰上待用。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定各樣本蛋白濃度，并將各組蛋白稀釋到等量濃度，置于沸水浴5 min使蛋白變性。各組樣本蛋白按35 μg上樣到10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，恒壓電泳100 min，恒流60 min轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST緩沖液洗膜3次(每次5 min)，加入一抗4℃震蕩過夜。次日取膜用TBST洗膜3次(每次10 min)，加入二抗室溫孵育l h，TBST洗膜3次(每次10 min)。最后取ECL發(fā)光液A和B，1∶1混勻滴在膜上，避光下用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描并進行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)數(shù)據(jù)分析不同組間GRP78、ATF6、TRAF-2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白和活化狀態(tài)凋亡蛋白Caspase-3變化情況。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)的變化 倒置顯微鏡下，觀察各組細胞狀態(tài)變化。胃癌細胞株AGS在單純胎牛血清培養(yǎng)基中形態(tài)呈梭形、核圓、大小均一、分布密集。而在褪黑素濃度1 mmol/L和2 mmol/L作用下，細胞形態(tài)變圓、分布擴散、間隙增大、細胞碎片增多及細胞量減少，見圖1。

倒置顯微鏡白光觀察細胞形態(tài)(×100)，A.單純含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；B.1 mmol/L MLT培養(yǎng)；C.2 mmol/L MLT培養(yǎng)圖1 褪黑素作用細胞形態(tài)變化Figure 1 Effect of melatonin on cell morphology

2.2 細胞增殖抑制率變化 CCK-8測定不同褪黑素濃度和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-PB作用細胞48 h后細胞增殖能力變化。如圖2所示，褪黑素作用細胞以劑量依賴的方式抑制細胞增殖，IC50值是2.82 mmol/L。4-PB聯(lián)合褪黑素作用細胞后增殖率為68.24%，較2 mmol/L褪黑素抑制率63.20%有所上升，差異有統(tǒng)計學意義(<0.01)。

與對照組比較，*P<0.01，**P<0.05；下同。圖2 褪黑素及4-PB對細胞增殖影響Figure 2 Effect of melatonin and 4-PB on cell proliferation

2.3 細胞克隆變化 比較褪黑素和4-PB對AGS細胞克隆影響，由圖3可知，2 mmol/L褪黑素明顯抑制細胞克隆形成，4-PB作用可緩解褪黑素對AGS細胞抑制作用。

A.正常組，B.2 mmol/L MLT組，C.4-PB組，D.2 mmol/L MLT+4-PB組圖3 褪黑素及4-PB對細胞克隆的影響Figure 3 Effect of melatonin and 4-PB on cell monoclonal formation

2.4 細胞發(fā)生凋亡變化 Annexin V-FITC/PI檢測褪黑素對細胞凋亡的作用。結(jié)果顯示，使用2 mmol/L褪黑激素處理AGS細胞，細胞早期凋亡率和晚期凋亡率為14.1%和13.2%。加入4-PB干擾褪黑素促凋亡作用，早期凋亡率和晚期凋亡率為8.5%和3.8%，見圖4D。

A.正常組，B.2 mmol/L MLT組，C.4-PB組，D.2 mmol/L MLT+4-PB組圖4 褪黑素及4-PB對細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of melatonin and 4-PB on cell apoptosis

2.5 褪黑素對胃癌細胞凋亡作用調(diào)控機制 Western blot法檢測藥物作用48 h后細胞蛋白變化。與對照組相比，褪黑素組處理后促進ERS相關(guān)蛋白GRP78、ATF6和TRAF-2增加，同時上調(diào)Cleaved-caspase-3表達(圖5A)。加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-PB干擾褪黑素，蛋白GRP78、ATF6、TRAF-2表達均下調(diào)，且Cleaved-caspase-3表達也下降，與褪黑素組相比存在統(tǒng)計學差異(<0.05，圖5B)。

圖5 褪黑素對AGS細胞ERS及凋亡蛋白的影響Figure 5 Effects of melatonin on ERS and apoptosis proteins of AGS cells

3 討論

胃癌是中國第二大常見腫瘤，在癌癥相關(guān)死亡率中排名第二。我們早期研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素作為一種吲哚胺，可協(xié)助順鉑發(fā)揮抗胃癌作用。在不同的病理生理條件下，不同濃度褪黑激素對各種人惡性腫瘤具有抑制作用。本研究旨在探討褪黑激素對人胃癌細胞抗腫瘤作用可能涉及的信號通路，為開發(fā)新的抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。

細胞凋亡作為抗癌作用關(guān)鍵機制，一直備受關(guān)注。目前，死亡受體信號途徑、線粒體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)是細胞凋亡的三大途徑。其中，ERS途徑是一種新的細胞凋亡途徑。越來越多研究表現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與癌細胞的凋亡和自噬密切相關(guān)。我們研究認為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與了褪黑激素誘導的人胃癌細胞凋亡。因此，需要更多的研究去證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和凋亡之間的相互干擾作用，才能夠闡明褪黑激素發(fā)揮抗癌機制。

在本研究中，與對照組相比，經(jīng)褪黑素處理的AGS細胞中凋亡細胞百分比明顯上升，同時褪黑激素能夠抑制細胞增殖和克隆能力。本研究結(jié)果基本證實了褪黑素在體外抑制癌細胞的生長，對胃癌具有潛在的抗癌作用。在基本的分子機制中，褪黑激素可促進GRP78蛋白上調(diào)，作為ERS核心調(diào)節(jié)因子，其激活促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路ATF6和TRAF-2表達增加，從而證實褪黑素可影響胃癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生。4-PB是一種低分子游離脂肪酸，可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)合成，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，恢復細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。為了進一步驗證ERS在褪黑素誘導AGS細胞凋亡中的作用，我們采用4-PB預處理細胞。通過4-PB抑制的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力相關(guān)蛋白作用，使得褪黑素抗癌作用明顯下降，包括抑制細胞增殖、克隆及凋亡。觀察4-PB聯(lián)合褪黑素作用AGS細胞后GRP78、TRAF-2、ATF6蛋白表達均下降，且促凋亡蛋白Caspase-3也受到抑制。GRP78作為一個至關(guān)重要的ER分子伴侶，在ER應激下,GRP78釋放IRE1α和ATF6蛋白，發(fā)揮UPR作用。當IRE1α釋放后可招募TRAF-2，激活細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)，進一步促進細胞凋亡和自噬。ATF6活化可間接下調(diào)抗凋亡蛋白Mcl-1，并促進成肌細胞發(fā)生凋亡。本研究認為褪黑素持續(xù)作用癌細胞，通過上調(diào)GRP78分子，誘導ERS發(fā)生，上調(diào)TRAF-2和ATF6的表達，并進一步導致細胞凋亡。

本研究的不足在于未從動物和臨床研究角度驗證褪黑素可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路對胃癌作用，僅在體外細胞株上驗證其抗癌療效。基于褪黑素在臨床上已普遍用于促睡眠治療，今后筆者將設(shè)計褪黑素用于治療胃癌患者的臨床試驗，這將為褪黑素在胃癌治療中提供可靠的實驗依據(jù)。

綜上所述，本研究揭示了褪黑素可促進ERS反應，并驗證ERS參與褪黑素促細胞凋亡作用。結(jié)合褪黑素對胃癌作用，其可能是抗腫瘤治療的一個強有力的候選藥物。但整個誘導細胞凋亡過程中，還有其他多個信號通路的參與，褪黑素促進胃癌AGS細胞凋亡機制還可進一步探討。