李為民，胡成琛，吳 蓉，沈惠琳，李國棟，李國熊

(1.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 杭州 310015；2.杭州市丁橋醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 杭州 310021)

0 前言

胃癌(gastric cancer, GC)作為全球第五大常見惡性腫瘤，其致死率在癌癥中高達(dá)第三位。盡管在過去的幾十年里，人們?cè)絹碓疥P(guān)注胃癌的篩查和治療，但大多數(shù)患者的生存率仍低于5年，術(shù)后生活質(zhì)量仍得不到改善，且常見的化療藥物還存在不完善、非特異性及副作用大等缺點(diǎn)。因此，我們迫切需要尋找新型、有前途的胃癌治療藥物，并分析其生物學(xué)機(jī)制。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，它參與真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、折疊及運(yùn)輸過程。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到外界干擾，導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)被破壞，如酸中毒、缺氧和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，從而改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容量與蛋白質(zhì)折疊負(fù)荷之間的不平衡，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累未折疊蛋白，這種狀態(tài)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激開始時(shí)，未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)的激活可通過細(xì)胞調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。在長期持續(xù)的壓力作用條件下，ERS和UPR可使細(xì)胞直接進(jìn)入凋亡途徑。越來越多的研究表明，ERS及由其引發(fā)的UPR與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

褪黑素(melatonin，MLT)作為一種吲哚類物質(zhì)，由松果體、視網(wǎng)膜、大腦、心臟和胃腸道系統(tǒng)合成。據(jù)報(bào)道，褪黑素在胃腸道分泌量是松果體的400多倍。早年研究發(fā)現(xiàn)褪黑素作為一種抗氧化酶，可以清除氧自由基，保護(hù)氧化損傷。隨著對(duì)褪黑素認(rèn)識(shí)加深，褪黑素還可抑制多種人類癌癥的增殖，包括白血病、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺腺癌及胃癌。然而，關(guān)于胃癌中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與褪黑素抗癌作用之間的分子機(jī)制研究罕有報(bào)道。因此，我們擬進(jìn)一步探究褪黑素與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)性，以期為胃癌的新治療靶點(diǎn)的研究提供更多科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人胃癌AGS細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 F12K培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶/EDTA、褪黑素(MLT)和4-苯基丁酸(4-PB)均購自美國Sigma公司，CCK-8細(xì)胞增殖分析試劑盒購自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所，Annexin V FITC/PI凋亡試劑盒購自浙江杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，GRP78和Cleaved-caspase-3購自美國CST公司，ATF6和TRAF-2購自杭州華安生物技術(shù)有限公司，-actin抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)AGS細(xì)胞，置于37℃、5%CO恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的生長情況、培養(yǎng)基消化情況進(jìn)行換液，平均2～3天換液一次。若細(xì)胞生長到80%時(shí)需進(jìn)行傳代培養(yǎng)。判斷細(xì)胞活力使用臺(tái)盼藍(lán)染色。

1.3 細(xì)胞處理和形態(tài)學(xué)觀察 MLT和4-PB均使用二甲基亞砜(DMSO)溶解。細(xì)胞處理先棄去細(xì)胞廢液，PBS清洗2遍，再將含有MLT或4-PB的培養(yǎng)基加入細(xì)胞，用于干預(yù)研究。本研究團(tuán)隊(duì)既往研究已證實(shí)MLT作用AGS存在時(shí)間依賴性，48 h干預(yù)細(xì)胞表型變化明顯，故本研究時(shí)間節(jié)點(diǎn)選擇48 h。取不同濃度褪黑素作用AGS胃癌細(xì)胞48 h，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照分析形態(tài)差異。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 ①正常對(duì)照組：對(duì)AGS細(xì)胞只使用含血清F12K培養(yǎng)基培養(yǎng)；②褪黑素組：加入MLT，使在培養(yǎng)基中濃度為2 mmol/L；③4-PB組：加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PB，使在培養(yǎng)基中濃度為200 μmol/L；④褪黑素+4-PB組：先加入4-PB常氧條件下培養(yǎng)24 h，再加入褪黑素進(jìn)行干預(yù)。

1.5 細(xì)胞增殖檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長期的人胃癌AGS細(xì)胞，用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞。以F12K完全培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，按4×10個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板中(每孔100 μL)，細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，分別給予不同濃度MLT(1～4 mmol/L)和4-PB(濃度200 μmol/L)干預(yù)。細(xì)胞干預(yù)48 h后，棄去廢液，用PBS輕輕清洗2次后，每孔加入含有10 μL CCK-8的培養(yǎng)基100 μL，在37℃、5% CO及相對(duì)濕度95%條件下，繼續(xù)孵育2 h，經(jīng)振蕩器振蕩混勻后采用酶標(biāo)儀(波長450 nm)，按照下列公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖抑制率。腫瘤細(xì)胞增殖抑制率=(各加藥孔吸光度均值-空白孔吸光度均值)/(對(duì)照組吸光度均值-空白孔吸光度均值)×100%。通過SPSS計(jì)算藥物IC50值，分析比對(duì)后選擇2 mmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

1.6 細(xì)胞集落試驗(yàn)檢測(cè) 經(jīng)MLT和4-PB處理AGS細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)5～8天(每2～3天更換新鮮培養(yǎng)液)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用PBS輕輕清洗2次，4%多聚甲醛固定15～20 min、再PBS輕輕清洗2次，結(jié)晶紫染色(1mL/孔，染色15～20 min)，最后再PBS小心沖洗殘余染液，晾干，相機(jī)拍攝記錄各組細(xì)胞形成集落數(shù)量。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，以4×10/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后通過MLT和4-PB干預(yù)，于48 h時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2次，每孔加入1 mL胰酶消化，提取單細(xì)胞懸液。按3×10個(gè)細(xì)胞加入1.5 mL Ep管中，PBS輕洗1遍，1 000 rpm離心5 min后，加1×Binding Buffer 緩沖液500 μL重懸細(xì)胞，后各管中加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻，室溫避光15 min后，使用流式細(xì)胞儀上機(jī)測(cè)定。最后采用波長488 nm，分別以紅色和綠色熒光通道檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并用FlowJo軟件分析。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 經(jīng)MLT和4-PB處理AGS細(xì)胞48 h，PBS清洗2次后收集細(xì)胞。首先加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰浴30 min，低溫高速離心，吸取上層澄清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，置于冰上待用。采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定各樣本蛋白濃度，并將各組蛋白稀釋到等量濃度，置于沸水浴5 min使蛋白變性。各組樣本蛋白按35 μg上樣到10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，恒壓電泳100 min，恒流60 min轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST緩沖液洗膜3次(每次5 min)，加入一抗4℃震蕩過夜。次日取膜用TBST洗膜3次(每次10 min)，加入二抗室溫孵育l h，TBST洗膜3次(每次10 min)。最后取ECL發(fā)光液A和B，1∶1混勻滴在膜上，避光下用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)數(shù)據(jù)分析不同組間GRP78、ATF6、TRAF-2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和活化狀態(tài)凋亡蛋白Caspase-3變化情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)的變化 倒置顯微鏡下，觀察各組細(xì)胞狀態(tài)變化。胃癌細(xì)胞株AGS在單純胎牛血清培養(yǎng)基中形態(tài)呈梭形、核圓、大小均一、分布密集。而在褪黑素濃度1 mmol/L和2 mmol/L作用下，細(xì)胞形態(tài)變圓、分布擴(kuò)散、間隙增大、細(xì)胞碎片增多及細(xì)胞量減少，見圖1。

倒置顯微鏡白光觀察細(xì)胞形態(tài)(×100)，A.單純含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；B.1 mmol/L MLT培養(yǎng)；C.2 mmol/L MLT培養(yǎng)圖1 褪黑素作用細(xì)胞形態(tài)變化Figure 1 Effect of melatonin on cell morphology

2.2 細(xì)胞增殖抑制率變化 CCK-8測(cè)定不同褪黑素濃度和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PB作用細(xì)胞48 h后細(xì)胞增殖能力變化。如圖2所示，褪黑素作用細(xì)胞以劑量依賴的方式抑制細(xì)胞增殖，IC50值是2.82 mmol/L。4-PB聯(lián)合褪黑素作用細(xì)胞后增殖率為68.24%，較2 mmol/L褪黑素抑制率63.20%有所上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01)。

與對(duì)照組比較，*P<0.01，**P<0.05；下同。圖2 褪黑素及4-PB對(duì)細(xì)胞增殖影響Figure 2 Effect of melatonin and 4-PB on cell proliferation

2.3 細(xì)胞克隆變化 比較褪黑素和4-PB對(duì)AGS細(xì)胞克隆影響，由圖3可知，2 mmol/L褪黑素明顯抑制細(xì)胞克隆形成，4-PB作用可緩解褪黑素對(duì)AGS細(xì)胞抑制作用。

A.正常組，B.2 mmol/L MLT組，C.4-PB組，D.2 mmol/L MLT+4-PB組圖3 褪黑素及4-PB對(duì)細(xì)胞克隆的影響Figure 3 Effect of melatonin and 4-PB on cell monoclonal formation

2.4 細(xì)胞發(fā)生凋亡變化 Annexin V-FITC/PI檢測(cè)褪黑素對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果顯示，使用2 mmol/L褪黑激素處理AGS細(xì)胞，細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率為14.1%和13.2%。加入4-PB干擾褪黑素促凋亡作用，早期凋亡率和晚期凋亡率為8.5%和3.8%，見圖4D。

A.正常組，B.2 mmol/L MLT組，C.4-PB組，D.2 mmol/L MLT+4-PB組圖4 褪黑素及4-PB對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of melatonin and 4-PB on cell apoptosis

2.5 褪黑素對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡作用調(diào)控機(jī)制 Western blot法檢測(cè)藥物作用48 h后細(xì)胞蛋白變化。與對(duì)照組相比，褪黑素組處理后促進(jìn)ERS相關(guān)蛋白GRP78、ATF6和TRAF-2增加，同時(shí)上調(diào)Cleaved-caspase-3表達(dá)(圖5A)。加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PB干擾褪黑素，蛋白GRP78、ATF6、TRAF-2表達(dá)均下調(diào)，且Cleaved-caspase-3表達(dá)也下降，與褪黑素組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(<0.05，圖5B)。

圖5 褪黑素對(duì)AGS細(xì)胞ERS及凋亡蛋白的影響Figure 5 Effects of melatonin on ERS and apoptosis proteins of AGS cells

3 討論

胃癌是中國第二大常見腫瘤，在癌癥相關(guān)死亡率中排名第二。我們?cè)缙谘芯堪l(fā)現(xiàn)，褪黑素作為一種吲哚胺，可協(xié)助順鉑發(fā)揮抗胃癌作用。在不同的病理生理?xiàng)l件下，不同濃度褪黑激素對(duì)各種人惡性腫瘤具有抑制作用。本研究旨在探討褪黑激素對(duì)人胃癌細(xì)胞抗腫瘤作用可能涉及的信號(hào)通路，為開發(fā)新的抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡作為抗癌作用關(guān)鍵機(jī)制，一直備受關(guān)注。目前，死亡受體信號(hào)途徑、線粒體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是細(xì)胞凋亡的三大途徑。其中，ERS途徑是一種新的細(xì)胞凋亡途徑。越來越多研究表現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與癌細(xì)胞的凋亡和自噬密切相關(guān)。我們研究認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了褪黑激素誘導(dǎo)的人胃癌細(xì)胞凋亡。因此，需要更多的研究去證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡之間的相互干擾作用，才能夠闡明褪黑激素發(fā)揮抗癌機(jī)制。

在本研究中，與對(duì)照組相比，經(jīng)褪黑素處理的AGS細(xì)胞中凋亡細(xì)胞百分比明顯上升，同時(shí)褪黑激素能夠抑制細(xì)胞增殖和克隆能力。本研究結(jié)果基本證實(shí)了褪黑素在體外抑制癌細(xì)胞的生長，對(duì)胃癌具有潛在的抗癌作用。在基本的分子機(jī)制中，褪黑激素可促進(jìn)GRP78蛋白上調(diào)，作為ERS核心調(diào)節(jié)因子，其激活促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路ATF6和TRAF-2表達(dá)增加，從而證實(shí)褪黑素可影響胃癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生。4-PB是一種低分子游離脂肪酸，可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)合成，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ERS在褪黑素誘導(dǎo)AGS細(xì)胞凋亡中的作用，我們采用4-PB預(yù)處理細(xì)胞。通過4-PB抑制的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力相關(guān)蛋白作用，使得褪黑素抗癌作用明顯下降，包括抑制細(xì)胞增殖、克隆及凋亡。觀察4-PB聯(lián)合褪黑素作用AGS細(xì)胞后GRP78、TRAF-2、ATF6蛋白表達(dá)均下降，且促凋亡蛋白Caspase-3也受到抑制。GRP78作為一個(gè)至關(guān)重要的ER分子伴侶，在ER應(yīng)激下,GRP78釋放IRE1α和ATF6蛋白，發(fā)揮UPR作用。當(dāng)IRE1α釋放后可招募TRAF-2，激活細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬。ATF6活化可間接下調(diào)抗凋亡蛋白Mcl-1，并促進(jìn)成肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究認(rèn)為褪黑素持續(xù)作用癌細(xì)胞，通過上調(diào)GRP78分子，誘導(dǎo)ERS發(fā)生，上調(diào)TRAF-2和ATF6的表達(dá)，并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本研究的不足在于未從動(dòng)物和臨床研究角度驗(yàn)證褪黑素可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路對(duì)胃癌作用，僅在體外細(xì)胞株上驗(yàn)證其抗癌療效?；谕屎谒卦谂R床上已普遍用于促睡眠治療，今后筆者將設(shè)計(jì)褪黑素用于治療胃癌患者的臨床試驗(yàn)，這將為褪黑素在胃癌治療中提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，本研究揭示了褪黑素可促進(jìn)ERS反應(yīng)，并驗(yàn)證ERS參與褪黑素促細(xì)胞凋亡作用。結(jié)合褪黑素對(duì)胃癌作用，其可能是抗腫瘤治療的一個(gè)強(qiáng)有力的候選藥物。但整個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中，還有其他多個(gè)信號(hào)通路的參與，褪黑素促進(jìn)胃癌AGS細(xì)胞凋亡機(jī)制還可進(jìn)一步探討。