陳少宇，袁莉剛，楊洪早，陶金忠，丁偉

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2. 寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021；3. 寧夏農(nóng)林科學院動物科學研究所，寧夏 銀川 750021）

胰島素樣因子3（insulin-like factor3，INSL3）是胰島素樣激素超家族中的一員，由131 個氨基酸組成，又稱松弛素樣因子，因其特異性表達于Leydig細胞，被稱為Leydig 細胞源胰島素樣肽［1］。INSL3 具有廣泛的生物活性和功能，可促進細胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)機體出生后的生長發(fā)育［2］。嬰兒出生后睪丸從腹腔下降至陰囊中，其下降過程可分為腹腔內(nèi)下降及腹股溝下降兩個階段。INSL3在腹腔內(nèi)下降過程中發(fā)揮了重要作用，INSL3 在成年小尾寒羊睪丸的表達量較其他組織高，是睪丸發(fā)育成熟的指標［2-3］。INSL3 在出生前后的Leydig 細胞中特異性表達，雄性大鼠血液中的INSL3 濃度從出生第10 天開始升高，并一直持續(xù)到分娩第39 天達到成年水平［1］。INSL3在出生前后的高水平表達對胚胎及初生時期睪丸形態(tài)及功能的發(fā)育有重要調(diào)節(jié)功能。研究表明，在人［3］和小鼠［4］中，若INSL3 的表達缺失或低于正常水平時會造成隱睪癥的發(fā)生。INSL3與Leydig細胞的數(shù)量及分化狀態(tài)密切相關(guān)，是Leydig 細胞分化的標志。研究表明，在公牛青春期以前未成熟的Leydig細胞中，其表達量極少［5］。在衰老小鼠Leydig細胞中水平明顯下降［6］。有證據(jù)表明，公牛［5］、大鼠［7］和人［5］等睪丸INSL3 在RNA 水平或蛋白水平隨年齡而變化，由于雄激素對垂體的反饋作用，性成熟初期雄激素及INSL3 穩(wěn)定在較低的水平。因此，INSL3 表達水平隨睪丸的發(fā)育及調(diào)節(jié)機能改變而變化。

灘羊是我國獨特的裘皮用綿羊，其生長發(fā)育的特殊時期（出生到30 d 左右）表現(xiàn)獨特的二毛皮特性，主要受胚胎發(fā)育和生態(tài)環(huán)境因素等方面的影響，尤其是二毛皮被毛卷曲的形成受遺傳因素及營養(yǎng)管理等影響明顯［8］。INSL3在動物出生前后對生長發(fā)育有重要調(diào)節(jié)功能。灘羊早期生長發(fā)育相關(guān)影響因子密切關(guān)系到灘羊二毛皮的特征表現(xiàn)，為此，本研究通過組織化學染色、免疫組織化學法和免疫熒光技術(shù)，對初生及35日齡（二毛皮）灘羊睪丸組織中纖維成分、糖原及INSL3等成分的分布進行比較分析，探究其生長發(fā)育特點，為灘羊二毛皮形成期的遺傳和生殖發(fā)育研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 樣品采自寧夏回族自治區(qū)吳忠市灘羊選育中心，采用睪丸摘除手術(shù)收集初生及35日齡灘羊正常睪丸，4 mL/L 福爾馬林固定液中備用。

1.1.2 主要藥品試劑及儀器 Masson三色染色試劑（S0075）、網(wǎng)狀纖維染色試劑（S0071）；兔源抗胰島素樣因子3（INSL3）；熒光素Alexa Fluor 555標記鏈霉親和素（bs-0437P-AF555）；DAPI 染色液（D-9106）；抗熒光淬滅封片液（C02-04003）；免疫組化染色試劑盒（SP-0023，美國ZYMED 生產(chǎn)），以上材料均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。DAB 顯色試劑盒（ZLI-9018，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

Epon812包埋機，NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統(tǒng)，LKB8800型超薄切片機，正倒置一體熒光顯微鏡（RVL100-G，ECHO，USA），激光掃描共聚焦顯微鏡（LSM800，Carl Zeiss，Germany）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 新鮮組織樣品切取1 cm×1 cm×0.6 cm 大小，經(jīng)4 mL/L福爾馬林固定液固定一周備用；常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，超薄切片機連續(xù)切片（片厚4 μm），相鄰切片分為10套。

1.2.2 特殊染色方法 蘇木精-伊紅（H.E）常規(guī)染色；Masson 膠原纖維染色，膠原纖維和細胞核呈藍色；Gomori 銀氨法染色（Gordon-Sweets method），網(wǎng)狀纖維呈黑色，細胞核呈紅色，細胞質(zhì)呈淡黃色；阿利新藍染色（Alcian，AB），酸性糖原類物質(zhì)呈藍色，細胞核為紅色；PAS 過碘酸雪夫染色（periodic acid-schiff stain，PAS），中性糖原類物質(zhì)呈紅色，細胞核呈藍色；AB-PAS 染色，糖原、中性黏蛋白等呈紫紅色，酸性糖原類物質(zhì)呈藍色。

1.2.3 免疫組織化學法 1）石蠟切片常規(guī)脫蠟；2）PBS 振洗3次，每次5 min，高壓法暴露抗原，冷卻至室溫，PBS 振洗；3）滴加30 g/L H2O2阻斷過氧化物酶活性，37 ℃孵育15 min，隨后PBS 振洗3 次，每次5 min；4）滴加山羊血清白蛋白，37 ℃孵育15 min 后傾去血清；5）分別滴加胰島素樣受體INSL3 （稀釋度1∶400），陰性對照組用PBS 代替抗體，37 ℃孵育4 h后PBS 振洗；6）滴加生物素標記山羊抗兔IgG 二抗工作液，孵育15 min；PBS振洗；7）依次滴加50 μL辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育，PBS 振洗；8）滴加新鮮配制的DAB顯色液置于暗盒顯色，常規(guī)脫水、透明、封片。觀察時，棕褐色顯示陽性區(qū)域，蘇木精將細胞核染成藍色。

1.2.4 免疫熒光法 操作步驟均與免疫組織化學相同，將生物素標記山羊抗兔IgG 二抗替換為熒光素Alexa Fluor 555 標記鏈霉親和素（稀釋度1∶800）孵育2 h，PBS 振洗3 次，每次5 min；DAPI染色液孵育10 min后PBS 振洗，抗熒光淬滅封片液封片。采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察拍照。觀察時，紅色組織顯示AF555 的熒光著色；藍色組織表示DAPI標記的核熒光著色。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

切片在NIKON ECLIPSE 80i 顯微攝像系統(tǒng)進行照相。每組隨機選取5張切片，分別拍攝8個不重復視野（×1 000）。用Image Pro Plus 6.0 軟件統(tǒng)計每個視野下橫切面圓管形生精小管內(nèi)Sertoli 細胞數(shù)，生精小管管徑、橫截面積及周圍間質(zhì)組織面積，進而計算間質(zhì)面積/管腔截面積，同時檢測免疫組化陽性反應(yīng)物的平均光密度值，用統(tǒng)計軟件SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。免疫熒光染色在蔡司LSM 800 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察拍照。每組隨機選取5 張切片，每張切片拍攝6 個不重復視野（×400）。檢測免疫組化陽性反應(yīng)物的平均光密度值，所得統(tǒng)計數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析，以“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。結(jié)果采用半定量的形式對染色結(jié)果的分布密度進行描述，-：無陽性表達；+/-：偶有陽性表達； +：陽性表達； + +：中等強度陽性表達； + + +：強陽性表達； + + + +：高密度強陽性表達。

2 結(jié)果與分析

2.1 初生及35日齡灘羊睪丸組織化學特征比較

初生灘羊生精小管尚未出現(xiàn)空腔，由1層Sertoli細胞和少量生殖母細胞構(gòu)成，Sertoli沿固有膜分布，胞漿豐富，突向管腔中央，胞核呈圓形，可見分裂象；生殖母細胞多位于生精小管中央，細胞核深染，呈卵圓形（圖1-A）；Leydig 細胞成群分布于睪丸間質(zhì)組織，核多呈橢圓形或不規(guī)則形。生精上皮固有膜HE著色較深，管周肌樣細胞呈單層分布于固有膜外周，核呈長梭形，膠原纖維豐富（圖1-B）；Leydig細胞群及生精小管固有膜中網(wǎng)狀纖維分布明顯（圖1-C）；生精小管基膜AB染色呈弱陽性（圖1-D），PAS染色呈陽性反應(yīng)（圖1-E）；AB-PAS 染色藍紫色條帶明顯，偶有Leydig細胞呈酸性糖原亮藍色強陽性表達。（圖1-F）。

35日齡灘羊生精小管亦無明顯空腔，由1～2層Sertoli細胞和生殖母細胞構(gòu)成，Sertoli細胞緊貼固有膜排列；生殖母細胞核深染，呈卵圓形，胞漿豐富，個別生殖母細胞接近于生精小管管壁分布（圖1-G）；Leydig 細胞數(shù)量增多，部分細胞核深染。生精上皮固有膜膠原纖維和網(wǎng)狀纖維分布增加（圖1-H、圖1-I）；AB 染色在生精小管基膜處陽性反應(yīng)明顯（圖1-J）；生殖母細胞PAS染色陽性反應(yīng)增強（圖K）；ABPAS 染色在生精小管固有膜上紫紅色條帶增強，Leydig細胞呈紫紅色強陽性數(shù)量增加明顯（圖1-L）。

圖1 初生及35日齡灘羊睪丸組織化學特征Figure 1 Histochemical characteristics of testicle of newborn and 35 day-old Tan sheep

統(tǒng)計結(jié)果表明，初生與35日齡灘羊Sertoli細胞數(shù)差異顯著（P<0.01），35日齡灘羊生精小管平均直徑較初生灘羊有明顯增長（P<0.01），生精小管面積極顯著增大（P<0.01）；間質(zhì)/管腔截面積比差異顯著（表1）。35日齡相對初生灘羊Leydig細胞其細胞核明顯縮??；Sertoli 細胞胞質(zhì)顯著增大（P<0.05）；管周肌樣細胞增大（P<0.05），生殖母細胞胞質(zhì)未有明顯差異（P>0.05），細胞核縮小，管腔內(nèi)各細胞核質(zhì)比均顯著下降（P<0.05）（表2）。

表1 初生及35日齡灘羊睪丸生精小管特征指數(shù)Table 1 The characteristics of spermatogenic tubules in testes of newborn and 35 day?old Tan sheep（±s，n=40）

表1 初生及35日齡灘羊睪丸生精小管特征指數(shù)Table 1 The characteristics of spermatogenic tubules in testes of newborn and 35 day?old Tan sheep（±s，n=40）

同列相同字母表示差異不顯著 （P>0.05），相鄰字母表示差異顯著（P<0.05），相間字母表示差異極顯著（P<0.01）。Column with the same letters mean no significant difference （P>0.05），the adjacent small letters mean significant difference（P<0.05）； the alternate small letters mean extremely significant difference （P<0.01）.

組別Group初生灘羊Newborn Tan sheep 35日齡灘羊35 days Tan sheep Sertoli細胞數(shù)／(個·生精小管-1)Number of Sertoli cells per seminiferous tubule 11.53±0.86 a 15.87±1.25 b管腔直徑／μm Lumen diameter 34.51±0.65 a 43.31±0.62 b管腔截面積／μm2 Lumen area 935.01±34.64 a 1 473.01±42.36b間質(zhì)組織截面積/管腔截面積Interstitial tissue area/lumen area 1.17±0.16 a 0.90±0.16 b

表2 初生及35日齡灘羊睪丸組織部分細胞特征指數(shù)Table 2 The characteristic index of some cells in the testicular tissue of the newborn and 35?day?old Tan sheep （±s，n=40）

表2 初生及35日齡灘羊睪丸組織部分細胞特征指數(shù)Table 2 The characteristic index of some cells in the testicular tissue of the newborn and 35?day?old Tan sheep （±s，n=40）

同行相同字母表示差異不顯著（P>0.05），相鄰字母表示差異顯著（P<0.05），相間字母表示差異極顯著（P<0.01）。Column with the same letters mean no significant difference （P>0.05），the adjacent small letters mean significant difference（P<0.05），the alternate small letters mean extremely significant difference （P<0.01）.

指標Index細胞平均截面積／μm2Average cell crosssectional area細胞核平均截面積／μm2Average cell nuclear Crosssectional area核質(zhì)比Nucleo-cytoplasmic ratio Leydig細胞Leydig cells初生Newborn 67.43±5.24 a 26.09±6.37 a 0.68±0.28 a 35日齡35 d ays 58.08±9.18 b 19.04±3.89 b 0.50±0.13 b Sertoli細胞Sertoli cells初生Newborn 79.12±5.31 a 29.01±3.67 a 0.58±0.10 a 35日齡35 days 92.36±17.71 b 30.71±6.87 a 0.50±0.05 b生殖母細胞Gonocytes初生Newborn 117.17±9.90 a 47.45±7.96 a 0.70±0.16 a 35日齡35 days 116.24±17.36 a 43.59±6.62 b 0.62±0.14 b管周肌樣細胞Peritubular myold cells初生Newborn 46.66±11.97 a 21.84±5.63 a 0.92±0.19 a 35日齡35 days 56.91±27.61 b 21.85±9.41 a 0.68±0.24 b

2.2 初生及35日齡灘羊睪丸中INSL3的分布定位

免疫組化結(jié)果顯示，INSL3 在初生灘羊睪丸組織Leydig 細胞呈強陽性表達，生殖母細胞呈中等強陽性表達，Sertoli細胞呈陽性表達，管周肌樣細胞偶有陽性表達（圖2-A）；陰性對照組未有陽性表達（圖2-B）；INSL3 在35 日齡睪丸組織Leydig 細胞、生殖母細胞呈中等陽性表達，Sertoli 細胞和管周肌樣細胞偶有陽性表達（圖2-C）；陰性對照未見陽性表達（圖2-D）。免疫組織熒光所得結(jié)果顯示，初生灘羊睪丸組織中Leydig 細胞紅色陽性表達明顯，生殖母細胞、Sertoli細胞、管周肌樣細胞發(fā)出的陽性表達較弱（圖2-E，2-F，2-G），陰性對照組無表達（圖2-H）；35日齡灘羊生殖母細胞、Sertoli細胞、管周肌樣細胞發(fā)出的陽性表達相對較弱（圖2-I，圖2-J，圖2-K）。平均光密度值統(tǒng)計結(jié)果顯示（圖3，表3），35 日齡睪丸組織INSL3 表達量相對初生睪丸組織顯著下降（P<0.05），且Leydig 細胞、Sertoli 細胞、生殖母細胞、管周肌樣細胞中INSL3 表達水平顯著降低（P<0.05）。

圖2 INSL3在初生及35日齡灘羊睪丸組織分布定位比較Figure 2 Comparison of the distribution of INSL3 in testicular tissue of newborn and 35 day-old Tan sheep

表3 INSL3在灘羊睪丸中不同細胞陽性分布統(tǒng)計Table 3 Positive distribution statistics of INSL3 in different cells in testis of Tan sheep

圖3 INSL3在初生及35日齡灘羊睪丸中平均光密度值統(tǒng)計結(jié)果Figure 3 Statistical results of average optical density of INSL3 in testis of newborn and 35 day-old Tan sheep

3 討 論

3.1 初生及35日齡灘羊睪丸組織特征比較

哺乳動物的睪丸組織在性成熟前發(fā)育明顯，其生精功能隨之發(fā)生變化。湖羊在初生至60日齡生精小管內(nèi)出現(xiàn)精原細胞和Sertoli 細胞［9］。Sertoli 細胞是決定精原干細胞（Spermatogonial stem cells，SSCs）分化命運的關(guān)鍵細胞，動物性成熟前后Sertoli細胞通過不同信號通路的激活控制著SSCs 增殖和細胞分化相關(guān)因子的表達［10］。研究表明，大鼠出生后Sertoli細胞快速增殖［7］；3月齡牦牛的生精小管以大量處于分裂期的幼稚型Sertoli細胞為主［11］。與此相一致，本試驗中初生及35日齡的灘羊生精小管尚未形成管腔，管內(nèi)主要為Sertoli 細胞及尚未分化的生殖母細胞。亦有研究表明：江香豬的Sertoli 細胞數(shù)量從15 日齡到30 日齡并沒有顯著的增加［12］。這種區(qū)別可能是由于物種間發(fā)育特點的差異所致。

幼稚Sertoli細胞核近圓形，表面有小凹陷，成熟后細胞核凹陷加深，細胞停止分裂并出現(xiàn)細胞間連接復合體［11］。研究表明，初生小鼠生精小管呈實心的索狀［13］。大鼠生精小管平均面積從出生至3月齡迅速增大并達到最大值［7］。本研究中，初生及35 日齡灘羊Sertoli 細胞均為幼稚型，分布于生精小管基底部固有膜內(nèi)側(cè)，胞質(zhì)呈錐形并突向管腔中央。35日齡灘羊生精小管的平均截面積相比初生灘羊顯著增大；Sertoli細胞數(shù)量增多，提示35日齡灘羊的生精小管管徑增加主要是以Sertoli 細胞的數(shù)量增加為主。

生殖母細胞是介于原始生殖細胞和精原干細胞間過渡態(tài)的細胞類型［14］。動物出生后的早期發(fā)育階段，生殖母細胞遷移至睪丸生精小管基膜附近并分化為精原細胞［1］。研究發(fā)現(xiàn)，1月齡山羊睪丸中存在大量位于生精小管中央的生殖母細胞，部分遷移到生精小管邊緣［15］。研究報道，新生田鼠生殖母細胞數(shù)量較少，隨發(fā)育向生殖細胞索周邊遷移［16］。與此相一致，本試驗中初生灘羊生殖母細胞多位于生精小管中央，而35日齡灘羊的生殖母細胞已有部分位于生精小管基膜周圍，提示生殖母細胞逐漸向管壁遷移。

Leydig細胞是睪丸組織中分泌睪酮的重要體細胞，其發(fā)育過程中存在胚胎型Leydig 細胞（Fetal Leydig cells，F(xiàn)LCs）和成年型Leydig 細胞（Adult Leydig cells，ALCs）［17］。Leydig 細胞的發(fā)育及分化一般只限于胚胎發(fā)生和青春期初期，一旦形成后，其細胞數(shù)量不會再發(fā)生顯著變化［18］。初生小鼠睪丸間質(zhì)中僅有分化較低且無分泌功能的間質(zhì)祖細胞（pro?genitor LC，PLCs），出生后28～35 d，PLCs逐漸分化為具有分泌功能的未成熟間質(zhì)細胞（immature LC，ILCs），PLCs與ILCs在形態(tài)上最大的差異是從紡錘形變?yōu)閳A形，細胞核也變大［19］。研究表明，初生小香豬睪丸中存在大量形態(tài)較小的Leydig細胞，1月齡時則出現(xiàn)大的Leydig 細胞，生精小管單位面積Leydig細胞數(shù)量減少［20］。本試驗中，初生至35日齡的灘羊Leydig 細胞核明顯縮小，核質(zhì)比下降，核由橢圓形、不規(guī)則形逐漸趨向圓形，且細胞核深染；提示初生至35日齡的灘羊Leydig類型由PLCs向ILCs分化。

管周肌樣細胞是圍繞生精小管呈環(huán)形排列的類肌成纖維細胞，即有成纖維細胞的特點又有平滑肌細胞的特性，細胞扁平呈星形或長形，核橢圓，與Sertoli 細胞一起形成精原干細胞龕的細胞邊界［21］。研究表明，管周肌樣細胞會產(chǎn)生膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF），并向未分化的精原細胞發(fā)出信號，參與精原細胞與Sertoli 細胞的功能調(diào)節(jié)［22］。本試驗中管周肌樣細胞呈單層環(huán)形分布于固有膜外周，初生至35日齡灘羊管周肌樣細胞增加且隨生精小管的增大而更加細長，提示管周肌樣細胞形態(tài)發(fā)育趨勢與生精小管體積的增大保持一致，其功能變化有待于進一步研究。

3.2 初生及35日齡灘羊睪丸組織化學特征比較

睪丸組織中糖類物質(zhì)是精子發(fā)生所必須的營養(yǎng)，通過血管及固有膜提供給生精上皮。研究表明，睪丸中細胞能量代謝是Sertoli細胞通過葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT）將睪丸間質(zhì)中的葡萄糖進行糖酵解，產(chǎn)生的乳酸通過單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白（MCT）轉(zhuǎn)運出細胞外供生精細胞利用［23］。王乾梅等［24］研究表明，正常山羊生精小管周圍分布有較多的酸性糖原。PAS及AB-PAS 陽性反應(yīng)的糖原，糖蛋白以及蛋白多糖存在于睪丸結(jié)締組織，粘液以及基膜中，健康大鼠睪丸PAS陽性反應(yīng)隨生精細胞的成熟而逐漸增強，糖原類物質(zhì)代謝與正常睪丸發(fā)育水平呈正比［25］。而老齡牦牛睪丸間質(zhì)血管及生精小管固有膜中PAS 及AB-PAS陽性反應(yīng)增強與間質(zhì)組織中結(jié)締組織合成增加有關(guān)［26］。因此，隨著睪丸的發(fā)育，睪丸內(nèi)多糖類物質(zhì)的增多與睪丸發(fā)育水平呈正相關(guān)，本研究中，初生至35日齡灘羊的生精小管固有膜上糖原類物質(zhì)分布增加，且酸性糖原的增長明顯，表明在睪丸發(fā)育過程中酸性糖類物質(zhì)代謝優(yōu)于其他糖類成分。

研究發(fā)現(xiàn)，小鼠睪丸間質(zhì)結(jié)締組織的變化可能會影響睪丸局部代謝，其與生精上皮的發(fā)育以及精子的發(fā)生密切相關(guān)［27］。幼齡期牦牛睪丸組織被膜發(fā)育基本完善，結(jié)締組織部分主要為膠原纖維，隨著牦牛發(fā)育，睪丸內(nèi)網(wǎng)狀和膠原纖維逐漸致密并同步增長；性成熟前牦牛睪丸間質(zhì)組織中膠原纖維含量較少，網(wǎng)狀纖維較多［28］。藏綿羊生精小管外周膠原纖維分布明顯，Leydig 細胞散在分布于豐富的膠原纖維之間，固有膜及血管外周的網(wǎng)狀纖維較豐富［29］。本研究中，35日齡較初生灘羊睪丸間質(zhì)中膠原分布有明顯增長，網(wǎng)狀纖維分布變化不明顯，表明網(wǎng)狀纖維在灘羊睪丸發(fā)育過程中形成較早，其生成早于膠原纖維。

3.3 初生及35日齡灘羊睪丸組織INSL3分布特征比較

INSL3 為Leydig 胰島 素樣因子 或Leydig 細胞特異性胰島素樣肽（LEY-IL）［30］。正常男性，INSL3主要表達于出生前和出生后Leydig 細胞，胎兒期Leydig 細胞上高表達，對引帶及睪丸的發(fā)育起到促進作用［3］。嬰兒出生后其表達量逐漸下降至青春期前最低。研究證實，人類男性胚胎期血清INSL3 濃度是青春期前的2～4倍，青春期Leydig細胞逐漸成熟，血清INSL3水平會再度升高，對睪丸的成熟起到重要作用［31］。本研究中，INSL3在初生和35日齡灘羊Leydig 細胞中均有較高的陽性表達，提示在早期發(fā)育階段Leydig 細胞可以通過分泌INSL3 調(diào)控睪丸組織的發(fā)育；在初生至35日齡灘羊的Leydig細胞中INSL3 表達強度顯著下降，這可能與FLCs 細胞在睪丸組織中所占比例逐漸減少有關(guān)。

INSL3 可抑制公豬睪丸的生殖細胞凋亡［32］，刺激小鼠Leydig 細胞系TM3 在體外的增殖［33］。Sa?bine H K 等［34］研究表明，INSL3 在生殖細胞有絲分裂高峰時Sertoli 細胞中高表達，從而間接影響精原細胞的分裂，提示INSL3 在介導促性腺激素作用中的重要性。本研究中，INSL3在Sertoli細胞、管周肌樣細胞中生殖母細胞INSL3 的表達量相對較弱，且隨時間推移呈下降趨勢，提示INSL3 的含量與生殖母細胞的發(fā)育呈負相關(guān)。

4 結(jié) 論

綜上所述，初生及35日齡灘羊生精小管管腔尚未形成，生精小管以未成熟的Sertoli細胞為主，并隨著Sertoli 細胞數(shù)量和體積的增加而增大；灘羊初生至35日齡睪丸發(fā)育過程中，酸性糖類物質(zhì)代謝優(yōu)于其他糖類成分，網(wǎng)狀纖維生成早于膠原纖維。INSL3 對睪丸生精細胞無明顯調(diào)節(jié)作用；其表達降低與Leydig 細胞中FLCs 細胞群逐漸減少相一致。本研究為INSL3 對Leydig 細胞分泌功能調(diào)控機制的研究提供了參考。