郭宇峰 高興強(qiáng) 鄧海燕 劉美蓮 陸旖

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是易感個體接觸變應(yīng)原后由特異性IgE 介導(dǎo)的鼻黏膜的非感染性炎性疾病。AR患病率在全球范圍內(nèi)逐年上升，患病率為2.2%～45.1%。我國AR發(fā)病率也在不斷升高，我國成人AR自報平均患病率則為11.4%,中國同齡兒童AR患病率為10.4%，并且每年以0.33%的速度上升[1-2]。對于變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病的機(jī)制尚無定論，目前研究熱點包括遺傳基因的影響、免疫功能紊亂及環(huán)境因素等方面。近年來對AR致病基因的研究發(fā)現(xiàn)有多個與它相關(guān)的候選基因區(qū)。美國學(xué)者Dixit等[3]發(fā)現(xiàn)了一種具有高度生物活性的胞質(zhì)蛋白質(zhì)，命名為腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3（tumor necrosis factor alpha-induced protein 3，TNFAIP3）。大 量 研究表明，TNFAIP3作為促炎因子核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的負(fù)調(diào)控因子，是機(jī)體炎癥反應(yīng)的保護(hù)因素之一[4-6]。TNFAIP3近年來成為治療炎癥性疾病的潛在靶點而受到關(guān)注。本實驗在2019年1月—2020年1月開展，利用變應(yīng)性鼻炎大鼠模型，在其致敏-治療過程中研究TNFAIP3基因在鼻腔黏膜上皮的表達(dá)，研究其與變態(tài)反應(yīng)進(jìn)程的關(guān)系，為探討TNFAIP3在免疫進(jìn)程中的作用、能否作為AR治療的新思路提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

健康Wistar大鼠24只，雌雄各半，普通級，6～8周齡，體質(zhì)量250～300 g。購自廈門大學(xué)實驗動物中心，由廈門大學(xué)實驗動物科學(xué)部代養(yǎng)。該研究獲得廈門市兒童醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。實驗動物隨機(jī)分為三組，每組8只。

1.2 動物模型的建立與模型評價

AR大鼠（取16只）參照文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行建模。基礎(chǔ)致敏階段：造模大鼠每只以卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美國Sigma，貨號A5503-1G）0.3 mg作抗原，氫氧化鋁粉末（美國Sigma貨號239186-25g）30 mg作為佐劑，加生理鹽水1 mL形成混懸液腹腔注射；隔日1次，共7次（第1～14天的單數(shù)日）。加強(qiáng)致敏階段：腹腔注射完成后，每只大鼠以0.25%卵清蛋白生理鹽水霧化吸入10 min，1次/d，連續(xù)5 d（第15～19天）。激發(fā)階段：間歇3 d后，以10%卵清蛋白用微量加樣器滴入大鼠雙側(cè)鼻腔，20 μL/次，1次/d，共7次（第23～29天）。打噴嚏和撓鼻次數(shù)在最后一次激發(fā)結(jié)束后10 min進(jìn)行計數(shù)。治療組（8只）：模型組中選擇8只做治療組，給予西替利嗪滴劑（商品名：仙特明；生產(chǎn)企業(yè)：UCB Pharma S.p.A意大利；批準(zhǔn)文號：進(jìn)口藥品注冊證號H20110137；規(guī)格：10 mL∶100 mg），1次/d，每次20 μL滴鼻，連續(xù)2周。模型組（8只）：除治療組外的剩余AR大鼠給與生理鹽水滴鼻。對照組（8只）：全程只用生理鹽水（正常組）。

AR大鼠模型主要表觀指標(biāo)：（1）出現(xiàn)擦鼻、噴嚏、流涕、鼻塞等局部過敏癥狀；（2）滴鼻激發(fā)后癥狀明顯增加；（3）按過敏反應(yīng)行為的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。表觀指標(biāo)可量化積分或半量化分級。噴嚏次數(shù)：1～3次為1分，4～10次為2分，≥11次為3分；抓鼻次數(shù)：1～4次為1分，4次以上為4分；清涕：流至前鼻孔為1分，超出前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。進(jìn)行積分累加，其癥狀觀察時間為每次給致敏物開始計時，共30 min，總評分≥5分判定為成功致敏。

1.3 大鼠鼻腔黏膜標(biāo)本的獲取

殺死大鼠，先取鼻中隔黏膜，將鼻部中間往上剪開，暴露鼻甲，鑷子從鼻中插入，向上掀開鼻甲骨，找到鼻中隔，小心剝離兩側(cè)附著的黏膜，一份固定做免疫組化，一份-80℃凍存。

1.4 組織病理學(xué)分析

應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測不同處理組的24個大鼠鼻腔黏膜組織的NF-κB、TNFAIP3的表達(dá)情況。大鼠鼻腔黏膜組織用4%多聚甲醛固定，流水滴洗，經(jīng)不同濃度的乙醇梯度脫水，二甲苯進(jìn)行組織透化后石蠟進(jìn)行包埋，包埋后的蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片。按抗體說明書條件NF-κB、TNFAIP3均以檸檬酸修復(fù)液（pH 6.0）煮沸修復(fù)15 min；免疫組化油筆在組織周圍3～5 mm處畫圈，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，5 min/次；阻斷、滅活內(nèi)源性過氧化物酶；正常羊血清工作液封閉非特異位點；按各抗體工作濃度稀釋抗體，滴加一抗4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，5 min/次；滴加二抗，37℃孵育15 min，PBS沖洗3次，5 min/次；滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶，37℃孵育15 min，PBS沖洗3次，5 min/次；DAB反應(yīng)染色，顯微鏡下觀察顯色情況，自來水充分沖洗結(jié)束顯色；蘇木素復(fù)染5 min，流水沖洗，自來水浸洗5 min返藍(lán)；脫水透明，中性樹膠封片。并應(yīng)用蘇木素-伊紅染色（HE染色）后光鏡下觀察檢測鼻黏膜組織中嗜酸性粒細(xì)胞的分布情況。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR）對各組動物鼻黏膜樣本中NF-κB和TNFAIP3基因mRNA的含量進(jìn)行檢測（引物序列見表1），實驗按照實時熒光定量RT-PCR試劑盒所規(guī)定的步驟進(jìn)行，實驗所得數(shù)據(jù)用ΔCT法表示。

表1 qPCR引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 Graphpad Prism 6統(tǒng)計軟件分析所得數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗呈正態(tài)分布，樣本量較小，計量資料以（±s）表示，兩組間差異的比較采用t檢驗，多組間差異的比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AR大鼠模型的建立

AR組大鼠可見擦鼻、噴嚏、流涕、鼻塞等局部過敏癥狀；滴鼻激發(fā)后癥狀明顯增加；評分總分均≥5分。模型組平均評分（6.31±0.57）分，明顯高于正常組的（0.92±0.18）分及治療組的（1.35±0.51）分，模型組與正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=56.11，P＜0.01），模型組與治療組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=32.70，P＜0.01），說明AR大鼠模型建立成功。

2.2 組織病理學(xué)變化

嗜酸性粒細(xì)胞染色主要是檢測樣本組織中嗜酸性粒細(xì)胞的存在和分布情況，對照組和治療組的所有組織切片中未觀察到嗜酸性粒細(xì)胞的存在，模型組部分組織中存在嗜酸性粒細(xì)胞密集分布的情況（如圖1）。

圖1 大鼠鼻中隔黏膜組織上皮嗜酸性粒細(xì)胞浸潤情況（HE染色，×400）

進(jìn)行免疫組化NF-κB指標(biāo)檢測的樣本切片閱片可見模型組切片陽性顯色密集，治療組有陽性顯色，對照組僅有散在的陽性顯色，各組切片有明顯差異（如圖2）。

圖2 大鼠鼻中隔黏膜NF-κB胞漿表達(dá)情況（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法，×400）

免疫組化TNFAIP3指標(biāo)檢測的樣本切片閱片可見治療組與對照組切片均有較密集的陽性顯色，兩組間對比差異不大，模型組呈陰性表達(dá)，模型組對比治療組與對照組有顯著差異（如圖3）。

圖3 大鼠鼻中隔黏膜TNFAIP3胞漿表達(dá)情況（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法，×400）

2.3 鼻黏膜組織中NF-κB、TNFAIP3基因在對照組、模型組及治療組中的表達(dá)水平

模型組TNFAIP3基因表達(dá)水平（4.601±0.796）、對照組（7.430±1.026）、治療組（7.175±0.804）；模型組比對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.178，P＜0.05）；模型組比治療組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.274，P＜0.05）；治療組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.195，P＞0.05）。模型組NF-κB基因表達(dá)水平（6.046±0.665）、對照組（3.498±0.663）、治療組（4.056±0.333），模型組比對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.714，P＜0.05），模型組比治療組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.677，P＜0.05），治療組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.175，P＞0.05）。

3 討論

變應(yīng)性鼻炎是以清水樣鼻涕、鼻塞等臨床表現(xiàn)為主，可伴眼部癥狀及耳部癥狀，不危及生命，但會顯著影響患者的生活質(zhì)量。隨著近年來對其發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入，對AR致病基因的研究發(fā)現(xiàn)有多個與它相關(guān)的候選基因區(qū)，NF-κB是研究的熱點之一，NF-κB的激活使變態(tài)反應(yīng)炎癥因子級聯(lián)放大，形成炎癥風(fēng)暴，眾多文獻(xiàn)證明其在AR中起關(guān)鍵作用[8-9]。TNFAIP3蛋白同時具有泛素化以及去泛素化兩種功能，作為NF-κB的負(fù)調(diào)控因子，是機(jī)體炎癥反應(yīng)的保護(hù)因素之一[10]。早期細(xì)胞系實驗發(fā)現(xiàn)持續(xù)過表達(dá)的TNFAIP3可顯著抑制NF-κB的激活，降低NF-κB靶基因的表達(dá)，包括細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）,白介素-8（interleukin-8，IL-8），核因子κB的抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκBα）組織因子，血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1），白介素-6（interleukin-6，IL-6）以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）。TNFAIP3負(fù)調(diào)節(jié)NF-κB的生物活性，主要是通過抑制腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）途徑和Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）途徑來實現(xiàn)的[11-12]。TNFAIP3基因敲除小鼠模型證明了其在炎癥負(fù)調(diào)控中的重要作用，TNFAIP3-/-小鼠在出生后不久即死于多器官的嚴(yán)重炎癥和組織多發(fā)損傷，包括肝臟、腎臟、腸道、關(guān)節(jié)及骨髓等[13]。Lee等[14]研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP3蛋白過表達(dá)可抑制由TNF，白介素-1（interleukin-1，IL-1）及脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后核轉(zhuǎn)錄激活因子-1（activator protein-1，AP-1）的激活從而改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥表現(xiàn)。TNFAIP3近年來成為治療炎癥性疾病的潛在靶點而受到關(guān)注。

本實驗免疫組化發(fā)現(xiàn)AR大鼠模型組鼻黏膜組織中炎癥因子NF-κB指標(biāo)陽性顯色，RT-PCR檢測也發(fā)現(xiàn)鼻腔黏膜組織中NF-κB基因表達(dá)在模型組中高于治療組與對照組。NF-κB作為炎癥和免疫反應(yīng)的樞紐因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮級聯(lián)放大瀑布效應(yīng)，在變態(tài)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠鼻黏膜免疫組化TNFAIP3指標(biāo)檢測治療組與對照組切片均有較密集的陽性顯色，而模型組為陰性表達(dá)，兩者對比有顯著差異。RT-PCR檢測也發(fā)現(xiàn)TNFAIP3 mRNA在模型組中低于治療組與對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TNFAIP3作為促炎因子NF-κB的負(fù)調(diào)控因子，其水平下降意味著對NF-κB的負(fù)調(diào)控能力下調(diào)，后者升高可帶來一系列嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，即模型組小鼠出現(xiàn)明顯的噴嚏、流涕等變應(yīng)性炎癥癥狀。本實驗治療組TNFAIP3的表達(dá)較模型組明顯增高，而NF-κB降低，大鼠鼻腔炎癥反應(yīng)減輕。說明TNFAIP3升高可下調(diào)NF-κB因子水平來降低氣道高反應(yīng)性并抑制氣道炎癥因子級聯(lián)瀑布效應(yīng)。

隨著遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，越來越多的學(xué)者認(rèn)為變應(yīng)性鼻炎的多種表現(xiàn)型都處于較強(qiáng)的遺傳控制之下，是一種具有多基因遺傳傾向的疾?。荒壳耙阎蛉鏘L-23R、MRPL4及TNF-α的SNP均與AR易感性有關(guān)[15]。國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)TNFAIP3基因多態(tài)性與漢族人群AR遺傳易感性有關(guān)，楊盈琳等發(fā)現(xiàn)TNFAIP3基因的rs9494885SNP位點及rs7753873SNP位點與AR遺傳易感性密切相關(guān)[16]。且有研究報道在AR人群中鼻黏膜TNFAIP3基因和蛋白的表達(dá)水平較健康對照組降低，與本實驗動物模型研究指標(biāo)一致[17]。除外變應(yīng)性疾病，國內(nèi)外較多文獻(xiàn)報道在各類自身免疫病及炎癥疾病人群中TNFAIP3的表達(dá)均較正常人群低。如Bruno等[18]發(fā)現(xiàn)在克羅恩病患者中，炎性結(jié)腸黏膜組織的TNFAIP3基因表達(dá)低于健康對照者；Wang等[19]發(fā)現(xiàn)TNFAIP3蛋白表達(dá)的下降與歐洲和韓國人群中SLE的發(fā)病呈顯著相關(guān)；魏潔瓊等[20]發(fā)現(xiàn)甲亢組外周血中鋅指蛋白TNFAIP3mRNA 表達(dá)水平低于正常對照組，低水平的TNFAIP3表達(dá)可能在甲亢Graves病發(fā)生發(fā)展免疫應(yīng)答中起到作用。但在國內(nèi)也有文獻(xiàn)報道AR模型小鼠鼻黏膜中TNFAIP3mRNA和蛋白表達(dá)水平增高，作者推測急性炎癥誘導(dǎo)了TNFAIP3的表達(dá)，從而抑制NF-κB的炎癥反應(yīng)[21]。此結(jié)果與本實驗相反，可能為炎癥急性期TNFAIP3在鼻黏膜中表現(xiàn)出應(yīng)激性增高，隨著炎癥的進(jìn)展，TNFAIP3的表達(dá)逐漸降低。

綜上所述，變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生發(fā)展與許多炎癥因子密切相關(guān)。其中鋅指蛋白TNFAIP3作為炎癥觸發(fā)因子NF-κB的負(fù)調(diào)控因素，為阻止機(jī)體發(fā)生變態(tài)反應(yīng)發(fā)揮了不可替代的作用。本實驗通過動物模型進(jìn)一步證明了TNFAIP3的作用，為變應(yīng)性疾病的預(yù)防和治療提供了新的思路。