肖毓淼， 王旭承， 崔永一*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 集賢學(xué)院，浙江 杭州 311300； 2.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300)

蘭科植物主產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)，具有較高的觀賞與經(jīng)濟(jì)價(jià)值，種類豐富，各具特點(diǎn)[1]。雜交蘭K6由大花蕙蘭皇后和春蘭黃水仙雜交培育而成，雜交性狀優(yōu)良，花型典雅，花色鮮艷，觀賞價(jià)值高，具有較高的市場(chǎng)前景[2]。姚金澳等[3]研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、防褐化物質(zhì)，以及不同種類有機(jī)添加物可提高組培苗的性狀與質(zhì)量。雜交蘭K6的母本大花蕙蘭喜溫暖環(huán)境，生長(zhǎng)適溫為15～20 ℃，低于5 ℃則發(fā)芽期延長(zhǎng)，生長(zhǎng)受阻[4]；其父本春蘭生長(zhǎng)適溫為15～25 ℃，低于10 ℃則生長(zhǎng)緩慢，0 ℃時(shí)會(huì)發(fā)生凍害[5]。其組培苗馴化成活率低，植株纖弱，開(kāi)花延遲，更易受高低溫、干旱、水澇、病原菌等逆境脅迫的傷害，其中溫度對(duì)雜交蘭的生長(zhǎng)發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，低溫冷害也是雜交蘭栽培過(guò)程中常遇到的自然災(zāi)害之一，制約著雜交蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。

海藻富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，包括維生素、多糖、藻朊酸、甘露醇、甜菜堿、高度不飽和脂肪酸、抗生素及多種天然植物激素等[6]，以海藻提取物為原料的海藻肥已在中國(guó)有機(jī)食品技術(shù)規(guī)范中被明確認(rèn)定為有機(jī)農(nóng)業(yè)的應(yīng)用產(chǎn)品[7]。海藻肥已被證實(shí)能有效幫助植物緩解抵御非生物逆境脅迫，如干旱、低溫、鹽堿等[8]。管宇翔等[9]研究發(fā)現(xiàn)，海藻肥處理能提高黃瓜葉片相對(duì)含水量和葉綠素含量，提高SOD和POD的活性。孫錦等[10]研究發(fā)現(xiàn)，噴施海藻肥可顯著提高番茄幼苗的抗旱性。羅增濤等[11]發(fā)現(xiàn)，噴施海藻肥的黃瓜試驗(yàn)苗在低溫脅迫下葉片相對(duì)含水量、葉綠素含量、呼吸強(qiáng)度和氣孔阻力均顯著大于對(duì)照苗，而葉片蒸騰強(qiáng)度低于對(duì)照苗。綜上表明，海藻肥能影響逆境脅迫下植株的生理生化特性，增強(qiáng)抗逆能力。

海藻肥作為一種新型生物有機(jī)肥，尚未見(jiàn)其施用于雜交蘭的研究報(bào)道，而低溫脅迫在一定程度上制約著雜交蘭組培苗的生長(zhǎng)分化。本研究將海藻肥噴施處理雜交蘭K6幼苗，通過(guò)對(duì)植株活性氧、MDA含量及抗氧化酶活性的測(cè)定，表征其對(duì)雜交蘭抗低溫能力的影響，同時(shí)該研究為海藻肥在雜交蘭種苗生產(chǎn)上的應(yīng)用提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植株為浙江農(nóng)林大學(xué)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供的K6雜交蘭組培苗，為大花蕙蘭皇后(Cymbidiumhybridumcv. Princess Nobuko♀)和春蘭黃水仙(Cymbidiumgoeringiicv. Huangshuixian♂)雜交培育而成，K6幼苗為本試驗(yàn)初始培養(yǎng)材料。海藻肥由杭州青洋科技有限公司提供，主要成分為海藻多糖、海藻多酚、微量元素等。

1.2 處理設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年7—12月在浙江農(nóng)林大學(xué)智能溫室中進(jìn)行，栽培基質(zhì)由松鱗、泥炭、蛭石按3∶1∶1的比例配制。

將海藻肥稀釋成1 500(T1)、1 000(T2)、500倍(T3)共3個(gè)濃度處理，以清水噴施為對(duì)照(CK)。采用完全隨機(jī)試驗(yàn)，每處理20盆苗，重復(fù)3次，噴施間隔為7 d，每處理每次噴施海藻肥1 500 mL。

連續(xù)處理6個(gè)月，待冬季寒潮來(lái)臨時(shí)，將所有處理組植株進(jìn)行低溫脅迫處理。上午8：00先將其從智能溫室移至室外，并用實(shí)時(shí)溫度儀監(jiān)控氣溫，此時(shí)室外平均溫度為0 ℃，然后分別于10：00、14：00、18：00作為3次取樣時(shí)間，挑選長(zhǎng)勢(shì)健壯、生長(zhǎng)均勻的植株10盆，隨機(jī)取各處理植株的葉片，以液氮速凍后保存于-70 ℃超低溫冰箱，供各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定。

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)定方法

葉綠素總量測(cè)定采用乙醇浸提法[12]；過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[13]；超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光化還原法[14]；丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法[15]；過(guò)氧化氫(H2O2)含量測(cè)定采用林植芳等[15]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。將上述測(cè)得的數(shù)據(jù)在SPSS 26.0軟件中進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，采用Duncan’s進(jìn)行多重比較顯著性水平，利用Excel軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻肥對(duì)低溫脅迫下雜交蘭葉綠素總量的影響

葉綠素含量和比例是反映植物光合能力的間接指標(biāo)[16]。由圖1可知，雜交蘭經(jīng)2 h低溫脅迫后，CK處理葉片的葉綠素含量顯著大于T1、T2、T3處理，然而CK處理經(jīng)過(guò)6 h、10 h低溫脅迫后，葉片的葉綠素含量均顯著小于T1、T2、T3處理。雖然海藻肥常溫下可能抑制了葉片葉綠素的合成，但在低溫脅迫6 h后，3組不同稀釋倍數(shù)的海藻肥處理的植株葉片的葉綠素含量均顯著大于對(duì)照，說(shuō)明噴施3種不同濃度海藻肥對(duì)于雜交蘭低溫脅迫下葉綠素的降解均具有緩解作用。經(jīng)2、6 h低溫脅迫時(shí)，T1處理的葉片葉綠素含量顯著大于T2、T3處理，經(jīng)10 h低溫脅迫后，T3處理的葉片葉綠素含量顯著大于T2，T2處理的葉片葉綠素含量顯著大于T1，說(shuō)明雜交蘭在較長(zhǎng)時(shí)間的低溫脅迫下，濃度較高的T3處理對(duì)于葉片葉綠素的降解具有更好的緩解作用。

柱上不同小寫字母表示組間0.05水平上差異顯著。圖2、3同。圖1 海藻肥對(duì)低溫脅迫下雜交蘭葉綠素總量的影響

2.2 海藻肥對(duì)低溫脅迫下雜交蘭細(xì)胞膜損傷的影響

2.2.1 海藻肥對(duì)低溫脅迫下MDA含量的影響

圖2顯示，在不同低溫處理時(shí)間下，CK組的MDA含量持續(xù)增加，至低溫脅迫10 h時(shí)達(dá)到最大值。T1、T2、T3組MDA含量在低溫脅迫2 h時(shí)達(dá)到最大值，之后持續(xù)下降，在低溫脅迫6 h時(shí)達(dá)到最低值，之后呈緩慢上升的趨勢(shì)。

在相同的處理時(shí)間下，不同處理組之間也存在差異。低溫脅迫2 h時(shí)，各處理組間MDA含量無(wú)顯著差異；在6 h時(shí)，海藻肥處理的MDA含量均顯著小于CK，其中，T1、T2間差異不顯著，均顯著高于T3；在10 h時(shí)，T2、T3的MDA含量顯著小于CK，其中，T1、T2差異不顯著，均顯著高于T3，而T1與CK無(wú)顯著性差異。

2.2.2 海藻肥對(duì)低溫脅迫下H2O2含量的影響

圖2顯示，從低溫處理的不同時(shí)間來(lái)看，各處理的H2O2含量均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而提升，并在10 h時(shí)達(dá)到最大。從相同處理時(shí)間看，在低溫脅迫2 h時(shí)，各處理之間H2O2含量無(wú)顯著性差異；在6 h時(shí)，海藻肥處理的H2O2含量均顯著低于CK，并分別較CK組下降17.73%、19.85%、33.99%；在10 h時(shí)，海藻肥處理的H2O2含量均顯著低于CK，并分別較CK組下降20.48%、26.10%、31.05%。

圖2 海藻肥低溫脅迫下對(duì)雜交蘭細(xì)胞膜損傷的影響

2.3 海藻肥對(duì)低溫脅迫下雜交蘭抗氧化酶的影響

2.3.1 海藻肥對(duì)低溫脅迫下POD活性的影響

圖3顯示，從低溫處理的不同時(shí)間來(lái)看，各處理的POD活性均隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而提升，并在10 h時(shí)達(dá)到最大。從相同處理時(shí)間看，在2 h、6 h、10 h低溫處理時(shí)，海藻肥處理的POD活性均顯著大于CK。從海藻肥處理之間來(lái)看，在2 h時(shí)，T2顯著大于T1、T3；在6 h時(shí)，T2、T1顯著大于T3；在10 h時(shí)，T1、T2、T3之間無(wú)顯著性差異。

圖3 海藻肥對(duì)低溫脅迫下雜交蘭抗氧化酶的影響

2.3.2 海藻肥對(duì)低溫脅迫下SOD活性的影響

圖3顯示，從低溫處理的不同時(shí)間來(lái)看，各處理的SOD活性均隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而提升，并在10 h時(shí)達(dá)到最大。從相同處理時(shí)間來(lái)看，在2、6、10 h低溫處理時(shí)，3個(gè)海藻肥處理的SOD活性均顯著大于CK。從3個(gè)海藻肥處理之間來(lái)看，在2 h時(shí)，T2顯著大于T1，而T3與T1、T2間無(wú)顯著性差異；在6 h時(shí)，T2、T3顯著大于T1；在10 h時(shí)，T2顯著大于T1、T3，T1顯著大于T3。

3 討論

3.1 海藻肥對(duì)低溫脅迫下雜交蘭葉綠素總量的影響

葉綠素含量與植株的光合作用能力、發(fā)育階段具有較好的相關(guān)性，通常是光合能力和植株發(fā)育階段的指示器，因此，葉綠素含量是作為監(jiān)測(cè)低溫脅迫后植株生長(zhǎng)健康狀況的重要指標(biāo)之一[17]。宋修超等[18]向低溫脅迫下菜椒葉苗噴施6種不同濃度海藻酸有機(jī)水溶肥料發(fā)現(xiàn)，葉綠素含量均不同程度地提高。趙建鋒等[19]研究發(fā)現(xiàn)，草莓葉片隨著海藻肥稀釋倍數(shù)的減小，葉片葉綠素含量增多，且稀釋400倍時(shí)，草莓葉片葉綠素含量最高，這與本研究的試驗(yàn)結(jié)果基本一致，說(shuō)明較高濃度海藻肥能促進(jìn)葉綠素合成。本試驗(yàn)中，雜交蘭葉片經(jīng)低溫脅迫后，葉綠素的分解隨海藻肥濃度減小而減小，說(shuō)明海藻肥對(duì)低溫脅迫下雜交蘭葉片葉綠素分解具有緩解作用。

3.2 海藻肥對(duì)低溫脅迫下雜交蘭細(xì)胞膜損傷和抗氧化酶活性的影響

植物在遭受低溫脅迫時(shí)，活性氧代謝平衡易被打破，在植物組織中大量積累。在此過(guò)程中，氧易得到單電子而形成超氧陰離子，并發(fā)生自由基連鎖反應(yīng)，經(jīng)過(guò)一系列代謝反應(yīng)生成H2O2，并在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生哈伯-維斯(Haber-Weiss)反應(yīng)，產(chǎn)生羥基自由基(OH-)，其高度活躍，能氧化細(xì)胞內(nèi)幾乎所有組分，引發(fā)細(xì)胞損傷[20]。同時(shí)，活性氧的大量積蓄，容易破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)，加重膜脂質(zhì)的過(guò)氧化，產(chǎn)生MDA[21]。因此，及時(shí)清除H2O2和維持較低的MDA水平能使植株保持正常的生理活動(dòng)，提高植物的抗低溫脅迫能力。本試驗(yàn)中，在同一處理時(shí)間內(nèi)，處理組H2O2含量和MDA含量都顯著小于對(duì)照組，其中以噴施稀釋500倍海藻肥組緩解效果最佳。

低溫脅迫下，低溫逆境敏感的植物細(xì)胞中加速產(chǎn)生活性氧，而活性氧清除能力下降，導(dǎo)致活性氧水平的升高，所以低溫脅迫下活性氧對(duì)植物細(xì)胞所引起的損傷是傷害產(chǎn)生的原因之一[22]。Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，嫁接西瓜幼苗的耐冷性增強(qiáng)與抗氧化劑和抗氧化酶活性的增加有關(guān)。楊錦等[24]研究發(fā)現(xiàn)，海藻肥處理能顯著增強(qiáng)菜心葉片中抗氧化酶活性，有效清除葉片氧自由基，降低細(xì)胞膜氧化損傷，以此提高菜心抗旱性。王強(qiáng)等[25]研究發(fā)現(xiàn)，海藻肥處理能顯著增強(qiáng)黃瓜的SOD、POD活性，幫助清除植株內(nèi)活性氧，以此提高黃瓜抗鹽分脅迫能力。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，噴施海藻肥能顯著提高雜交蘭抗氧化系統(tǒng)的能力，其中噴施500倍稀釋濃度海藻肥對(duì)增加POD、SOD活性最明顯。

4 小結(jié)

噴施500、1 000倍稀釋濃度海藻肥均能顯著提高雜交蘭抗低溫脅迫能力，其中以500倍為最佳，在該濃度下，雜交蘭葉綠素含量更穩(wěn)定，受低溫影響最小，細(xì)胞膜受活性氧影響損傷更小，表現(xiàn)在MDA和H2O2含量均顯著小于對(duì)照和其他處理組，抗氧化酶POD、SOD活性顯著大于對(duì)照，說(shuō)明清除葉片氧自由基的能力更強(qiáng)。但本試驗(yàn)僅在生理層面分析了海藻肥緩解雜交蘭低溫脅迫的生理特性，且只對(duì)雜交蘭K6進(jìn)行了試驗(yàn)，海藻肥在提高雜交蘭低溫抗性上是否具有廣譜性，后期還需進(jìn)一步研究，以期能夠在雜交蘭的生產(chǎn)中進(jìn)行規(guī)?；瘧?yīng)用。