楊 柳，張欣雅，王 靜，王 怡，程汝陽，李晨響，李 爽，趙世超，李建民

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著人們飲食、運動等生活習慣的改變以及社會人口結(jié)構(gòu)的變化，糖尿病的發(fā)病率逐漸升高。糖尿病腎病(DN)作為糖尿病最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，已成為終末期腎臟病(ESRD)的首位病因，其發(fā)病率亦呈上升趨勢[1]。近年來越來越多的學者發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(BPI3K/Akt)信號通路與糖尿病腎病患者因長期高血糖引起促炎因子和氧化應激產(chǎn)物增加而引起的腎小管上皮細胞損傷有關(guān)[2-3]。目前研究認為黃芩素具有抗炎、抗變態(tài)反應、抗氧化應激、抗腫瘤、抗血栓形成和保護肝臟、心腦血管、神經(jīng)元等多種生物學作用[4]，對糖尿病腎病有一定的防治作用[5]。因此，本課題以體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細胞(HK-2)為研究對象，探討黃芩素是否基于PI3K/Akt信號通路對糖尿病腎病發(fā)揮治療作用，為其臨床應用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1細胞株 HK-2細胞株購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2實驗藥品和試劑 黃芩素(成都曼思特生物，批號：DH0093，純度≥90%)；高糖：分析純葡萄糖粉溶于DMEM培養(yǎng)基；DMEM低糖培養(yǎng)基(Hyclone，生產(chǎn)批號：NZM1301)，胎牛血清(Hyclone，生產(chǎn)批號：NYB0614)，胰酶(Hyclone，生產(chǎn)批號：021005)，四甲基噻唑藍(MTT，Sigma公司，生產(chǎn)批號：021005)，二甲基亞砜(DMSO，天津市富宇精細化工有限公司，生產(chǎn)批號：20130716)，活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號分別為：S0033，20151208)，β-αctin抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：16A00205)，磷酸化磷酸肌醇3-激酶(p-PI3K)抗體、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗體、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體(博奧森生物有限公司，生產(chǎn)批號分別為：AD06235847E，BST10C17B，GR251111-2)，二抗羊抗小鼠、二抗羊抗兔(博士德生物有限公司，生產(chǎn)批號：BST10101A，BST10C17B)，SGExcel UltraSYBR Mixture(With ROX)(生工生物有限公司，生產(chǎn)批號：B532956)。

1.3實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱(HF90型，上海智城分析儀器公司)，倒置顯微鏡(IX-71-21PH型，日本Olympus)，實時熒光定量PCR(M×3000P型，美國Agilent Stratagene公司)，全自動生化儀(MS-500A型，四川美生科技有限公司)，一體式微型化學發(fā)光成像儀(Smart chemi Ⅱ型，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技公司)，酶標儀(MK3型，上海熱電儀器有限公司)。

1.4實驗方法 顯微鏡下觀察HK-2細胞密度達80%以上時，將每孔1×104個細胞接種于96孔板中，依據(jù)預實驗結(jié)果以及文獻[6]作為參考，選取1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L黃芩素和4×10-2mol/L濃度高糖用于后續(xù)的實驗。實驗分為5組：正常組只加入DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；高糖模型組在DMEM低糖培養(yǎng)基中加入4×10-2mol/L濃度高糖培養(yǎng)48 h；黃芩素低、中、高劑量組先分別加入1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L黃芩素培養(yǎng)24 h后，再加入4×10-2mol/L濃度高糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5檢測指標及方法

1.5.1細胞存活率檢測 取一定量各組細胞，加入20 μL MTT溶液培養(yǎng)4 h，棄掉上清液，再加入150 μL DMSO，放于搖床上震蕩使結(jié)晶溶解，于570 nm處測定吸光度OD值，每組設(shè)置6個復孔，每次2塊板，重復6次。

1.5.2細胞中ROS及MDA含量檢測 取一定量各組細胞，按照試劑盒說明書分別檢測ROS及MDA含量，以上實驗重復6次。

1.5.3細胞中TNF-α mRNA表達檢測 取一定量各組細胞，分別加入1 mL RNA裂解液、0.2 mL氯仿，離心，取上清液，加入0.5 mL異丙醇，離心，將沉淀加入DEPC水溶解，放入核酸濃度自動測定儀中檢測RNA濃度。然后按照RT-PCR試劑盒說明進行操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其模板進行PCR反應。引物序列：GAPDH上游為5’-GGTGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’，下游為5’-CGTGGTTCACACCCATCACA-3’，退火溫度60 ℃，產(chǎn)物大小200 bp；TNF-α 上游為5’-CTGCCCCGACTACGTGCTCCTCA-3’，下游為5’-AGTTGGTCCCCCTTCTCC-3’，退火溫度55 ℃，產(chǎn)物大小291 bp。PCR體系：10×PCR buffer 2.0 μL；25 mmol/L MgCl 2 2.0 μL；10 mmol/L dNTP mix 0.4 μL；cDNA 1.0 μL；上下游引物各0.2 μL；Taq酶0.1 μL；雙蒸水14.1 μL；總體系共20 μL。反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，35個循環(huán)。最后，將其放入實時定量PCR儀中進行檢測，測灰度值，重復6次，結(jié)果以2-ΔΔCt值表示。

1.5.4細胞中p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達檢測 取一定量各組細胞，分別加入RIPA裂解液提取蛋白(加入1%蛋白酶抑制劑)，BCA試劑盒測蛋白濃度，提取的蛋白加入4×loading buffer，在100 ℃、10 min條件下發(fā)生變性，各取10 μL上樣，于聚丙烯酰胺凝膠上分離(100 V濃縮膠，120 V分離膠)并轉(zhuǎn)到膜上(10 V，30 min)，5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(1∶300)，4 ℃過夜，TBST洗膜3次。次日加入二抗(1∶10 000)孵育2 h，TBST洗膜3次，取出膜，加入發(fā)光液于凝膠成像系統(tǒng)成像，測灰度值，實驗重復6次。

2 結(jié) 果

2.1各組HK-2細胞存活率比較 正常組、高糖模型組及黃芩素低、中、高劑量組的HK-2細胞存活率OD值分別為0.538±0.053，0.304±0.026，0.399±0.042，0.451±0.041，0.493±0.073，高糖模型組明顯低于正常組(P<0.05)，黃芩素各組均明顯高于高糖模型組(P均<0.05)，且呈濃度依賴性增高，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.2各組HK-2細胞中ROS和MDA含量比較 高糖模型組HK-2細胞中ROS和MDA含量均明顯高于正常組(P均<0.05)；黃芩素各組HK-2細胞中ROS和MDA含量均明顯低于高糖模型組(P均<0.05)，且呈濃度依賴性降低，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組HK-2細胞中ROS和MDA含量比較

2.3各組HK-2細胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達量比較 高糖模型組HK-2細胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)；黃芩素各組HK-2細胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達量均明顯低于高糖模型組(P均<0.05)，且呈濃度依賴性降低，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見圖1及表2。

圖1 各組HK-2細胞中p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達情況

表2 各組HK-2細胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達量比較

3 討 論

糖尿病腎病的發(fā)病機制十分復雜，目前普遍認為其與代謝紊亂、血流動力學異常、氧化應激、炎癥反應和遺傳等多個方面的因素相關(guān)[7-8]。在高糖狀態(tài)下，體內(nèi)可通過多種途徑發(fā)生氧化應激，可產(chǎn)生大量的氧自由基，這些氧自由基可使腎臟的脂質(zhì)過氧化物MDA含量升高，可直接或間接導致腎臟損傷[9]。本實驗結(jié)果顯示，模型組HK-2細胞凋亡率和細胞中ROS、MDA含量明顯升高，證實高糖刺激可導致氧化應激反應，促進HK-2細胞凋亡。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，ROS也可作為第二信使激活PI3K/Akt信號通路，誘發(fā)糖尿病腎病患者腎臟損傷[10]。此外，炎癥反應一直是糖尿病腎病患者腎臟損傷的一個重要原因，而炎癥因子分泌失調(diào)與PI3K/Akt信號通路可能也存在一定的聯(lián)系[11]。Zhang等[12]和Ma等[13]研究報道，糖尿病腎病患者PI3K/Akt通路被磷酸化，伴隨促炎癥因子(TNF-α、IL-1、IL-6) 的分泌增多，表明炎癥因子的分泌與釋放可能與PI3K/Akt存在某種潛在聯(lián)系。本實驗結(jié)果顯示，模型組HK-2細胞中TNF-α mRNA及p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達量均較正常組明顯增高，證實高糖刺激可激活PI3K/Akt通路，使炎癥因子TNF-α分泌增加。

黃芩素屬于黃酮類化合物，存在于黃芩、杜仲等中藥中。黃芩素具有多種藥理活性，可通過抗氧化應激、抗炎癥反應、抗凋亡等多種機制對機體產(chǎn)生保護作用[14-15]。動物實驗研究表明，黃芩素對糖尿病腎病有一定的防治作用，其可能通過清除體內(nèi)的自由基和抑制腎臟內(nèi)炎癥介質(zhì)表達，進而減輕腎臟損傷，保護腎臟[16]。本實驗結(jié)果顯示，黃芩素各組HK-2細胞凋亡率，細胞中ROS、MDA含量及TNF-α mRNA和p-PI3K、p-Akt、TNF-α蛋白表達量均較模型組明顯降低，提示黃芩素不僅可抑制高糖誘導的氧化應激反應，而且可通過抑制PI3K/Akt信號通路活化來減少炎癥因子產(chǎn)生，從而有效保護腎小管上皮細胞，為黃芩素用于糖尿病腎病的治療提供了一定理論支持。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。