鄧明惠，侯 軒，王 輝，段發(fā)強(qiáng)

艾滋病是由HIV感染導(dǎo)致的重大傳染性疾病。自1981年發(fā)現(xiàn)HIV以來(lái)，經(jīng)過(guò)40年的研究，人們對(duì)艾滋病的了解越來(lái)越深入。研究發(fā)現(xiàn)HIV感染過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致機(jī)體過(guò)度免疫活化，機(jī)體免疫活化水平與疾病的進(jìn)展密切相關(guān)[1]，與HIV RNA呈正相關(guān)，與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)[2]。在HIV感染過(guò)程中，與典型進(jìn)展人群相比，長(zhǎng)期不進(jìn)展人群（HIV感染10年以上，未經(jīng)過(guò)抗病毒治療，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)保持500個(gè)/μl以上，HIV RNA處于低水平）的免疫活化水平明顯較低[3]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells, Tregs）是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)亞群，具有抑制免疫活化及免疫反應(yīng)的作用[4]。在一般非艾滋感染性疾病及腫瘤中，Tregs通過(guò)抑制免疫活化與免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體發(fā)揮不利的作用。但在HIV感染中，Tregs對(duì)機(jī)體發(fā)揮雙重作用，是一把“雙刃劍”：一方面通過(guò)抑制免疫活化對(duì)機(jī)體發(fā)揮有利的作用；另一方面通過(guò)抑制免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體發(fā)揮不利的作用[5]。Tregs與HIV感染疾病進(jìn)展的關(guān)系表明，Tregs計(jì)數(shù)與疾病進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，即與HIV RNA呈負(fù)相關(guān)，與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)[4-5]。而Tregs占CD4+T細(xì)胞的比例與HIV感染疾病的進(jìn)展呈正相關(guān)，即Tregs占CD4+T細(xì)胞的比例越高，患者的病毒載量越高，CD4+T細(xì)胞水平越低[6]。但在極晚期患者中，Tregs細(xì)胞的比例高，與患者的生存能力及療效呈正相關(guān)，即Tregs對(duì)于極晚期患者機(jī)體發(fā)揮有利的作用[6]。

濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（follicular regulatory T cells, TFRs）是近年發(fā)現(xiàn)的表達(dá)CCR5的一個(gè)Tregs亞群，主要存在淋巴結(jié)生發(fā)中心[7]。生發(fā)中心是HIV感染的重要場(chǎng)所，TFRs也是HIV感染的靶標(biāo)，由于TFRs具有Tregs細(xì)胞的特征，具有抑制免疫活化及免疫反應(yīng)的作用，淋巴結(jié)生發(fā)中心也是免疫調(diào)節(jié)的重要場(chǎng)所，因此，TFRs與HIV感染疾病進(jìn)展的關(guān)系非常復(fù)雜。有研究認(rèn)為TFRs與HIV感染疾病進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，即與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，與HIV RNA呈負(fù)相關(guān)[8]。了解TFRs占Tregs的比例與HIV感染疾病進(jìn)展的關(guān)系，可以進(jìn)一步了解Tregs亞群分布與HIV感染疾病進(jìn)展的關(guān)系，為該疾病的治療提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 將2016—2020年于漢中三二〇一醫(yī)院就診和隨訪的HIV感染者納入研究，共94例。其中未治療HIV感染者54例，抗HIV治療后免疫重建成功者23例，抗HIV治療后免疫重建失敗者17例。同時(shí)納入性別（由于目前HIV感染者主要以男性為主，此次納入的均為男性人群）和年齡相匹配的在漢中三二〇一醫(yī)院健康體檢者32例作為健康對(duì)照。入組HIV感染者的一般特征見(jiàn)表1。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 HIV感染者的一般特征Table 1 General characteristics of HIV infected patients

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)與定義 HIV感染者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)艾滋病診療指南（2018版）》[8]。免疫重建成功及免疫重建失敗者的入排標(biāo)準(zhǔn)參考姜太一等[9]發(fā)表的文獻(xiàn)：在抗病毒治療的2年以上HIV感染者中，有一部分在病毒控制的同時(shí)，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)恢復(fù)到350 個(gè)/μl以上的HIV感染者稱之為免疫重建成功者；另外一部分患者，雖然病毒控制的很好，但CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)不能夠很好的恢復(fù)，持續(xù)在250 個(gè)/μl 以下，并排除合并HBV、HCV及結(jié)核感染者，稱之為免疫重建失敗者。

1.3 HIV RNA及CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè) 利用羅氏cobas TaqMan HIV RNA檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行HIV RNA水平的檢測(cè)，應(yīng)用BD公司的CD3+、CD4+及CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)的檢測(cè)。

1.4 Tregs及TFRS檢測(cè) 利用流式技術(shù)對(duì)外周血中的Tregs及TFRs進(jìn)行檢測(cè)。抽取外周抗凝血10 ml，首先用密度梯度離心法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞，Tregs及TFRs的染色方案見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行繪圖。一般資料采用描述性分析，計(jì)量資料采用中位數(shù)（最小值，最大值）表示。組間比較采用Mann–Whitney U 檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TFRs/Tregs比值與疾病進(jìn)展的相關(guān)性分析 在HIV感染過(guò)程中，HIV RNA水平及CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)是反應(yīng)疾病進(jìn)展的2個(gè)重要指標(biāo)。本研究首先分析了未治療HIV感染者TFRs/Tregs比值與HIV RNA及CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TFRs/Tregs比值與HIV RNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.276，P=0.044）（圖1 A），與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)（r=0.579，P=0.001）（圖1 B）。

圖1 未治療HIV感染者TFRs/Tregs比值與HIV RNA及CD4+ T細(xì)胞計(jì)數(shù)之間的相關(guān)性分析Figure 1 Correlation analysis between TFRs/Tregs ratio, HIV RNA and CD4+ T cell count in untreated HIV infected patients

2.2 不同CD4+T細(xì)胞水平未治療HIV感染者TFRs/Tregs比值的比較 一般CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)＜200個(gè)/μl，HIV感染者進(jìn)入疾病的晚期，即艾滋病期。CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)在200～350個(gè)/μl之間，疾病進(jìn)入進(jìn)展期。CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)＞350個(gè)/μl，機(jī)體能保持較好的免疫水平。我們根據(jù)CD4+T細(xì)胞水平的不同，將納入的HIV未治療者分為3組（CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)≤200個(gè)/μl組、200個(gè) /μl＜CD4+T 細(xì)胞≤ 350個(gè) /μl組、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)＞350個(gè)/μl組），并對(duì)比分析各組之間TFRs/Tregs比值的差異，發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)＜200個(gè)/μl的HIV感染者，其TFRs/Tregs比值明顯低于健康對(duì)照組及其他2組（圖2）。

圖2 不同CD4+ T細(xì)胞水平未治療HIV感染者與健康對(duì)照組，TFRs/Tregs比值的比較Figure 2 Comparison of TFRs/Tregs ratio between untreated HIV infected patients with different CD4+ T cell levels and health controls

2.3 免疫重建成功和免疫重建失敗者TFRs/Tregs比值的比較 研究發(fā)現(xiàn)免疫重建失敗組的TFRs/Tregs比值明顯低于免疫重建成功組及健康對(duì)照組（P均＜0.05）（圖3）。

圖3 TFRs/Tregs比值在免疫重建成功和免疫重建失敗者中的比較Figure 3 Comparison of TFRs/Tregs ratio in patients with successful and failed immune reconstitution

3 討 論

TFRs是近年發(fā)現(xiàn)的一群新的細(xì)胞亞群，主要存在于淋巴結(jié)[7]，部分存在于外周血。TFRs一方面具有Tregs的特征，具有抑制免疫活化及免疫反應(yīng)的作用，另一方面也具有濾泡輔助性T細(xì)胞的特征，具有輔助B細(xì)胞發(fā)育及輔助免疫反應(yīng)的作用。在HIV感染過(guò)程中Tregs與疾病進(jìn)展的關(guān)系報(bào)道較多，對(duì)于TFRs與HIV疾病進(jìn)展的關(guān)系，有研究認(rèn)為與Tregs是一致的[9]。由于TFRs主要存在于淋巴結(jié)，淋巴結(jié)生發(fā)中心也是CD4+T細(xì)胞的富集地，并且相對(duì)于外周血，淋巴結(jié)的結(jié)構(gòu)致密。因此HIV在淋巴結(jié)中的感染率及復(fù)制水平遠(yuǎn)高于外周血[10]。此外，淋巴結(jié)中免疫反應(yīng)的復(fù)雜程度遠(yuǎn)高于外周血。外周血中的TFRs的變化與淋巴結(jié)中的一致[7]。因此，充分了解TFRs占Tregs的比例與HIV感染疾病進(jìn)展的關(guān)系可進(jìn)一步了解Tregs及其亞群與HIV感染疾病進(jìn)展之間的關(guān)系。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TFRs占Tregs的比例與HIV感染疾病進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，也就是TFRs占Tregs的比例越高，對(duì)機(jī)體越有利；也說(shuō)明CD4+T細(xì)胞越低，雖然Tregs和TFRs都受損，但TFRs受損更嚴(yán)重。這可能與TFRs除了具有抑制作用外，還有輔助免疫反應(yīng)的作用有關(guān)。研究表明，TFRs主要存在的淋巴結(jié)生發(fā)中心也是B細(xì)胞發(fā)育的重要場(chǎng)所，B細(xì)胞發(fā)育也需要TFRs的輔助作用[11]，TFRs的損傷是否導(dǎo)致其輔助B細(xì)胞的作用減弱，從而B(niǎo)細(xì)胞抗病毒作用減弱加速了疾病進(jìn)展，值得進(jìn)一步研究。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)免疫重建成功者中TFRs/Tregs的比例遠(yuǎn)高于免疫重建失敗者。有研究表明，與免疫重建成功者相比，免疫重建失敗者之所以長(zhǎng)期抗病毒不能恢復(fù)期免疫水平，可能與病毒嚴(yán)重破壞了胸腺及淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)有關(guān)。免疫重建失敗者TFRs/Tregs比例較低，可能與TFRs主要存在于淋巴結(jié)，淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，TFRs很難恢復(fù)有關(guān)[12]。

總之，TFRs是近年發(fā)現(xiàn)的Tregs的一個(gè)亞群，本研究對(duì)TFRs/Tregs比值與HIV疾病進(jìn)展的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示與HIV RNA呈負(fù)相關(guān)，與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，比例越高，機(jī)體的免疫狀態(tài)有可能越好。但因TFRs主要存在于淋巴結(jié)，本研究沒(méi)有對(duì)淋巴結(jié)中的TFRs進(jìn)行研究是本研究的不足之處。