劉 穎， 王 洋，2 ， 馮小蕓， 王競?cè)澹?黃俊霖， 白東清 ， 趙建忠， 李長娥

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津西青 300384；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；3.天津市武清區(qū)崔黃口鎮(zhèn)人民政府農(nóng)業(yè)服務(wù)中心 301702；4.天津市武清區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 301700）

抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的限制使用， 驅(qū)動了綠色抗菌物篩選和應(yīng)用研究的開展。 乳酸菌作為益生菌，具有良好的安全性和抗菌性，被廣泛用于食品加工、畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中（Anas 等，2021 ）。 乳酸菌可分泌多種抗菌物質(zhì)，包括有機(jī)酸、抗菌肽、過氧化氫等（范玲玉等，2021），因此對病原微生物有廣譜抑制作用，且不易產(chǎn)生耐藥性，乳酸菌在養(yǎng)殖業(yè)中具有取代抗生素的潛力（姚嘉赟等，2020）。

乳酸菌用于動物養(yǎng)殖的常見方式包括拌料投喂和制備發(fā)酵飼料。 以乳酸菌作為發(fā)酵劑制備的飼料具有改善飼料品質(zhì)、提高飼料價值、改善腸胃功能和促進(jìn)水產(chǎn)動物生長等多種作用（駱薇竹等，2020）。 乳酸菌發(fā)酵過程中可產(chǎn)生多種氨基酸、維生素等飼料原料中沒有的成分， 從而提高水產(chǎn)動物生產(chǎn)性能（王磊等，2020；王雁燦等，2017）。乳酸菌代謝可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)， 其代謝物或菌體成分還有免疫調(diào)節(jié)活性， 因此可提高水產(chǎn)動物抗細(xì)菌病的能力 （Ng 等，2020；Tkhruni 等，2020）。 此外，乳酸菌發(fā)酵可改善水產(chǎn)飼料適口性，誘食效果好（Nguyen 等，2017）。

本研究篩選對水產(chǎn)病原菌有抑制作用的乳酸菌，并制備發(fā)酵飼料，研究發(fā)酵飼料對水產(chǎn)病原菌的抑制作用，以及對水產(chǎn)益生菌生長的影響，旨在豐富我國水產(chǎn)抗病型益生乳酸菌資源， 并為抗菌型發(fā)酵水產(chǎn)飼料的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 乳酸菌菌株分離自天津地區(qū)池塘、魚蝦糞便、腸道以及各類發(fā)酵食品，現(xiàn)保存于天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

指示菌：嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）ATCC 35654，嗜水氣單胞菌CICC 10500，副溶血弧菌 （Vibrio Parahemolyticus） ATCC 17802，購自中科質(zhì)檢有限公司， 北京； 坎氏弧菌（Vibrio campbellii），哈維氏弧菌（Vibrio harveyi），輪蟲弧菌（Vibrio rotiferianus），以及嗜水氣單胞菌245，均分離自天津地區(qū)發(fā)病魚， 并經(jīng)過16S rDNA 序列分析鑒定為相應(yīng)菌種， 現(xiàn)保存于天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

細(xì)菌培養(yǎng)基：MRS 瓊脂、MRS 肉湯、LB 瓊脂、LB 肉湯，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

多功能酶標(biāo)儀（4MK2）、高速冷凍離心機(jī)（YZB/GER 1841-2014），賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 乳酸菌發(fā)酵上清液抑菌能力的測定 分離得到的乳酸菌在MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，離心（2000g、5 min、4 ℃），收集上清液，以0.22 μm無菌濾器過濾除菌后立即使用。 采用雙層平板瓊脂擴(kuò)散法（魏東東等，2018），測定各菌株發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑。 上層平板中分別含各種指示菌107cfu/mL，牛津杯中加入100 μL 乳酸菌上清液，于4 ℃正置8 ～12 h， 至上清液全部擴(kuò)散到瓊脂中，隨后于30 ℃培養(yǎng)12 h 后觀測抑菌圈直徑。

1.3 飼料發(fā)酵條件的優(yōu)化 采用Designer Expert（DX） 軟件設(shè)計(jì)，以響應(yīng)曲面法優(yōu)化接種量、加水量和發(fā)酵時間。根據(jù)設(shè)計(jì)的條件制備發(fā)酵飼料。在發(fā)酵終點(diǎn)取樣，檢測飼料pH（國標(biāo)GB 6920-86），活菌數(shù)（梯度稀釋平板計(jì)數(shù)法），以及飼料穩(wěn)定性。飼料穩(wěn)定性的測定指標(biāo)為飼料保留率：保留率/%＝[浸泡海水后質(zhì)量 （干重）/飼料浸泡海水前重量（干重）]×100%（賈雪卿，2017）。 響應(yīng)值計(jì)算方法為活菌數(shù)+保留率/10 的平均值。

1.4 乳酸菌發(fā)酵飼料對病原菌和益生菌生長的影響 將制備好的發(fā)酵飼料，以LB 或者M(jìn)RS 肉湯浸泡24 h，在6000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，取上清液。上清液以0.22 μm 無菌濾膜過濾除菌，制得發(fā)酵飼料無菌浸提液。 采用96 孔板比濁法，檢測不同終濃度（11.25%、22.5%、45%）的發(fā)酵飼料無菌浸提液對水產(chǎn)病原菌的生長抑制作用，以及對益生芽孢桿菌和乳酸菌生長的影響。

1.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用Excel 軟件計(jì)算得出各組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差； 利用Sigmaplot 14.0 軟件繪制柱狀圖；利用MEGA 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹； 利用SPSS 軟件進(jìn)行單因素方差分析（SNK，α＝0.05 或0.01）。 每次試驗(yàn)重復(fù)3 次，每次重復(fù)包含至少3 個平行數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 抑菌乳酸菌的篩選和16S rDNA 序列分析分離自各類生境的33 株乳酸菌，其發(fā)酵上清液對6 株病原菌有不同程度的抑制作用 （黃俊霖，2019）（表1）。 綜合考慮對各株指示菌抑菌圈直徑的總和，抑菌能力較強(qiáng)的菌包括屎腸球菌7-1（高欣，2020），以及菌株A1 和A2。 屎腸球菌7-1 的發(fā)酵上清液，對輪蟲弧菌、嗜水氣單胞菌35654、嗜水氣單胞菌10500、維氏弧菌、坎氏弧菌、嗜水氣單胞菌245 抑菌直徑分別達(dá)到了（29±2），（39±1），（29±1），（36±1），（34±3），（23±1）mm。

表1 乳酸菌發(fā)酵上清液pH 及其對6 株革蘭氏陰性水產(chǎn)病原菌的抑菌圈直徑mm

進(jìn)一步鑒定優(yōu)良菌株A1 和A2，并進(jìn)行測序分析（圖1）。 結(jié)果表明，菌株A1 的序列與乳酸乳球菌 （Lactococcus lactis）subsp.lactis Il1403 的序列最為相似，菌株A2 的序列與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）WCFS1 的序列最為相似。 因此將菌株A1 和A2 分別鑒定為乳酸乳球菌和植物乳桿菌。

圖1 基于16S rDNA 建立的菌株乳酸乳球菌A1 和植物乳桿菌A2 的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 發(fā)酵條件響應(yīng)曲面優(yōu)化結(jié)果 選用抑菌能力最強(qiáng)的屎腸球菌7-1 制備發(fā)酵飼料，并優(yōu)化發(fā)酵條件（馮小云，2021）。響應(yīng)值為活菌數(shù)和飼料穩(wěn)定性的加權(quán)值，所得數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。 各組發(fā)酵飼料的活菌數(shù)為6.34 ～7.47 log10cfu/g。 其中第11組活菌數(shù)最高。 各組發(fā)酵飼料保留率為60% ～99%，其中第7、8 和9 組發(fā)酵飼料的保留率較高，均在90%以上。 根據(jù)發(fā)酵飼料保留率和終末活菌數(shù)的權(quán)重值即響應(yīng)值， 擬合并繪制響應(yīng)曲面（圖2）。17 個試驗(yàn)組響應(yīng)值為6.2 ～8.46。響應(yīng)值越大表明該發(fā)酵條件越適合。根據(jù)擬合的響應(yīng)曲面，給出了幾組優(yōu)化發(fā)酵條件。綜合發(fā)酵成本考慮，選用發(fā)酵接種量4.53 log10cfu/g，發(fā)酵時間12.5 h 以及加水量0.784 mL/g 干飼料。 該組條件驗(yàn)證的結(jié)果為： 活 菌 數(shù) （7.47±0.02）log10cfu/g， 保 留 率86.89 %，實(shí)測值與預(yù)測值的誤差小于2%，證明該條件適宜。

圖2 根據(jù)不同發(fā)酵條件下屎腸球菌發(fā)酵飼料的加權(quán)得分繪制的響應(yīng)曲面和等高線圖

表2 根據(jù)響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)所得各組屎腸球菌7-1 發(fā)酵飼料的參數(shù)及響應(yīng)值

2.3 屎腸球菌發(fā)酵飼料對水產(chǎn)病原菌的抑制不同濃度屎腸球菌發(fā)酵飼料無菌浸提液對革蘭氏陰性病原菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌、維氏氣單胞菌、坎氏弧菌、輪蟲弧菌、3 株嗜水氣單胞菌有顯著生長抑制作用（P＜0.05），抑制效果如圖3 所示。 隨著飼料發(fā)酵浸提液濃度的增加， 除副溶血弧菌和維氏氣單胞菌外， 浸提液對其他6 株水產(chǎn)病原菌的抑制能力逐漸增強(qiáng)。

圖3 屎腸球菌發(fā)酵飼料對水產(chǎn)病原菌的抑制作用

2.4 屎腸球菌發(fā)酵飼料對水產(chǎn)益生菌生長的影響 不同濃度屎腸球菌發(fā)酵飼料無菌浸提液對常見水產(chǎn)益生菌枯草芽孢桿菌以及肉葡萄球菌、清酒乳桿菌和戊糖乳桿菌的生長影響如圖4 所示。與對照組相比， 無菌浸提液對水產(chǎn)益生菌有生長促進(jìn)作用，但隨著浸提液濃度的增加，生長促進(jìn)的幅度顯著下降（P＜0.05）。

圖4 屎腸球菌發(fā)酵飼料對水產(chǎn)益生菌生長的影響

3 討論

3.1 乳酸菌對水產(chǎn)病原菌的抑制能力 本研究從水產(chǎn)生境和食品中分離的乳酸菌菌株， 其中部分菌株的發(fā)酵上清液對6 株常見水產(chǎn)病原菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌、維氏弧菌、坎氏弧菌、輪蟲弧菌、嗜水氣單胞菌有較強(qiáng)的抑制作用。 Klewicki和Klewicka（2004）認(rèn)為，魚腸道中乳酸菌的抑菌能力源于其可以降低腸道環(huán)境的pH 并產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。本研究中抑菌能力最強(qiáng)的屎腸球菌7-1，分離自金魚糞便， 水產(chǎn)生境以及其產(chǎn)細(xì)菌素特性可能是其有較強(qiáng)抑菌能力的原因 （高欣等，2020；Fekaninová 等，2019；Kassaa 等，2019）。據(jù)報道，水生動物腸道中固有的乳酸菌中， 一些優(yōu)勢菌株有產(chǎn)細(xì)菌素的能力 （崔美巖等，2016）。 Ringo/等（1998）， 提出將產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌作為水產(chǎn)益生菌，有替代抗生素使用的潛力（O'ldak 和Dosw，2017）。

3.2 屎腸球菌發(fā)酵飼料的發(fā)酵參數(shù) 本研究從各類生境中篩選到的乳酸菌株， 對水產(chǎn)常見病原菌有不同程度的抑制作用， 其中抑菌能力較強(qiáng)的為屎腸球菌、 乳酸乳球菌和植物乳桿菌。 經(jīng)過優(yōu)化確定了利用屎腸球菌7-1 制備發(fā)酵飼料的條件為發(fā)酵接種量4.53 log10cfu/g，發(fā)酵時間12.5 h以及加水量0.784 mL/g 干飼料，發(fā)酵后活菌數(shù)可達(dá)到7.47 log10cfu/g，發(fā)酵飼料的無菌浸提液對水產(chǎn)病原菌有顯著抑制作用， 對益生菌有生長促進(jìn)作用。王競?cè)宓龋?019）制備對蝦發(fā)酵飼料的條件，獲得的活菌數(shù)為6.48×108cfu/g。 馬小康等（2018）制備的活菌飼料中活菌數(shù)達(dá)到了108cfu/g。 Zhang等（2020）制備的發(fā)酵飼料活菌數(shù)為1×108cfu/g，能明顯抑制蝦腸道內(nèi)病原菌的生長。可見，本研究所獲得的發(fā)酵飼料活菌數(shù)數(shù)量適宜。 研究結(jié)果初步證實(shí)了屎腸球菌7-1 具備制備抗病發(fā)酵飼料的潛力，繼續(xù)開展屎腸球菌7-1 發(fā)酵飼料的投喂試驗(yàn)， 有利于進(jìn)一步明確該菌株及其發(fā)酵飼料對水產(chǎn)動物抗病性的影響。