牛 蓉， 秦麗波 ， 張夢麗， 周蘭蘭

（1.河南宏信檢測技術(shù)有限公司農(nóng)產(chǎn)食品檢測中心，河南南陽 473000；2.牧原食品股份有限公司品控部，河南南陽 473000）

替米考星是一種較新的以泰樂菌素為前體的半合成大環(huán)內(nèi)酯類畜禽專用抗生素， 其分子式為C46H80N2O13，相對分子質(zhì)量為869.15，白色粉末狀，由順式和反式異構(gòu)體組成， 比例為85：15 （余軍軍，2021；Zhang，2021）。替米考星主要作用與其他大環(huán)內(nèi)酯類藥物相同， 對革蘭氏陽性菌有明顯的活性， 對部分革蘭氏陰性菌及支原體也有一定的活性，主要用于由敏感菌引起的感染性疾病，特別是畜禽呼吸道感染疾?。╓ang，2021）。 替米考星的靶組織為肺臟，可在肺部明顯蓄積，其飼料藥物添加劑僅批準用于豬，休藥期為7 d，可促進豬群生長發(fā)育，提高飼料利用率。但是由于抗生素在養(yǎng)殖行業(yè)的濫用，抗生素殘留、環(huán)境污染、細菌耐藥性等問題接踵而來， 隨著人類對食品安全及環(huán)境衛(wèi)生的要求不斷提高， 減抗禁抗勢在必行（由大鵬，2021；李朝云，2020）。2019 年7 月10 日，中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布194 號公告：2020 年7 月1 日起， 飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料（劉宏偉，2019；藺春文，2019），這標志著我國飼料行業(yè)將全面進入“禁抗”時代。 這就要求盡快建立完善對應(yīng)的有關(guān)飼料中的抗生素質(zhì)量檢測的標準。

目前關(guān)于替米考星的檢測方法主要集中在牛肉、豬肉、羊肉、雞肉、蜂蜜、魚類、牛奶等動物源性食品上 （姚禪媛，2018；Zhao，2017；Jank，2015；楊迪，2014；Le，2013；Spisso，2010），《GB 31650-2019食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》中公布了替米考星在不同動物靶組織中的殘留限量。 替米考星的殘留通常在牛腎臟、肝臟和注射部位中含量最高（Horie，2013）。豬和羊在投喂了替米考星后，大部分藥經(jīng)糞便排出，而原形藥多聚集于肝和腎內(nèi)，肌肉等部位的殘留物濃度較小，整體處于正常水平（Granelli，2008）。 而對于禽類來說，肝中含有最高殘留濃度，腎臟次之，殘留最低的是肌肉、脂肪、皮膚（焦?jié)櫍?021；Leroy，1994）。

關(guān)于飼料中替米考星的測定方法僅有農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《農(nóng)業(yè)部783 號公告-4-2006 飼料中替米考星的測定 高效液相色譜法》， 該法前處理較為簡單，但上機檢測時間過長。閆小峰等（2010）報道的飼料中替米考星檢測方法上機時間較短， 但前處理操作步驟較為復(fù)雜，整體檢測耗時長。本文旨在建立一套操作簡單、重復(fù)性好、準確度高的飼料中替米考星含量的高效液相色譜檢測方法， 為飼料中替米考星的質(zhì)量檢測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 替米考星標準品， 含量80.70%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司；甲醇、乙腈為色譜級，美國天地有限公司；二丁胺、磷酸、四氫呋喃、甲酸均為分析級，國藥集團化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 Waters E2695-2489 高效液相色譜儀，美國沃特世公司；HU20500B 超聲波清洗器，深圳市朗杰超聲電器有限公司；隔膜真空泵，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；MS105DU 電子天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；MVM-200 多管混勻儀，南京祥中生物科技有限公司；DD5000 離心機，四川蜀科儀器有限公司。

1.3 標準溶液配制 替米考星標準儲備溶液：1 mg/mL。稱取標準品10 mg（相當于替米考星），用乙腈溶解并定容至10 mL，溶液濃度為1 mg/mL，置于-18 ℃冰箱避光保存，保存期12 個月。標準曲線的制備：分別準確吸取10、20、50、100、200、500 μL標準儲備液于不同1.5 mL 離心管中， 用水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）定容至1.0 mL，配制成10、20、50、100、200、500 μg/mL 標準系列溶液，過濾后待測。

1.4 試劑配制 1 mol/L 磷酸二丁胺緩沖液（DBAP）：在700 mL 水中加入168 mL 二丁胺，然后緩慢加入70 mL 磷酸，邊加邊攪拌，振蕩使二丁胺溶解， 冷卻至室溫， 用磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.5±0.1，轉(zhuǎn)移至1000 mL 容量瓶中，加水至1000 mL，備用。

水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）： 取805 mL 水、115 mL 乙腈、25 mL 1 mol/L 磷酸二丁胺緩沖液（DBAP）、55 mL 四氫呋喃，混勻，有機濾膜過濾，備用。

1.5 實驗方法

1.5.1 樣品制備 取有代表性的樣品至少500 g，用四分法縮減至200 g， 粉碎通過1 mm 孔徑篩，混勻，貯存磨口瓶中備用。

1.5.2 樣品提取 平行做2 份實驗。 稱取試樣約5 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，準確加入水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）20 mL，渦旋混合30 s，振蕩10 min，超聲10 min，于4000 r/min 離心5 min，取上清液過微孔濾膜，供高效液相色譜儀分析。

1.5.3 色譜條件 色譜柱：C18 色譜柱，250 mm×4.6 mm；柱溫：室溫；檢測波長：290 nm；流動相：水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理優(yōu)化

2.1.1 提取溶液的優(yōu)化 替米考星屬于無色弱堿性化合物，分子量較高，易溶于酸性水溶液和極性溶劑，如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等。農(nóng)業(yè)部783 號公告-4-2006 中飼料中替米考星的測定采用的是乙腈-磷酸二丁胺緩沖液-磷酸緩沖液（200：25：25，V：V：V），閆小峰等（2010）采用乙腈和磷酸二氫鉀緩沖液先后提取。 本研究分別選取乙腈-磷酸二丁胺緩沖液-磷酸緩沖液（200：25：25，V：V：V）、水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）、甲醇、乙腈為提取液，取空白飼料，加標為200 mg/kg，分別用以上4 種不同提取液提取，每種提取方式設(shè)置3 個重復(fù)，結(jié)果顯示當提取液為乙腈-磷酸二丁胺緩沖液-磷酸緩沖液（200：25：25，V：V：V）和水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）時，平均回收率較高， 接近100%（表1）， 由于水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）與本研究中流動相一致，為簡化實驗過程，減少試劑配制，本研究最終選擇水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃 （805：115：25：55，V：V：V：V）為提取液。

表1 不同提取溶劑對替米考星提取率影響

2.1.2 提取次數(shù)的優(yōu)化 本研究考察了提取次數(shù)對提取效果的影響。 稱取空白飼料樣品5 g，加標量為200 mg/kg，選水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）為提取液，考察提取1 次（20 mL）、2 次（10、10 mL）、3 次（7、7、6 mL）對提取效果的影響，每組3 個重復(fù)，對比其平均回收率。 結(jié)果顯示，提取1 次（20 mL）時即可達到提取效果，增加提取次數(shù)并未提高回收率（表2），且會延長整體前處理時間，綜合提取效果及時間成本考慮，最終選擇提取1 次（20 mL）。

表2 提取次數(shù)、振蕩時間及超聲時間對替米考星提取率影響

2.1.3 振蕩及超聲時間的優(yōu)化 振蕩法為常用提取方式之一，一般選取振蕩時間為20 ～30 min。 超聲波提取是通過空化作用使分子運動加快，同時將超聲波的能量傳遞給樣品，使組分拖脫附和溶解加快（李俊鎖，2002）。 本研究考察振蕩時間及超聲時間對提取效果的影響，稱取空白飼料樣品5 g，加標量為200 mg/kg，加入20 mL 水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）提取，分別考察振蕩10、20、30 min， 超聲10、20、30 min對提取效果的影響，每組3 個重復(fù)。 結(jié)果顯示振蕩10 min，超聲10 min 即可達到提取效果，延長振蕩及超聲時間并未提高回收率（見表2），因此本文選擇振蕩10 min，超聲10 min 為最優(yōu)條件。

2.2 儀器條件優(yōu)化

2.2.1 檢測波長的優(yōu)化 農(nóng)業(yè)部783 號公告-4-2006 及中華人民共和國獸藥典（2020 年版）中替米考星的檢測波長均為280 nm， 為驗證280 nm是否為最佳檢測波長，本研究測定了50 μg/mL 替米考星標準溶液在250 ～350 nm 的響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)在290 nm 波長下， 響應(yīng)最大 （圖1）， 因此選擇290 nm 為最佳波長。

圖1 替米考星標準溶液（50 μg/mL）在不同波長下的響應(yīng)值

2.2.2 色譜柱及柱溫的選擇 實驗選擇了ZORBAX Extend-C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm） 及ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）兩種不同長度的色譜柱，對替米考星進行分析，發(fā)現(xiàn)在使用長度為150 mm 色譜柱時， 替米考星出峰時間為5.124 min（反式）和5.744 min（順式），使用長度為250 mm 色譜柱時， 替米考星出峰時間為5.309 min（反式）和6.065 min（順式）（圖2），即使用長度為150 mm 色譜柱并未明顯提前替米考星出峰時間，用長度為250 mm 色譜柱時，替米考星順式峰及反式峰分離效果較好， 因此本研究選擇使用ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱。

圖2 替米考星標準溶液色譜圖（250 mm）

化合物在色譜柱上的行為是吸附解析動態(tài)分配平衡的過程， 柱溫的變化對化合物的保留時間及分離效果有一定的影響。因此選取20、25、30 ℃三種不同柱溫分析50 μg/mL 替米考星標準溶液。發(fā)現(xiàn)替米考星在3 種溫度下均能夠很好的分離，溫度為20 ℃時保留時間最長，30 ℃時保留時間最短，但時間無較大差異，因此對柱溫不做要求，在室溫條件下即可。

2.3 線性范圍、 檢出限及定量限 配制10、20、50、100、200、500 μg/mL 不同質(zhì)量濃度的替米考星標準溶液，按照本實驗色譜條件進行分析測定。用替米考星順式及反式異構(gòu)體峰面積之和（Y）和質(zhì)量濃度（X）作標準曲線，結(jié)果顯示回收方程具有良好的線性關(guān)系，為Y＝32927X-59269，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9991。 以空白飼料為基質(zhì)進行加標，加標范圍為0.1 ～50 mg/kg，按3 倍信噪比（S/N＝3）和10 倍信噪比（S/N＝10）計算方法的檢出限和定量限，結(jié)果顯示替米考星的檢出限為5 mg/kg，定量限為10 mg/kg。

2.4 回收率及精密度 以空白飼料的基質(zhì)進行加標，分別添加不同濃度的替米考星標準溶液，使得加標水平分別為20、50、100、200、500 mg/kg，每個加標水平做6 個平行樣品， 在本實驗分析條件下測定， 結(jié)果顯示該方法平均回收率為92.0% ～101.2%， 相對標準偏差為1.02% ～5.17%（表3），滿足飼料中替米考星檢測分析要求。

表3 替米考星的平均回收率及精密度（n=6）

2.5 穩(wěn)定性 將加標濃度為200 mg/kg 的飼料樣品按照本實驗條件進行處理，將處理后的樣品溶液分別在0、24、48、74 h 時上機測定， 對比替米考星的峰面積及RSD（表4）。 結(jié)果顯示，該樣品在室溫條件下放置72 h 內(nèi)，替米考星含量無明顯變化。

表4 穩(wěn)定性測定結(jié)果（n=3）

3 結(jié)論

本研究建立了飼料中替米考星的高效液相色譜測定方法，相較于農(nóng)業(yè)部783 號公告-4-2006，本實驗將提取液與流動相進行了統(tǒng)一， 規(guī)定了樣品稱樣量，減少了提取液的體積，優(yōu)化了液相色譜洗脫程序及檢測波長。通過以上各參數(shù)的優(yōu)化，本實驗條件可明顯節(jié)約試劑成本、 人工成本及時間成本，且實驗重復(fù)性好，準確率及穩(wěn)定性高，適用于大批量飼料中替米考星含量的測定。