楊 霞， 寇 枘，4， 劉 和， 鄧正敏， 王定美， 麥力文， 李勤奮

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南海口 571101；2.海南省熱帶生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?571101；3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，海南?？?571101；4.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)生態(tài)技術(shù)與工程學(xué)院，上海， 201418）

黑水虻（Hermetia illucensL.）作為一種環(huán)境資源昆蟲， 因其幼蟲能夠取食畜禽糞便及廚余垃圾等有機(jī)廢棄物， 被廣泛用于處理有機(jī)廢棄物（Lalander，2018）。 幼蟲蟲體含有32% ～49%粗蛋白質(zhì)，16% ～42%粗脂肪 （楊霞，2020；Wang，2017；Spranghers，2017 ），已被批準(zhǔn)可作為動(dòng)物蛋白飼料原料（Wang，2017）。利用黑水虻轉(zhuǎn)化畜禽糞便以實(shí)現(xiàn)畜牧產(chǎn)業(yè)無害化、 資源化生產(chǎn)前景廣闊。 然而畜禽糞便中常殘留抗生素（Argüeso-Mata，2021）， 其中以四環(huán)素類抗生素（TCs）殘留量最高，因而轉(zhuǎn)化畜禽糞便的黑水虻幼蟲體內(nèi)存在蓄積抗生素的風(fēng)險(xiǎn)。 黑水虻可通過食物鏈將抗生素傳遞至動(dòng)物和人類， 可能對(duì)公共健康造成新的潛在風(fēng)險(xiǎn) （Van der Fels-Klerx，2017）。 此外，含有抗生素的黑水虻長(zhǎng)期作為水產(chǎn)飼料可能引起水體污染， 進(jìn)而造成生態(tài)環(huán)境抗性基因傳播風(fēng)險(xiǎn)。 但目前開發(fā)鑒定和量化黑水虻幼蟲體內(nèi)抗生素的方法， 監(jiān)測(cè)其是否符合動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)鮮見相關(guān)報(bào)道。

目前我國(guó)和歐盟對(duì)飼料中抗生素的添加行為采取“零容忍”。 超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜因其在特異性、 靈敏度和分析速度方面都有顯著的優(yōu)勢(shì)（Kruve，2015），因而利用UPLC-MS/MS 建立一種低濃度高靈敏性的檢測(cè)黑水虻幼蟲抗生素含量的方法十分必要。研究表明，直接從生物基質(zhì)中提取TCs，回收率不高（40% ～60%）（ Susakate，2019；Anumol，2017；Patyra，2017）。 生物基質(zhì)易通過氫鍵、偶極間作用力與TCs 形成TCs-蛋白質(zhì)結(jié)合物（高福凱，2013） 及TCs-金屬離子絡(luò)合物（張文，2020；Gentili，2005），干擾TCs 的提取。 此外，脂質(zhì)（Zhang，2016）（甘油酯、脂肪酸、甘油、磷脂等）不僅會(huì)影響分析的準(zhǔn)確度， 也極易污染分析柱和分析系統(tǒng)，影響儀器的精度。 可以預(yù)見，如何有效地將TCs 從黑水虻的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、磷脂、礦物質(zhì)和其他干擾物中分離出來是檢測(cè)的難點(diǎn)所在， 必須開發(fā)有效的提取和凈化方法。

TCs 與金屬離子形成絡(luò)合物和蛋白質(zhì)形成結(jié)合物可通過酸性脫蛋白物質(zhì)如乙腈沉淀蛋白，乙腈極性范圍寬， 分子小， 組織穿透能力強(qiáng)，對(duì)糖、脂肪、蛋白質(zhì)類化合物的沉淀效果好（華卞，2019）。 可通過EDTA、磷酸及檸檬酸等與TCs 競(jìng)爭(zhēng)金屬離子降低螯合作用（Anderson，2005）。 據(jù)報(bào)道， 正己烷和除脂增強(qiáng)型固相萃取柱PRiME HLB 可以去除動(dòng)物組織提取物中的脂質(zhì)，而不會(huì)引起待測(cè)物的損失（Anumol，2017）。 因而本文考察了不同緩沖液對(duì)黑水虻幼蟲中TCs 的分離提取效果；同時(shí)對(duì)比了液液萃取和固相萃取脫脂對(duì)TCs 的凈化效果，旨在建立一種利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定黑水虻幼蟲中TCs 的方法，為監(jiān)控蟲體飼料安全性提供方法參考及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 四環(huán)素 （TC， 純度為98%）、鹽酸土霉素（OTC，純度為95%），均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司。 實(shí)驗(yàn)所用的甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，一水合檸檬酸、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉為分析純。 Waters ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜儀，串聯(lián)Xevo TQ-S Micro 三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)器， 搭配ZsprayTM 電噴霧離子源（含ESI/APCI/ESCi 模式） 及Masslynx v4.1 質(zhì)譜工作站；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱 （1.8 μm，2.1 mm×100 mm） 購(gòu)自美國(guó)Waters 公司。 固相萃取柱為Waters PRIM HLB 小柱 （6 cc/150 mg） 及Oasis HLB （200 mg/3 mL） 購(gòu) 自 美 國(guó)Waters 公 司。NM32LA 氮?dú)獍l(fā)生器購(gòu)自英國(guó) Peak 公司；XSE205BDU 十萬分之一天平購(gòu)自瑞士 METTLER TOLEDO 公司。

1.2 黑水虻幼蟲樣品 選取海南省北科生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司提供的3 齡虻蟲， 接入分別含有無抗生素、10 mg/kg 四環(huán)素、20 mg/kg 土霉素的虻蟲飼料中， 飼料配制方法及飼養(yǎng)條件同楊霞（2020）等，飼養(yǎng)虻蟲至50%出現(xiàn)預(yù)蛹，停止實(shí)驗(yàn)。取出虻蟲，饑餓24 h，清洗，晾干，液氮致死，均分為兩份，一份在60 ℃鼓風(fēng)干燥48 h 且多次翻動(dòng)，另一份冷凍干燥，液氮研磨過40 目，-20 ℃保存，待測(cè)。

1.3 樣品前處理方法 分別稱取烘干及凍干虻蟲樣品1 g （精確到0.0002 g） 于25 mL 離心管中， 分別加入0.1 mol/L 乙腈-檸檬酸緩沖液（1：1，V/V） 10 mL+0.5 g EDTA， 調(diào)節(jié)pH 為3 ～4，漩渦2 min，超聲20 min 后低溫離心（10000 r/min，8 min），取上清液；復(fù)提2 次，合并提取液于25 mL離心管中。 取0.5 mL 上清液，用0.1%的甲酸乙腈稀釋為3 mL，備用。 將PRiME HLB 柱連接到固相萃取儀，吸取1 mL 備用液于PRiME HLB 柱內(nèi)，以1 ～2 滴/min 流速通過固相萃取柱，收集過濾液，N2低溫吹干。 用乙腈-0.1%甲酸水（3:2，V:V）定容至1 mL，稀釋10 倍，渦旋30 s，10000 r/min離心5 min，取上清液，將溶液過0.22 μm 微孔濾膜，待測(cè)。

1.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源正離子掃描模式對(duì)黑水虻幼蟲中四環(huán)素、 土霉素進(jìn)行定量檢測(cè)。 由于流動(dòng)相中添加了0.1%的甲酸，因此設(shè)定毛細(xì)管電壓為0.5 kV，最佳脫溶劑氣流速為1000 L/h，最佳脫溶劑氣溫度為450 ℃，錐孔反吹氣（氮?dú)猓?0 L/h。 定量離子對(duì)、定性離子對(duì)及對(duì)應(yīng)錐孔電壓和碰撞能量見表1。

表1 四環(huán)素、土霉素的定性/定量離子、錐孔電壓及碰撞能量

1.5 色譜條件 本項(xiàng)目采用的色譜柱為ACQUITYUPLC UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 液相色譜參數(shù)設(shè)置如下： 流速為0.25 mL/min；進(jìn)樣體積為2.0 μL；設(shè)置柱溫為40 ℃；流動(dòng)相組成為0.1%甲酸乙腈（A 相）及0.1%甲酸水（B 相）以確保將2 種抗生素洗脫出來。TC 的保留時(shí)間為2.64 min，OTC 的保留時(shí)間為2.55 min，梯度洗脫的洗脫程序?yàn)? ～0.5 min，10%A；＞0.5 ～2 min，10%～60%A；＞2 ～3 min，60%A；＞3 ～4 min，60%～95%A；＞4 ～5 min，95%A；＞5 ～5.1 min；10%A。

1.6 試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別精確稱取0.005 g（精確到0.00002 g）四環(huán)素、土霉素鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶于50 mL 棕色容量瓶，配制為100 mg/L 的單標(biāo)母液，再?gòu)哪敢褐懈魅? mL，用乙腈-0.1%甲酸水（3:2，V/V）將其稀釋為10 mg/L 的混標(biāo)儲(chǔ)備液，置于-20 ℃保存。吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)液用乙腈-0.1%甲酸水（3:2，V/V）配制濃度為0.1、0.5、1、5、10、25、50、100、250、500 μg/L 的試劑標(biāo)準(zhǔn)液。 同理，將上述溶劑換為空白樣品提取液，依次配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按?.4 中的測(cè)定條件，以TC 和OTC 的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 四環(huán)素類抗生素含有3個(gè)以上羥基，在酸性溶液中易解離成正離子，故采用ESI+作為TC 及OTC 的電離方式。 質(zhì)譜參數(shù)如錐孔電壓、 碰撞能量等對(duì)TCs 的裂解有重要影響，直接決定儀器的靈敏度。 使用100 μg/L 的單標(biāo)液在質(zhì)譜調(diào)諧測(cè)試模式下進(jìn)行調(diào)試， 選取豐度最高、信號(hào)響應(yīng)最強(qiáng)、雜質(zhì)峰干擾小、信噪比較大的特征碎片離子作為定量離子對(duì)， 同時(shí)另選取一對(duì)作為定性離子對(duì)，優(yōu)化碰撞能量及錐孔電壓，最終選取426.0/442.9 作為OTC 的定量和定性離子，選擇410.0/427 作為TC 的定量離子和定性離子。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化 流動(dòng)相的組成是影響分析物峰形、保留行為和質(zhì)譜響應(yīng)的關(guān)鍵因素。與甲醇相比， 乙腈作為流動(dòng)相具有更好的分離度和更快的洗脫速度。 分析四環(huán)素類抗生素的最主要難點(diǎn)在于TCs 易與分析柱上殘留的硅醇基團(tuán)和金屬離子相互作用（Gentili，2005），在流動(dòng)相中使用絡(luò)合劑如草酸、甲酸等，可有效緩解殘留硅烷醇對(duì)固定相的影響（Anderson，2005）。 同時(shí)，在流動(dòng)相中加入酸有助于TCs 在正離子模式下的離子化，但強(qiáng)酸易降解TCs 且損傷柱子，而弱酸提供酸性環(huán)境使得TCs 處于兩性離子狀態(tài)， 增強(qiáng)信號(hào)響應(yīng)，獲得最佳分離和保留。本研究考察了向流動(dòng)相中加入0.01%、0.1%、0.2%、0.5%的甲酸對(duì)色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度影響， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乙腈和超純水中同時(shí)加入0.1%以上的甲酸峰型尖銳，響應(yīng)值及信噪比更大，洗脫效果最佳。而添加0.01%甲酸的TCs 與硅羥基發(fā)生結(jié)合，嚴(yán)重拖尾、展寬的現(xiàn)象，影響峰型。流動(dòng)相酸度太高，響應(yīng)降低，可能是強(qiáng)酸性 （pH＜2） 條件下TCs 降解 （華卞，2019）。此外，高濃度酸易折損分析柱壽命。因而最終確認(rèn)向有機(jī)相及水相中分別加入0.1%甲酸是最優(yōu)條件。 最優(yōu)參數(shù)條件下TC 及OTC 的色譜圖見圖1。

圖1 最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)下的TC、OTC 色譜圖

2.2 樣品前處理方法的選擇 在樣品前處理的所有關(guān)鍵步驟中，提取和純化是最復(fù)雜、最耗時(shí)的工作。 TCs 在樣品前處理過程中的不穩(wěn)定性以及復(fù)雜基質(zhì)中蛋白質(zhì)、 脂肪和其他物質(zhì)的共萃取干擾，均會(huì)影響TCs 分析的靈敏度和重現(xiàn)性。

2.2.1 提取液 四環(huán)素類抗生素的C1 和C11 位置的兩個(gè)酮基使之能夠螯合金屬離子， 與硅醇基團(tuán)相互作用，導(dǎo)致樣品制備過程中分析物的損失，因而萃取溶劑的選擇是提高萃取量和回收率的關(guān)鍵。 研究表明，EDTA、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、Na2EDTA-McIlavine 緩沖液等（張文，2020；Susakate，2019；Patyra，2017；Shalaby，2011） 能 夠與TCs 競(jìng)爭(zhēng)螯合金屬離子從而使四環(huán)素釋放出來。 同時(shí)，添加40% ～90%強(qiáng)極性的有機(jī)相（乙腈） 作為提取液可有效沉淀蛋白， 破壞其空間結(jié)構(gòu)，使其疏水基團(tuán)向外翻轉(zhuǎn)，釋放TCs，提高柱效和檢測(cè)靈敏度（高福凱，2013）。 因此，本研究分別考察了5 種提取液：T1，乙腈-0.1%甲酸水（8:2，V/V）；T2， 乙腈-0.1%甲酸水（8:2，V/V）+0.5 g EDTA；T3，乙腈-0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllavine （2:1，V/V，pH＝4）；T4，乙腈-0.1 mol/L 磷酸緩沖液（1:1，V/V，pH＝4）+0.5 g EDTA，T5，乙腈-0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液（1:1，V/V，pH＝4）+0.5 g EDTA 對(duì)黑水虻幼蟲體內(nèi)TCs 的提取效果的影響。 結(jié)果顯示（圖2）： 以T2、T4、T5 作為緩沖液，OTC 及TC 的回收率較高，TC 的回收率總體較OTC 更高。 針對(duì)黑水虻幼蟲這種基質(zhì)， 加入EDTA 與具有螯合金屬能力的緩沖液提取TCs 的效果更好。 一是提取液中加EDTA 萃析后低溫離心， 在水相和有機(jī)相交匯處形成黃色固態(tài)脂肪層，脫脂效果好；二是EDTA可競(jìng)爭(zhēng)性地與基質(zhì)中金屬離子螯合， 釋放抗生素于浸提液中，從而提高回收率；三是相較于乙腈，TCs 更易溶于水，因而水相比例越高越易提取?；诖?， 本研究選擇T5-乙腈和檸檬酸緩沖液作為提取OTC 和TC 的提取液。

圖2 提取液對(duì)四環(huán)素和土霉回收率的影響

2.2.2 稱樣質(zhì)量 取樣量對(duì)浸提黑水虻幼蟲基質(zhì)中OTC 和TC 的提取效果影響，結(jié)果見圖3。 在固定萃取劑體積和次數(shù)的條件下， 隨著稱樣質(zhì)量由2.5 g 降低至1 g，四環(huán)素和土霉素的回收率升高，分別增加115.8%和95%。本結(jié)果與Sell 等（2018）結(jié)果一致，說明樣品質(zhì)量大，需要使用大量溶劑、吸附劑才能對(duì)提取物進(jìn)行充分提取。 Argüeso-Mata 等（2015）認(rèn)為，由于存在基質(zhì)效應(yīng)，方法的靈敏度不會(huì)隨著樣本量的增加而不斷提高，相反，樣本量越小，基質(zhì)與提取液混合越充分，相當(dāng)于通過稀釋降低了基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果的穩(wěn)定性越好。黑水虻幼蟲蛋白、脂肪含量較高，有機(jī)大分子的存在也會(huì)增加基質(zhì)對(duì)目標(biāo)抗生素離子增強(qiáng)或抑制效應(yīng)。因此，選擇1 g 稱樣質(zhì)量，有利于提高黑水虻幼蟲基質(zhì)中四環(huán)素和土霉素的提取。

圖3 取樣量對(duì)四環(huán)素和土霉素回收率的影響

2.2.3 浸提次數(shù)和浸提體積 考察了黑水虻幼蟲基質(zhì)中四環(huán)素和土霉素在10 mL 提取液中超聲1次和2 次的提取效果， 以確定超聲次數(shù)對(duì)四環(huán)素和土霉素浸提效果的影響，結(jié)果如圖4 所示，相同體積下，超聲浸提2 次，四環(huán)素和土霉素回收率顯著提高61.17%和40.17%。 超聲波引起強(qiáng)烈的空化作用、機(jī)械效應(yīng)及熱效應(yīng)，降低了蛋白及脂肪等分子對(duì)抗生素的吸附作用， 從而加速了抗生素在提取液中的釋放、擴(kuò)散和溶解，提高回收率。 在超聲浸提2 次的基礎(chǔ)上， 考察了單次浸提提取液體積（10、15、20 mL）對(duì)四環(huán)素和土霉素的提取效果的影響，結(jié)果見圖5。 提取總體積為20 mL（10 mL×2 次）時(shí)，OTC 和TC 的回收率分別為89%和65%，顯著高于10 mL 和30 mL 提取液。

圖4 浸提次數(shù)對(duì)TC 和OTC 回收率的影響

圖5 浸提體積對(duì)TC 和OTC 回收率的影響

2.3 凈化方法的選擇 利用MS 的高選擇性和高靈敏性能夠降低色譜圖中的背景噪聲， 但黑水虻基質(zhì)中蛋白、脂質(zhì)、鹽易與目標(biāo)分析物共萃取，因而針對(duì)特殊性選擇合適的凈化方法必不可少。 正己烷作為非極性有機(jī)溶劑， 加入到含抗生素的水相或極性有機(jī)溶劑中， 可有效分離極性抗生素；Oasis-HLB 小柱是由親水親脂平衡的共聚物組成，具有“特殊的極性捕獲基團(tuán)”，對(duì)極性化合物具有較好的保留效果；PRiME HLB 小柱能夠通過疏水作用及氫鍵選擇性捕獲溶液中的長(zhǎng)鏈碳?xì)浠衔锛粗愇镔|(zhì)，去除蛋白、磷脂等95%以上的基質(zhì)雜質(zhì)（Wang 等，2019）。 因此考察了三種凈化方式對(duì)黑水虻幼蟲體內(nèi)四環(huán)素和土霉素的提取效果，結(jié)果見圖6。 PRiME HLB 小柱對(duì)黑水虻幼蟲基質(zhì)中土霉素的凈化效率較其他組分別高24%和35%，對(duì)四環(huán)素的凈化效率則相對(duì)提高14%和44%。 Rizzetti 等（2018）研究認(rèn)為，即使在凈化步驟中謹(jǐn)慎去除有機(jī)相， 也有一小部分己烷留在最終萃取物中，應(yīng)避免使用己烷。本研究中使用的萃取劑有機(jī)相含量較高（50%以上），且提取后的上清液較為清亮， 因而不需要對(duì)固相萃取小柱進(jìn)行活化，直接將樣品過柱，利用重力作用使得提取液通過小柱，直接收取濾過液氮吹過膜即可，方便快捷且環(huán)保。 最終，本研究選擇PRiME HLB 小柱作為黑水虻幼蟲基質(zhì)的凈化方法。

圖6 凈化過程對(duì)四環(huán)素和土霉素回收率的影響

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià) 黑水虻幼蟲基質(zhì)中含有的脂肪、蛋白、碳水化合物、礦物質(zhì)等在浸提時(shí)易被共萃取，在ESI 模式下，液滴中共萃取化合物與抗生素之間存在電離競(jìng)爭(zhēng)，從而產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。因此，通過比較試劑（乙腈＝0.1%甲酸水，V/V＝3:2）標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)（無四環(huán)素和土霉素的黑水虻幼蟲浸提液，總離子圖見圖1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的比值減去1 后的值—ME（%）來表征基質(zhì)效應(yīng)。 當(dāng)ME（%）絕對(duì)值＜20%時(shí)，可忽略；當(dāng)20%＜ME（%）絕對(duì)值＜50%時(shí)， 為中等基質(zhì)效應(yīng)； 當(dāng)ME 絕對(duì)值（%）＞50%，基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)，應(yīng)采取措施降低基質(zhì)效應(yīng)。 經(jīng)過優(yōu)化提取和凈化步驟后， 對(duì)比試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率， 發(fā)現(xiàn)四環(huán)素和土霉素的基質(zhì)效應(yīng)分別為5.03%和-6.42%（圖7），可忽略不計(jì)。

2.5 方法的線性范圍、 檢出限 由圖7 可知，在0.1 ～500 μg/L，TC 及OTC 的質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積間呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為y＝429.73x-898.26 和y＝489.11x-1791.93，R2分別為0.9999 和0.9975。 同時(shí)，以低濃度抗生素（50 μg/kg）加標(biāo)至黑水虻幼蟲基質(zhì)后，按上述方法提取凈化，以3 倍信噪比（S/N＝3）所對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算方法檢測(cè)限（LOD），以10 倍信噪比（S/N＝10）所對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算定量限（LOQ），可知OTC 的LOD為0.07 μg/kg，LOQ 為0.28 μg/kg；TC 的LOD 為0.23 μg/kg， 而LOQ 為0.76 μg/kg。 楊 雯 筌 等（2019） 測(cè)定了蜂蛹中TC 的回收率， 其LOD 為0.4 μg/kg，LOQ 為20.0 μg/kg，蜂蛹和黑水虻均為高蛋白和高脂肪昆蟲，與楊雯筌等（2019）使用的高氯酸相比， 本研究使用的萃取劑對(duì)儀器的分析系統(tǒng)更友好，且本方法耗時(shí)更短（5.1 min）。

圖7 黑水虻幼蟲基質(zhì)中四環(huán)素和土霉素的基質(zhì)效應(yīng)

2.6 準(zhǔn)確度及精密度 準(zhǔn)確度描述了通過該方法獲得的平均測(cè)試結(jié)果與分析物真實(shí)值的接近程度， 并通過對(duì)包含已知濃度分析物的樣品進(jìn)行重復(fù)分析來確定， 一般應(yīng)在預(yù)期濃度范圍內(nèi)設(shè)三個(gè)濃度，且每個(gè)濃度至少3 個(gè)以上重復(fù)。精確度是指在相同的條件下， 由同一操作員使用同一設(shè)備在短時(shí)間內(nèi)對(duì)同一測(cè)試設(shè)施中的同一測(cè)試項(xiàng)目使用同一方法獲得獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的精度，常用RSD 表示（Kruve 等，2015）。 分析物的提取時(shí)間、次數(shù)、溶劑用量和組成（液/液、固相萃取等）都會(huì)影響回收率、LOQ 及LOD。 在上述提取和凈化條件下，以四環(huán)素和土霉素空白的黑水虻幼蟲基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。 在50、100、250 μg/kg 添加水平下（n＝5），土霉素在黑水虻幼蟲基質(zhì)中的回收率為80% ～101%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.36% ～4.67%， 四環(huán)素在黑水虻幼蟲基質(zhì)中的回收率為80% ～87%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.41% ～5.63%。Patyra 等（2017）開發(fā)了飼料基質(zhì)中四環(huán)素類抗生素測(cè)定的方法，并按照歐盟委員會(huì)第2002/657/EC號(hào)決定對(duì)其方法進(jìn)行了驗(yàn)證， 設(shè)定的加標(biāo)水平為300、1000 μg/kg 和5000 μg/kg，回收率為79.7% ～90.3%，相比之下，本方法準(zhǔn)確度和靈敏度更高。

表2 土霉素和四環(huán)素在黑水虻幼蟲中的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè) 樣品采集后，干燥方式會(huì)對(duì)待測(cè)物的保留產(chǎn)生一定的影響。 黑水虻作為動(dòng)物飼料原料使用時(shí)，常通過高溫干燥脫去水分，同時(shí)起到滅菌的作用，以方便后期運(yùn)輸及儲(chǔ)存。四環(huán)素類抗生素在高溫下（60 ℃以上）易降解，因而在烘干蟲體的過程中可能會(huì)引起抗生素的降解。 采用本研究所建立的方法對(duì)飼喂含四環(huán)素和土霉素飼料的黑水虻幼蟲進(jìn)行抗生素含量檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂抗生素的黑水虻幼蟲體內(nèi)高度殘留OTC 和TC，殘留率高達(dá)15%（殘留率/%＝蟲體中抗生素含量/飼料中抗生素含量）。 對(duì)比烘干和凍干處理發(fā)現(xiàn) （表3），65 ℃鼓風(fēng)干燥會(huì)降解部分TC 和OTC（26.43%、22.10%）。 可見干燥方式會(huì)影響幼蟲體內(nèi)抗生素的穩(wěn)定性，因此為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，在檢測(cè)樣品時(shí)，應(yīng)注意黑水虻幼蟲的前處理方式。值得注意的是，烘干相較于凍干不僅更節(jié)能方便，還能降解蟲體部分抗生素， 提高黑水虻幼蟲作為動(dòng)物飼料原料的安全性。

表3 黑水虻幼蟲體內(nèi)四環(huán)素和土霉素檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究以黑水虻幼蟲為對(duì)象， 建立了一種基于固相萃取和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)高脂肪高蛋白生物基質(zhì)中四環(huán)素和土霉素殘留的方法。 黑水虻幼蟲經(jīng)乙腈-0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液+0.5 g EDTA（V/V，1:1）雙相超聲萃取后，以PRiME HLB 柱凈化，可有效去除生物基質(zhì)中大分子的干擾，實(shí)現(xiàn)四環(huán)素和土霉素的強(qiáng)保留，避免了高濃度油脂對(duì)儀器的污染及對(duì)信號(hào)的抑制作用。 運(yùn)用該方法對(duì)飼用抗生素的黑水虻蟲體檢測(cè)其TCs 的含量，發(fā)現(xiàn)黑水虻對(duì)TCs 的殘留率達(dá)15%，具有蓄積抗生素的風(fēng)險(xiǎn)， 在將其作為動(dòng)物蛋白飼料原料時(shí)，應(yīng)監(jiān)測(cè)并控制蟲體內(nèi)抗生素含量，烘干可以去除蟲體20%以上TCs。