楊 霞， 寇 枘，4， 劉 和， 鄧正敏， 王定美， 麥力文， 李勤奮

（1.中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，海南?？?571101；2.海南省熱帶生態(tài)循環(huán)農業(yè)重點實驗室，海南海口 571101；3.中國熱帶農業(yè)科學院分析測試中心，海南?？?571101；4.上海應用技術大學生態(tài)技術與工程學院，上海， 201418）

黑水虻（Hermetia illucensL.）作為一種環(huán)境資源昆蟲， 因其幼蟲能夠取食畜禽糞便及廚余垃圾等有機廢棄物， 被廣泛用于處理有機廢棄物（Lalander，2018）。 幼蟲蟲體含有32% ～49%粗蛋白質，16% ～42%粗脂肪 （楊霞，2020；Wang，2017；Spranghers，2017 ），已被批準可作為動物蛋白飼料原料（Wang，2017）。利用黑水虻轉化畜禽糞便以實現畜牧產業(yè)無害化、 資源化生產前景廣闊。 然而畜禽糞便中常殘留抗生素（Argüeso-Mata，2021）， 其中以四環(huán)素類抗生素（TCs）殘留量最高，因而轉化畜禽糞便的黑水虻幼蟲體內存在蓄積抗生素的風險。 黑水虻可通過食物鏈將抗生素傳遞至動物和人類， 可能對公共健康造成新的潛在風險 （Van der Fels-Klerx，2017）。 此外，含有抗生素的黑水虻長期作為水產飼料可能引起水體污染， 進而造成生態(tài)環(huán)境抗性基因傳播風險。 但目前開發(fā)鑒定和量化黑水虻幼蟲體內抗生素的方法， 監(jiān)測其是否符合動物飼養(yǎng)標準鮮見相關報道。

目前我國和歐盟對飼料中抗生素的添加行為采取“零容忍”。 超高液相色譜串聯質譜因其在特異性、 靈敏度和分析速度方面都有顯著的優(yōu)勢（Kruve，2015），因而利用UPLC-MS/MS 建立一種低濃度高靈敏性的檢測黑水虻幼蟲抗生素含量的方法十分必要。研究表明，直接從生物基質中提取TCs，回收率不高（40% ～60%）（ Susakate，2019；Anumol，2017；Patyra，2017）。 生物基質易通過氫鍵、偶極間作用力與TCs 形成TCs-蛋白質結合物（高福凱，2013） 及TCs-金屬離子絡合物（張文，2020；Gentili，2005），干擾TCs 的提取。 此外，脂質（Zhang，2016）（甘油酯、脂肪酸、甘油、磷脂等）不僅會影響分析的準確度， 也極易污染分析柱和分析系統，影響儀器的精度。 可以預見，如何有效地將TCs 從黑水虻的蛋白質、脂質、磷脂、礦物質和其他干擾物中分離出來是檢測的難點所在， 必須開發(fā)有效的提取和凈化方法。

TCs 與金屬離子形成絡合物和蛋白質形成結合物可通過酸性脫蛋白物質如乙腈沉淀蛋白，乙腈極性范圍寬， 分子小， 組織穿透能力強，對糖、脂肪、蛋白質類化合物的沉淀效果好（華卞，2019）。 可通過EDTA、磷酸及檸檬酸等與TCs 競爭金屬離子降低螯合作用（Anderson，2005）。 據報道， 正己烷和除脂增強型固相萃取柱PRiME HLB 可以去除動物組織提取物中的脂質，而不會引起待測物的損失（Anumol，2017）。 因而本文考察了不同緩沖液對黑水虻幼蟲中TCs 的分離提取效果；同時對比了液液萃取和固相萃取脫脂對TCs 的凈化效果，旨在建立一種利用超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）測定黑水虻幼蟲中TCs 的方法，為監(jiān)控蟲體飼料安全性提供方法參考及數據支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 四環(huán)素 （TC， 純度為98%）、鹽酸土霉素（OTC，純度為95%），均購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司。 實驗所用的甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，一水合檸檬酸、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉為分析純。 Waters ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜儀，串聯Xevo TQ-S Micro 三重四極桿質譜聯用檢測器， 搭配ZsprayTM 電噴霧離子源（含ESI/APCI/ESCi 模式） 及Masslynx v4.1 質譜工作站；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱 （1.8 μm，2.1 mm×100 mm） 購自美國Waters 公司。 固相萃取柱為Waters PRIM HLB 小柱 （6 cc/150 mg） 及Oasis HLB （200 mg/3 mL） 購 自 美 國Waters 公 司。NM32LA 氮氣發(fā)生器購自英國 Peak 公司；XSE205BDU 十萬分之一天平購自瑞士 METTLER TOLEDO 公司。

1.2 黑水虻幼蟲樣品 選取海南省北科生態(tài)農業(yè)開發(fā)有限責任公司提供的3 齡虻蟲， 接入分別含有無抗生素、10 mg/kg 四環(huán)素、20 mg/kg 土霉素的虻蟲飼料中， 飼料配制方法及飼養(yǎng)條件同楊霞（2020）等，飼養(yǎng)虻蟲至50%出現預蛹，停止實驗。取出虻蟲，饑餓24 h，清洗，晾干，液氮致死，均分為兩份，一份在60 ℃鼓風干燥48 h 且多次翻動，另一份冷凍干燥，液氮研磨過40 目，-20 ℃保存，待測。

1.3 樣品前處理方法 分別稱取烘干及凍干虻蟲樣品1 g （精確到0.0002 g） 于25 mL 離心管中， 分別加入0.1 mol/L 乙腈-檸檬酸緩沖液（1：1，V/V） 10 mL+0.5 g EDTA， 調節(jié)pH 為3 ～4，漩渦2 min，超聲20 min 后低溫離心（10000 r/min，8 min），取上清液；復提2 次，合并提取液于25 mL離心管中。 取0.5 mL 上清液，用0.1%的甲酸乙腈稀釋為3 mL，備用。 將PRiME HLB 柱連接到固相萃取儀，吸取1 mL 備用液于PRiME HLB 柱內，以1 ～2 滴/min 流速通過固相萃取柱，收集過濾液，N2低溫吹干。 用乙腈-0.1%甲酸水（3:2，V:V）定容至1 mL，稀釋10 倍，渦旋30 s，10000 r/min離心5 min，取上清液，將溶液過0.22 μm 微孔濾膜，待測。

1.4 質譜條件 采用電噴霧離子源正離子掃描模式對黑水虻幼蟲中四環(huán)素、 土霉素進行定量檢測。 由于流動相中添加了0.1%的甲酸，因此設定毛細管電壓為0.5 kV，最佳脫溶劑氣流速為1000 L/h，最佳脫溶劑氣溫度為450 ℃，錐孔反吹氣（氮氣）50 L/h。 定量離子對、定性離子對及對應錐孔電壓和碰撞能量見表1。

表1 四環(huán)素、土霉素的定性/定量離子、錐孔電壓及碰撞能量

1.5 色譜條件 本項目采用的色譜柱為ACQUITYUPLC UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 液相色譜參數設置如下： 流速為0.25 mL/min；進樣體積為2.0 μL；設置柱溫為40 ℃；流動相組成為0.1%甲酸乙腈（A 相）及0.1%甲酸水（B 相）以確保將2 種抗生素洗脫出來。TC 的保留時間為2.64 min，OTC 的保留時間為2.55 min，梯度洗脫的洗脫程序為0 ～0.5 min，10%A；＞0.5 ～2 min，10%～60%A；＞2 ～3 min，60%A；＞3 ～4 min，60%～95%A；＞4 ～5 min，95%A；＞5 ～5.1 min；10%A。

1.6 試劑標準溶液及基質標準溶液配制 分別精確稱取0.005 g（精確到0.00002 g）四環(huán)素、土霉素鹽酸鹽標準品，用甲醇溶于50 mL 棕色容量瓶，配制為100 mg/L 的單標母液，再從母液中各取1 mL，用乙腈-0.1%甲酸水（3:2，V/V）將其稀釋為10 mg/L 的混標儲備液，置于-20 ℃保存。吸取適量混合標準液用乙腈-0.1%甲酸水（3:2，V/V）配制濃度為0.1、0.5、1、5、10、25、50、100、250、500 μg/L 的試劑標準液。 同理，將上述溶劑換為空白樣品提取液，依次配制基質標準液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按?.4 中的測定條件，以TC 和OTC 的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 檢測條件的優(yōu)化

2.1.1 質譜條件的優(yōu)化 四環(huán)素類抗生素含有3個以上羥基，在酸性溶液中易解離成正離子，故采用ESI+作為TC 及OTC 的電離方式。 質譜參數如錐孔電壓、 碰撞能量等對TCs 的裂解有重要影響，直接決定儀器的靈敏度。 使用100 μg/L 的單標液在質譜調諧測試模式下進行調試， 選取豐度最高、信號響應最強、雜質峰干擾小、信噪比較大的特征碎片離子作為定量離子對， 同時另選取一對作為定性離子對，優(yōu)化碰撞能量及錐孔電壓，最終選取426.0/442.9 作為OTC 的定量和定性離子，選擇410.0/427 作為TC 的定量離子和定性離子。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化 流動相的組成是影響分析物峰形、保留行為和質譜響應的關鍵因素。與甲醇相比， 乙腈作為流動相具有更好的分離度和更快的洗脫速度。 分析四環(huán)素類抗生素的最主要難點在于TCs 易與分析柱上殘留的硅醇基團和金屬離子相互作用（Gentili，2005），在流動相中使用絡合劑如草酸、甲酸等，可有效緩解殘留硅烷醇對固定相的影響（Anderson，2005）。 同時，在流動相中加入酸有助于TCs 在正離子模式下的離子化，但強酸易降解TCs 且損傷柱子，而弱酸提供酸性環(huán)境使得TCs 處于兩性離子狀態(tài)， 增強信號響應，獲得最佳分離和保留。本研究考察了向流動相中加入0.01%、0.1%、0.2%、0.5%的甲酸對色譜分離和質譜檢測的靈敏度影響， 結果發(fā)現在乙腈和超純水中同時加入0.1%以上的甲酸峰型尖銳，響應值及信噪比更大，洗脫效果最佳。而添加0.01%甲酸的TCs 與硅羥基發(fā)生結合，嚴重拖尾、展寬的現象，影響峰型。流動相酸度太高，響應降低，可能是強酸性 （pH＜2） 條件下TCs 降解 （華卞，2019）。此外，高濃度酸易折損分析柱壽命。因而最終確認向有機相及水相中分別加入0.1%甲酸是最優(yōu)條件。 最優(yōu)參數條件下TC 及OTC 的色譜圖見圖1。

圖1 最優(yōu)質譜參數下的TC、OTC 色譜圖

2.2 樣品前處理方法的選擇 在樣品前處理的所有關鍵步驟中，提取和純化是最復雜、最耗時的工作。 TCs 在樣品前處理過程中的不穩(wěn)定性以及復雜基質中蛋白質、 脂肪和其他物質的共萃取干擾，均會影響TCs 分析的靈敏度和重現性。

2.2.1 提取液 四環(huán)素類抗生素的C1 和C11 位置的兩個酮基使之能夠螯合金屬離子， 與硅醇基團相互作用，導致樣品制備過程中分析物的損失，因而萃取溶劑的選擇是提高萃取量和回收率的關鍵。 研究表明，EDTA、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、Na2EDTA-McIlavine 緩沖液等（張文，2020；Susakate，2019；Patyra，2017；Shalaby，2011） 能 夠與TCs 競爭螯合金屬離子從而使四環(huán)素釋放出來。 同時，添加40% ～90%強極性的有機相（乙腈） 作為提取液可有效沉淀蛋白， 破壞其空間結構，使其疏水基團向外翻轉，釋放TCs，提高柱效和檢測靈敏度（高福凱，2013）。 因此，本研究分別考察了5 種提取液：T1，乙腈-0.1%甲酸水（8:2，V/V）；T2， 乙腈-0.1%甲酸水（8:2，V/V）+0.5 g EDTA；T3，乙腈-0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllavine （2:1，V/V，pH＝4）；T4，乙腈-0.1 mol/L 磷酸緩沖液（1:1，V/V，pH＝4）+0.5 g EDTA，T5，乙腈-0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液（1:1，V/V，pH＝4）+0.5 g EDTA 對黑水虻幼蟲體內TCs 的提取效果的影響。 結果顯示（圖2）： 以T2、T4、T5 作為緩沖液，OTC 及TC 的回收率較高，TC 的回收率總體較OTC 更高。 針對黑水虻幼蟲這種基質， 加入EDTA 與具有螯合金屬能力的緩沖液提取TCs 的效果更好。 一是提取液中加EDTA 萃析后低溫離心， 在水相和有機相交匯處形成黃色固態(tài)脂肪層，脫脂效果好；二是EDTA可競爭性地與基質中金屬離子螯合， 釋放抗生素于浸提液中，從而提高回收率；三是相較于乙腈，TCs 更易溶于水，因而水相比例越高越易提取。基于此， 本研究選擇T5-乙腈和檸檬酸緩沖液作為提取OTC 和TC 的提取液。

圖2 提取液對四環(huán)素和土霉回收率的影響

2.2.2 稱樣質量 取樣量對浸提黑水虻幼蟲基質中OTC 和TC 的提取效果影響，結果見圖3。 在固定萃取劑體積和次數的條件下， 隨著稱樣質量由2.5 g 降低至1 g，四環(huán)素和土霉素的回收率升高，分別增加115.8%和95%。本結果與Sell 等（2018）結果一致，說明樣品質量大，需要使用大量溶劑、吸附劑才能對提取物進行充分提取。 Argüeso-Mata 等（2015）認為，由于存在基質效應，方法的靈敏度不會隨著樣本量的增加而不斷提高，相反，樣本量越小，基質與提取液混合越充分，相當于通過稀釋降低了基質效應，結果的穩(wěn)定性越好。黑水虻幼蟲蛋白、脂肪含量較高，有機大分子的存在也會增加基質對目標抗生素離子增強或抑制效應。因此，選擇1 g 稱樣質量，有利于提高黑水虻幼蟲基質中四環(huán)素和土霉素的提取。

圖3 取樣量對四環(huán)素和土霉素回收率的影響

2.2.3 浸提次數和浸提體積 考察了黑水虻幼蟲基質中四環(huán)素和土霉素在10 mL 提取液中超聲1次和2 次的提取效果， 以確定超聲次數對四環(huán)素和土霉素浸提效果的影響，結果如圖4 所示，相同體積下，超聲浸提2 次，四環(huán)素和土霉素回收率顯著提高61.17%和40.17%。 超聲波引起強烈的空化作用、機械效應及熱效應，降低了蛋白及脂肪等分子對抗生素的吸附作用， 從而加速了抗生素在提取液中的釋放、擴散和溶解，提高回收率。 在超聲浸提2 次的基礎上， 考察了單次浸提提取液體積（10、15、20 mL）對四環(huán)素和土霉素的提取效果的影響，結果見圖5。 提取總體積為20 mL（10 mL×2 次）時，OTC 和TC 的回收率分別為89%和65%，顯著高于10 mL 和30 mL 提取液。

圖4 浸提次數對TC 和OTC 回收率的影響

圖5 浸提體積對TC 和OTC 回收率的影響

2.3 凈化方法的選擇 利用MS 的高選擇性和高靈敏性能夠降低色譜圖中的背景噪聲， 但黑水虻基質中蛋白、脂質、鹽易與目標分析物共萃取，因而針對特殊性選擇合適的凈化方法必不可少。 正己烷作為非極性有機溶劑， 加入到含抗生素的水相或極性有機溶劑中， 可有效分離極性抗生素；Oasis-HLB 小柱是由親水親脂平衡的共聚物組成，具有“特殊的極性捕獲基團”，對極性化合物具有較好的保留效果；PRiME HLB 小柱能夠通過疏水作用及氫鍵選擇性捕獲溶液中的長鏈碳氫化合物即脂類物質，去除蛋白、磷脂等95%以上的基質雜質（Wang 等，2019）。 因此考察了三種凈化方式對黑水虻幼蟲體內四環(huán)素和土霉素的提取效果，結果見圖6。 PRiME HLB 小柱對黑水虻幼蟲基質中土霉素的凈化效率較其他組分別高24%和35%，對四環(huán)素的凈化效率則相對提高14%和44%。 Rizzetti 等（2018）研究認為，即使在凈化步驟中謹慎去除有機相， 也有一小部分己烷留在最終萃取物中，應避免使用己烷。本研究中使用的萃取劑有機相含量較高（50%以上），且提取后的上清液較為清亮， 因而不需要對固相萃取小柱進行活化，直接將樣品過柱，利用重力作用使得提取液通過小柱，直接收取濾過液氮吹過膜即可，方便快捷且環(huán)保。 最終，本研究選擇PRiME HLB 小柱作為黑水虻幼蟲基質的凈化方法。

圖6 凈化過程對四環(huán)素和土霉素回收率的影響

2.4 基質效應的評價 黑水虻幼蟲基質中含有的脂肪、蛋白、碳水化合物、礦物質等在浸提時易被共萃取，在ESI 模式下，液滴中共萃取化合物與抗生素之間存在電離競爭，從而產生基質效應。因此，通過比較試劑（乙腈＝0.1%甲酸水，V/V＝3:2）標準曲線與基質（無四環(huán)素和土霉素的黑水虻幼蟲浸提液，總離子圖見圖1）標準曲線的斜率的比值減去1 后的值—ME（%）來表征基質效應。 當ME（%）絕對值＜20%時，可忽略；當20%＜ME（%）絕對值＜50%時， 為中等基質效應； 當ME 絕對值（%）＞50%，基質效應較強，應采取措施降低基質效應。 經過優(yōu)化提取和凈化步驟后， 對比試劑標準曲線斜率和基質標準曲線斜率， 發(fā)現四環(huán)素和土霉素的基質效應分別為5.03%和-6.42%（圖7），可忽略不計。

2.5 方法的線性范圍、 檢出限 由圖7 可知，在0.1 ～500 μg/L，TC 及OTC 的質量濃度與對應的峰面積間呈良好的線性關系，線性方程分別為y＝429.73x-898.26 和y＝489.11x-1791.93，R2分別為0.9999 和0.9975。 同時，以低濃度抗生素（50 μg/kg）加標至黑水虻幼蟲基質后，按上述方法提取凈化，以3 倍信噪比（S/N＝3）所對應的濃度計算方法檢測限（LOD），以10 倍信噪比（S/N＝10）所對應的濃度計算定量限（LOQ），可知OTC 的LOD為0.07 μg/kg，LOQ 為0.28 μg/kg；TC 的LOD 為0.23 μg/kg， 而LOQ 為0.76 μg/kg。 楊 雯 筌 等（2019） 測定了蜂蛹中TC 的回收率， 其LOD 為0.4 μg/kg，LOQ 為20.0 μg/kg，蜂蛹和黑水虻均為高蛋白和高脂肪昆蟲，與楊雯筌等（2019）使用的高氯酸相比， 本研究使用的萃取劑對儀器的分析系統更友好，且本方法耗時更短（5.1 min）。

圖7 黑水虻幼蟲基質中四環(huán)素和土霉素的基質效應

2.6 準確度及精密度 準確度描述了通過該方法獲得的平均測試結果與分析物真實值的接近程度， 并通過對包含已知濃度分析物的樣品進行重復分析來確定， 一般應在預期濃度范圍內設三個濃度，且每個濃度至少3 個以上重復。精確度是指在相同的條件下， 由同一操作員使用同一設備在短時間內對同一測試設施中的同一測試項目使用同一方法獲得獨立測試結果的精度，常用RSD 表示（Kruve 等，2015）。 分析物的提取時間、次數、溶劑用量和組成（液/液、固相萃取等）都會影響回收率、LOQ 及LOD。 在上述提取和凈化條件下，以四環(huán)素和土霉素空白的黑水虻幼蟲基質進行加標回收實驗，結果見表2。 在50、100、250 μg/kg 添加水平下（n＝5），土霉素在黑水虻幼蟲基質中的回收率為80% ～101%， 相對標準偏差為3.36% ～4.67%， 四環(huán)素在黑水虻幼蟲基質中的回收率為80% ～87%， 相對標準偏差為4.41% ～5.63%。Patyra 等（2017）開發(fā)了飼料基質中四環(huán)素類抗生素測定的方法，并按照歐盟委員會第2002/657/EC號決定對其方法進行了驗證， 設定的加標水平為300、1000 μg/kg 和5000 μg/kg，回收率為79.7% ～90.3%，相比之下，本方法準確度和靈敏度更高。

表2 土霉素和四環(huán)素在黑水虻幼蟲中的添加回收率及相對標準偏差（n=5）

2.7 實際樣品檢測 樣品采集后，干燥方式會對待測物的保留產生一定的影響。 黑水虻作為動物飼料原料使用時，常通過高溫干燥脫去水分，同時起到滅菌的作用，以方便后期運輸及儲存。四環(huán)素類抗生素在高溫下（60 ℃以上）易降解，因而在烘干蟲體的過程中可能會引起抗生素的降解。 采用本研究所建立的方法對飼喂含四環(huán)素和土霉素飼料的黑水虻幼蟲進行抗生素含量檢測，結果發(fā)現，飼喂抗生素的黑水虻幼蟲體內高度殘留OTC 和TC，殘留率高達15%（殘留率/%＝蟲體中抗生素含量/飼料中抗生素含量）。 對比烘干和凍干處理發(fā)現 （表3），65 ℃鼓風干燥會降解部分TC 和OTC（26.43%、22.10%）。 可見干燥方式會影響幼蟲體內抗生素的穩(wěn)定性，因此為確保結果的準確性，在檢測樣品時，應注意黑水虻幼蟲的前處理方式。值得注意的是，烘干相較于凍干不僅更節(jié)能方便，還能降解蟲體部分抗生素， 提高黑水虻幼蟲作為動物飼料原料的安全性。

表3 黑水虻幼蟲體內四環(huán)素和土霉素檢測結果

3 結論

本研究以黑水虻幼蟲為對象， 建立了一種基于固相萃取和超高效液相色譜-串聯質譜檢測高脂肪高蛋白生物基質中四環(huán)素和土霉素殘留的方法。 黑水虻幼蟲經乙腈-0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液+0.5 g EDTA（V/V，1:1）雙相超聲萃取后，以PRiME HLB 柱凈化，可有效去除生物基質中大分子的干擾，實現四環(huán)素和土霉素的強保留，避免了高濃度油脂對儀器的污染及對信號的抑制作用。 運用該方法對飼用抗生素的黑水虻蟲體檢測其TCs 的含量，發(fā)現黑水虻對TCs 的殘留率達15%，具有蓄積抗生素的風險， 在將其作為動物蛋白飼料原料時，應監(jiān)測并控制蟲體內抗生素含量，烘干可以去除蟲體20%以上TCs。