韓 昱， 劉 月， 張 寧， 周國(guó)璽， 馮海偉， 張立永， 張富梅

（1.河北北方學(xué)院，河北張家口 075000；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定 071000；3.河北省張家口市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，河北張家口 075000；4.北京金星鴨業(yè)有限公司，北京 100076）

我國(guó)作為養(yǎng)殖兔和出口兔最多的國(guó)家， 兔產(chǎn)業(yè)極大地帶動(dòng)了我國(guó)各項(xiàng)產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。 斷奶仔兔作為兔生長(zhǎng)的基礎(chǔ)階段， 在兔整個(gè)發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。 但是斷奶仔兔由于免疫機(jī)能不完善，難以抵抗外界的侵害，是飼養(yǎng)管理過(guò)程中比較棘手的一個(gè)問(wèn)題。 由此導(dǎo)致的腹瀉是影響斷奶仔兔生產(chǎn)養(yǎng)殖的主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在一個(gè)平均為20%死亡率的兔群中，70%以上系腹瀉病所致（趙泮峰，2011；桑英智，2011）?？股赜捎谀退幮浴⑺幬餁埩舻戎T多弊病，作為預(yù)防兔腹瀉的藥物已成為過(guò)去，隨著無(wú)抗養(yǎng)殖時(shí)代的到來(lái)，尋求抗生素替代品，采用綠色有效的方法預(yù)防兔腹瀉，并且研究其作用機(jī)制成為一種趨勢(shì)（徐文龍，2009）。本研究通過(guò)在斷奶仔兔日糧中添加中草藥復(fù)方，研究其對(duì)仔兔免疫性能和抗氧化性能的影響，從而為減少斷奶仔兔腹瀉，促進(jìn)生長(zhǎng)，保障養(yǎng)兔業(yè)健康綠色發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 基礎(chǔ)日糧由張家口某養(yǎng)兔場(chǎng)提供。中草藥購(gòu)自河北北方學(xué)院校醫(yī)院，主要成分為白頭翁、茵陳、黃連、黨參、黃芪等，粉碎后過(guò)60 目篩，按比例均勻混合于飼料中并加工成顆粒料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)選取體重相近、健康的30日齡伊拉兔斷奶幼兔60 只，公母各半，隨機(jī)分為2 組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 只。 A 組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧，B 組為試驗(yàn)組，飼喂基礎(chǔ)日糧+1%中草藥復(fù)方。 各組仔兔斷奶后自由采食5 d 進(jìn)入試驗(yàn)期，試驗(yàn)期60 d。 試驗(yàn)期間飼喂量、飼喂次數(shù)及時(shí)間相同， 在同一飼養(yǎng)環(huán)境及管理方法下進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)測(cè)定項(xiàng)目和方法 于試驗(yàn)第30 天和60天分別從對(duì)照組及試驗(yàn)組中每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選擇4 只兔，公母各半，每組共12 只，無(wú)菌耳緣靜脈采血5 mL，靜置3 h，3000 r/min 離心10 min，制備血清， 并將血清分裝到1.5 mL 離心管中，-20 ℃冷凍保存。將兔剖解，取脾臟、胸腺和肝臟，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.3.1 免疫指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1.1 免疫器官指數(shù)測(cè)定 摘出新鮮的脾臟和胸腺，去掉其表面的脂肪組織并進(jìn)行稱重，計(jì)算其指數(shù)。

免疫器官指數(shù)/（g/kg）＝器官鮮重/活體重量。

1.3.1.2 血清IgG 含量及血清細(xì)胞因子 （IL-2、IL-6） 含量測(cè)定 血清樣品送北京華英生物技術(shù)研究所。 血清IL-2、IL-6 含量采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定，血清IgG 含量采用比色法進(jìn)行測(cè)定（A6 半自動(dòng)生化儀）。

1.3.1.3 脾 臟IL-2、IFN-γ mRNA 表 達(dá) 量 測(cè) 定取脾臟樣品相同位置， 用4 ℃生理鹽水進(jìn)行沖洗后， 用錫箔紙包裹， 先放入液氮中速凍， 然后移入-80 ℃冰箱中待用。 樣品按試劑盒（Invitrogen）操作說(shuō)明進(jìn)行總RNA 提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 質(zhì)量， 并經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)得A260/A280值在1.8 ～2.0，驗(yàn)證所提RNA 質(zhì)量合格。取1.0 ～5.0 μg 總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche）操作說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 并以此為模板利用熒光定量PCR 技術(shù)測(cè)定IL-2 基因表達(dá)量。 PCR反應(yīng)體系20 μL，其中包括5 μL cDNA 模板，上、下游引物各0.4 μL。

IL-2 上、 下游引物序列分別為：CTACTGCTGGATTTACAGGTGCT和TCTGTGACCTTCTTGGGCATAT；IFN-γ 上、 下游引物序列分別 為：TTCTTCAGCCTCACTCTCTCC 和TGTTGTCACTCTCCTCTTTCC；內(nèi)參GAPDH 上、下游引物序列分別為：CGCCTGGAGAAAGCTGCTA 和ACGACCTGGTCCTCGGTGTA；PCR 反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃10 min；然后95 ℃15 s，60 ℃60 s，75 ～95 ℃，每20 s 升溫1 ℃，40 個(gè)循環(huán)。

1.3.2 血清抗氧化指標(biāo)測(cè)定 測(cè)定血清中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。 以上均采用721 型分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0 進(jìn)行分析， 結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥復(fù)方對(duì)仔兔免疫性能的影響

2.1.1 中草藥復(fù)方對(duì)仔兔免疫器官指數(shù)的影響表1 顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)30 d 仔兔脾臟指數(shù)顯著提高17.78%（P＜0.05），而試驗(yàn)60 d 脾臟指數(shù)在一定程度得到提高（P＞0.05）。 另外，試驗(yàn)30 d 和60 d 胸腺指數(shù)均有一定提高，但差異均不顯著（P＞0.05）。 由此說(shuō)明，中草藥復(fù)方能夠有效提高仔兔的免疫器官指數(shù)。

表1 中草藥復(fù)方對(duì)仔兔免疫器官指數(shù)的影響g/kg

2.1.2 中草藥復(fù)方對(duì)仔兔血清免疫指標(biāo)的影響表2 顯示，試驗(yàn)30 d 試驗(yàn)組仔兔血清中IgG 含量較對(duì)照組增多，但差異不顯著（P＞0.05），IL-2 和IL-6 含量分別顯著升高20.91%和9.33%（P＜0.05）； 試 驗(yàn)60 d 仔 兔 血 清 中IgG 含 量 升 高10.36%（P＜0.05），IL-2 和IL-6 含量分別極顯著升高61.71%和22.88%（P＜0.01）。 由此說(shuō)明，飼料中添加中草藥復(fù)方能夠有效提高伊拉兔仔兔血液中的免疫指標(biāo)水平。

表2 中草藥復(fù)方對(duì)仔兔血清免疫指標(biāo)的影響

2.1.3 中草藥復(fù)方對(duì)仔兔脾臟IL-2、IFN-γ mRNA 表達(dá)量的影響 圖1 和圖2 顯示， 與對(duì)照組相比， 試驗(yàn)組在試驗(yàn)30 d 和60 d 的IL-2 mRNA表達(dá)量均得到顯著提高（P＜0.05），IFN-γ mRNA表達(dá)量在一定程度上提高， 但差異不顯著 （P＞0.05）。 由此在分子機(jī)制層面說(shuō)明，中草藥復(fù)方能夠有效改善伊拉兔仔兔免疫性能。

圖1 中草藥復(fù)方對(duì)仔兔脾臟IL-2 mRNA 表達(dá)量的影響

圖2 中草藥復(fù)方對(duì)仔兔脾臟IFN-γ mRNA 表達(dá)量的影響

2.2 中草藥復(fù)方對(duì)仔兔血清抗氧化性能的影響由表3 可見(jiàn)，斷奶仔兔日糧中添加中草藥復(fù)方，總體趨勢(shì)可以增加血清中GSH-Px 和SOD 活性，降低MDA 含量， 即可以顯著改善仔兔機(jī)體的抗氧化性能。其中試驗(yàn)組30 d GSH-Px 和SOD 水平以及60 d SOD 水平較對(duì)照組分別顯著提高3.37%、14.05%和13.57%（P＜0.05），60 d MDA 含量較對(duì)照組極顯著降低17.24%（P＜0.01）。

表3 中草藥復(fù)方對(duì)仔兔血清抗氧化指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 中草藥復(fù)方對(duì)斷奶仔兔免疫性能的影響仔兔腹瀉多發(fā)生在斷奶至斷奶后2 個(gè)月這個(gè)階段， 該階段仔兔的免疫性能直接影響其對(duì)腹瀉致病菌的抵抗力。免疫器官指數(shù)、血清中IgG 以及細(xì)胞因子IL-2 和IL-6 含量的變化可以反映機(jī)體免疫性能的高低。 在一定范圍內(nèi)免疫器官指數(shù)越高其免疫功能越強(qiáng)（張永翠，2008）。 IgG 是血清中主要的免疫球蛋白，具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗外毒素等多種活性（馬春全，2004）。 IL-2 和IL-6 是機(jī)體重要的細(xì)胞因子。 IL-2 主要由T 細(xì)胞產(chǎn)生，最顯著的作用是影響T 淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)，也能夠促進(jìn)B 細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化。 IL-6 主要由單核巨噬細(xì)胞、Th2 細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。能夠刺激活化B 細(xì)胞增殖，分泌抗體，刺激T 細(xì)胞增 殖（Ahrens，2021；Holmer，2014；Smolen，2006）。IFN-γ 是由機(jī)體內(nèi)活化的T 淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，IFN-γ 除具有抗病毒、抗胞內(nèi)寄生菌和寄生原蟲的作用外， 還具有獨(dú)特而強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能（龍振洲，1998）。

李學(xué)釗等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，中草藥飼料添加劑能夠有效增加獺兔免疫器官指數(shù)， 尤其是顯著增加胸腺質(zhì)量和指數(shù)；左曉磊等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，中草藥制劑能夠提高獺兔胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)；崔艷麗等（2008）通過(guò)小鼠腹腔注射0.25%或0.1%黃芪多糖， 發(fā)現(xiàn)其能增加小鼠脾細(xì)胞數(shù)及脾臟重量。有研究表明，添加中草藥制劑可提高獺兔血清中IgG、IgA 含量， 其中添加1.5%中草藥制劑組IgG 含量差異顯著 （郭劍英等，2012）； 郝福星等（2008）發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中草藥制劑可明顯提高仔豬血清中IL-2 含量；高文婧等（2019）發(fā)現(xiàn)，復(fù)合中草藥添加劑能夠提高蘆花雛雞脾臟IL-2m RNA 的表達(dá)量。李云鑫（2020）發(fā)現(xiàn)，六位中草藥能夠有效提高細(xì)胞因子IL-2 和IFN-γ 的mRNA 表達(dá)水平，從而提高肉雞免疫性能。

本研究針對(duì)斷奶仔兔腹瀉率和死亡率高的現(xiàn)狀，按照中醫(yī)辯證理論篩選了具有清熱解毒、涼血止痢、滋補(bǔ)氣血、健脾和胃、消食化積效果的中草藥復(fù)方， 課題組前期試驗(yàn)證明其能夠顯著降低斷奶仔兔腹瀉率和死亡率（韓福生等，2018）。本試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 所用中草藥復(fù)方可以明顯提高仔兔脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)， 可以顯著提高血清中IgG 含量和IL-2 和IL-6 水平。 為了從分子機(jī)制上進(jìn)行探討， 對(duì)脾臟中IL-2 和IFN-γ mMRA 表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定分析， 發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組兩種基因表達(dá)量均升高，其中IL-2 mMRA 表達(dá)量變化顯著。 研究表明， 該中草藥復(fù)方顯示了能提高斷奶仔兔的免疫性能的作用， 這從一個(gè)很重要的方面證實(shí)了該中草藥復(fù)方在預(yù)防仔兔腹瀉應(yīng)用上的可行性。中草藥復(fù)方中黨參和黃芪的使用， 通過(guò)對(duì)仔兔氣血的滋補(bǔ)，可以提高機(jī)體的抗病力和免疫力，從而顯著降低斷奶仔兔腹瀉率和死亡率。

3.2 中草藥復(fù)方對(duì)斷奶兔仔兔抗氧化性能的影響 GSH-Px、SOD 的活性可以充分反映動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力， 其主要作用是可以幫助動(dòng)物機(jī)體抵擋自由基的傷害。當(dāng)自由基攻擊動(dòng)物機(jī)體時(shí)，機(jī)體就會(huì)產(chǎn)生MDA， 因此當(dāng)動(dòng)物機(jī)體MDA 含量升高時(shí)，就表明機(jī)體正在遭受自由基的傷害（申瑞玲等，2000）。有數(shù)據(jù)顯示，把中草藥復(fù)方添加在斷奶仔豬的日糧中進(jìn)行飼喂， 可以增強(qiáng)其自身的抗氧化能力， 是因中草藥可以明顯提升血清中超氧化物酶的活性，降低自由基對(duì)機(jī)體的損傷程度，同時(shí)也不會(huì)產(chǎn)生更多的MDA（尹富貴等，2007）。 本試驗(yàn)結(jié)果表明， 中草藥復(fù)方能夠有效增強(qiáng)仔兔血清中GSH-Px 和SOD 活性， 尤其顯著增強(qiáng)SOD 活性，另外對(duì)MDA 含量也有較好的降低作用。 說(shuō)明該中草藥復(fù)方可以有效改善仔兔體內(nèi)的抗氧化性能。 這從另一方面闡述了中草藥復(fù)方在預(yù)防仔兔腹瀉、提高生產(chǎn)性能方面的可行性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明， 所用中草藥復(fù)方能夠明顯增強(qiáng)斷奶仔兔的免疫力，提高其抗氧化性能，并且對(duì)增強(qiáng)其機(jī)體抵抗力， 減少腹瀉的發(fā)生具有積極作用。