馮海霞， 王金龍 ， 呂 偉， 劉勝利， 馬艷艷

（1.青島尚德生物技術(shù)有限公司，山東青島 266111；2.山東隆科特酶制劑有限公司，山東臨沂 276400）

凝結(jié)芽孢桿菌屬于芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬，具有耐酸、耐膽鹽、耐溫，可產(chǎn)生L-乳酸和凝固素， 并且可以在腸道內(nèi)定植等優(yōu)良特性，目前已經(jīng)在國(guó)內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用，既可以作為保健、藥品應(yīng)用到人體，也可以作為飼料添加劑應(yīng)用到動(dòng)物生產(chǎn)中。

目前，國(guó)內(nèi)外有多株凝結(jié)芽孢桿菌菌株，通過(guò)16S rRNA 基因測(cè)序鑒定到凝結(jié)芽孢桿菌種， 但凝結(jié)芽孢桿菌不同菌株之間如何區(qū)分，目前鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（MLST）是由Maiden 等（1998）學(xué)者提出的，該技術(shù)多用于病原菌菌株間分類(lèi)鑒定（呂國(guó)平等，2013；楊瑞複，2009），隨著技術(shù)的成熟和分子生物學(xué)的發(fā)展，逐漸用于多種菌株的鑒定（徐海燕等，2013）。 MLST 分型技術(shù)以相對(duì)保守的多個(gè)管家基因（一般5 ～8 個(gè)）為依據(jù)，通過(guò)對(duì)每個(gè)管家基因的測(cè)序分型，對(duì)各菌株親緣關(guān)系進(jìn)行分析。 本試驗(yàn)選用了15 株國(guó)內(nèi)凝結(jié)芽孢桿菌菌株和1 株參考菌株DSM 1， 利用MLST 分型技術(shù)對(duì)16 株菌株進(jìn)行分型， 并利用系統(tǒng)發(fā)育技術(shù)對(duì)各菌株之間的親緣關(guān)系進(jìn)行分類(lèi)鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 青島根源生物集團(tuán)菌庫(kù)10 株菌株， 編號(hào)：G-1、G-2、G-3、G-4、G-5、G-6（E32）、G-7、G-8、G-9、E21（該菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行專(zhuān)利菌株保藏，編號(hào)CGMCC No.13044）；國(guó)內(nèi)市場(chǎng)凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品分離菌株5 株， 編號(hào)：Y1、Y2、Y3、Y4、Y5； 參考菌株1 株：Bacillus coagulansDSM 1 ＝ATCC 7050（簡(jiǎn)稱(chēng)DSM 1）。

1.2 主要試劑與儀器 菌培養(yǎng)試劑：MRS 固體培養(yǎng)基、MRS 肉湯， 均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。 菌株基因組DNA 提取及擴(kuò)增試劑，細(xì)菌基因組提取試劑盒，Masster Mix，Maker 2000 均購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。基因擴(kuò)增儀：上海領(lǐng)成生物科技有限公司，型號(hào)TCT5；恒溫培養(yǎng)振蕩器： 上海智城分析儀器制造有限公司， 型號(hào)ZWY-2102；隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號(hào)GSP-9080MBE；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：Eppendorf Centrifuge 5810R；凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Biorad 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物合成 參考PubMLST 庫(kù)（網(wǎng)站http://pubmlst.org/） 對(duì)地衣芽孢桿菌 （Bacillus licheniformis）的報(bào)道，在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 中下載凝結(jié)芽孢桿菌參考菌株DSM 1 和地衣MLST 中相同管家基因的序列， 然后通過(guò)CE Design V1.04 軟件設(shè)計(jì)凝結(jié)芽孢桿菌的相關(guān)引物，引物通過(guò)上海生工合成。 引物序列如表1。

表1 凝結(jié)芽孢桿菌5 個(gè)管家基因的引物

1.3.2 菌株培養(yǎng)及核酸提取 凝結(jié)芽孢桿菌菌株經(jīng)MRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，多次劃線純化，直到得到單一的菌落形態(tài)為止。然后挑取純化后的各菌株平板上的單菌落至滅菌好的MRS 液體試管中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，取1 mL 培養(yǎng)液用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取不同凝結(jié)芽孢桿菌菌株的基因組DNA。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增及電泳分析 16S rRNA 基因擴(kuò)增，用27F&1492R 細(xì)菌通用引物擴(kuò)增，擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠確認(rèn)有清晰條帶后， 送往生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。 管家基因序列擴(kuò)增：用表1 中的引物以提取的DNA 為模板，加入1×Masster Mix 和管家基因的前后端引物， 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 管家基因PCR 反應(yīng)體系25 μL：DNA模板1 μL，1×Masster Mix 22 μL， 引物F、R 各1 μL。管家基因PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。 擴(kuò)增片段經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠確認(rèn)有清晰條帶后，送往生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

1.3.4 測(cè)序結(jié)果比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析 各菌株不同管家基因的測(cè)序序列經(jīng)過(guò)DNAMAN 軟件比對(duì)，把前后測(cè)序不合適的片段進(jìn)行刪除編輯，然后按adk-recF-sucC-rpoB-spoOA順序串聯(lián)起來(lái)，經(jīng)CLUSTAL 軟件處理后， 用MEGA6.0 軟件做成進(jìn)化樹(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 所有試驗(yàn)菌株均做了16S rRNA 基因鑒定，BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)和Bacillus coagulans的相似性菌均在99%以上，選取部分菌株的16S rRNA 序列和參考菌株DSM1 的16S rRNA（NR_115727.1）做系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果如圖1 所示，試驗(yàn)的15 株菌株用16S rRNA 序列同源性在99.9%以上， 無(wú)法較好地區(qū)分開(kāi)。

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌菌株16S rRNA 基因進(jìn)化樹(shù)

2.2 MLST 分析系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 試驗(yàn)菌株的5 個(gè)管家基因測(cè)序情況如表2 所示， 剪輯后的片段大小集中在550 ～1064 bp， 將管家基因按adkrecF-sucC-rpoB-spoOA的順序串聯(lián)后，總長(zhǎng)度為4010 bp 左右，多態(tài)性位點(diǎn)總數(shù)為132 個(gè)。 串聯(lián)后序列經(jīng)CLUSTAL 軟件處理后用MEGA6.0 做進(jìn)化樹(shù)，如圖2 所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青島根源生物集團(tuán)菌庫(kù)10 株和市場(chǎng)菌株Y1、Y2 聚為一類(lèi)，Bootstrap 值≥99； 市 場(chǎng) 菌 株Y3、Y4、Y5 聚 為 一 類(lèi)，Bootstrap 值≥99， 其中Y4 和Y3、Y5 略有不同，Bootstrap 值偏低，只有47；參考菌株DSM1 為第三類(lèi)。 MLST 分析結(jié)果中菌株間相似性明顯低于16S rRNA 結(jié)果，不過(guò)參考菌株DSM1 仍與國(guó)內(nèi)其他菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表2 15 株不同凝結(jié)芽孢桿菌菌株MLST 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖2 基于MLST 分型的凝結(jié)芽孢桿菌菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

凝結(jié)芽孢桿菌具有乳酸菌和芽孢菌的雙重特性， 試驗(yàn)開(kāi)始借鑒植物乳桿菌和雙歧桿菌等乳酸菌的相關(guān)報(bào)道（劉洋等，2017；馮淑貞，2016；江建平等，2015）， 試圖尋找適合凝結(jié)芽孢桿菌不同菌株區(qū)分的管家基因，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)都不可行。后來(lái)參考蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌（劉陽(yáng)等，2018），發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌的MLST 分析的管家基因更適合凝結(jié)芽孢桿菌不同菌株區(qū)分。

16S rRNA 基因測(cè)序能從大的范圍內(nèi)確定該菌株是否為凝結(jié)芽孢桿菌， 但是菌株間相似性普遍高于99%，差異性極小無(wú)法區(qū)分。 MLST 技術(shù)采用多個(gè)管家基因，基因長(zhǎng)度一般在400 ～800 bp，可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好、分辨率高。 因而MLST 技術(shù)可作為種內(nèi)分型的強(qiáng)有力工具， 能夠清晰解析菌株間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。 雖然目前MLST 數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌的ST 型， 相信隨著益生菌的快速研究發(fā)展，會(huì)逐步建立和完善。

目前市面上商業(yè)化的凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品參差不齊， 如果想鑒別真?zhèn)危?可通過(guò)分離純化菌株做16S rRNA 鑒定。 但16S rRNA 技術(shù)的局限性在于無(wú)法區(qū)分種內(nèi)不同菌株間的差異性。 本試驗(yàn)選取國(guó)內(nèi)有代表性的15 株凝結(jié)芽孢桿菌菌株，并參考NCBI 中凝結(jié)芽孢桿菌菌株DSM1，通過(guò)5 個(gè)管家基因，adk、recF、sucC、rpoB和spoOA的擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果拼接串聯(lián)后，做系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)大部分菌株G1-G9、E21 和Y1、Y2 為同一類(lèi)別（Bootstrap值≥99），Y3、Y4、Y5 三個(gè)菌株為第二類(lèi)別（Bootstrap 值≥99）， 參考菌株DSM1 和國(guó)內(nèi)凝結(jié)芽孢桿菌菌株差異較大為第三類(lèi)。 本文從分子生物學(xué)方面入手， 避免傳統(tǒng)生理生化試驗(yàn)的繁瑣和不確定性， 可為益生菌從業(yè)者及益生菌生產(chǎn)企業(yè)提供一定參考。