章燁雯， 臧青民， 蔣德旗， 韋 敏， 李桂芬

（玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院，廣西玉林 537000）

白眉草[Gerbera piloselloides（L.） Cass]，又名毛大丁草、一枝香、貼地風(fēng)，為菊科菊木族植物（廣東中藥志委員會(huì)，1994；廣西衛(wèi)生局，1992），在我國廣西、浙江、四川、廣東、云南以及國外緬甸、非洲等地均有分布。白眉草化學(xué)成分復(fù)雜多樣，含有香豆素類、黃酮類、甾醇類、苯駢吡喃、萜類、糖苷以及有機(jī)酸等多種活性成分（張貝西等，2019；肖瑛等，2002）。其中，黃酮類是白眉草中含量較高的一類成分，具有抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、止咳化痰、抗水腫等多種藥理活性（魏良柱等，2014）。 另外，該類化合物能促進(jìn)動(dòng)物健康育肥，其作為飼料添加劑有助于增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力， 同時(shí)提高肉類品質(zhì)（馮香安，2011）。超聲輔助技術(shù)是近年來用于黃酮類化合物提取的一種重要方法，具有耗時(shí)短、效率高、無污染等優(yōu)點(diǎn)（趙二勞，2018）。 本研究采用超聲輔助方法對白眉草總黃酮進(jìn)行提取， 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計(jì)對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察其抗菌活性，為白眉草在飼料添加劑中的開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 儀器材料 白眉草購于玉林市中藥材市場，經(jīng)過鑒 定為菊 科[Gerbera piloselloides（L.） Cass]菊木族（Compositae）植物白眉草（MutisieaeCass.）的干燥全草；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，為玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室取供試細(xì)菌；瓊脂粉（杭州微生物試劑有限公司）；牛肉浸膏（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；氯霉素（江西忠鳴醫(yī)藥原料有限公司）；無水乙醇（分析純，重慶湘鴻化工有限公司）；無水甲醇（分析純，河南天驕化工有限公司）；氯化鈉（洛陽市化學(xué)試劑廠）。

新型密封式粉碎機(jī)（廣州雷邁機(jī)械設(shè)備有限公司）； 電子游標(biāo)卡尺 （碭山縣通和量具有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋 （常州國華電器有限公司）；HH.B11.600-S-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 （黃明堦，2009）。精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品15.00 mg，制備0.6 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。 在510 nm 波長測定溶液的吸光度， 以濃度X為橫坐標(biāo)， 吸光度Y為縱坐標(biāo)得到線性回歸方程Y=9.9449X+0.0169（R2=0.9999），表明蘆丁在0.012 ～0.240 mg/mL 與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2 白眉草總黃酮提取及測定方法 精確稱取20.0 g 白眉草粉末于錐形瓶中，按照一定的條件進(jìn)行超聲提取，超聲結(jié)束后減壓抽濾，濾渣再進(jìn)行二次提取，合并濾液，濃縮，得白眉草總黃酮提取物。

取白眉草總黃酮提取物定容到100 mL，吸取1 mL 于10 mL 容量瓶中， 按照測蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測吸光度值， 并根據(jù)回歸方程計(jì)算白眉草總黃酮溶液的濃度。 計(jì)算公式如下：

總黃酮得率/% =（C×V×N）/m×100；

式中：C為溶液的濃度，mg/mL；V為溶液的定容體積，mL；N為測定時(shí)溶液的稀釋倍數(shù)；m為提取用的中藥材粉末質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)對白眉草總黃酮得率的影響稱取白眉草樣品20.0 g， 在超聲功率固定為240 W 的條件下， 分別考察乙醇濃度 （50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30）、超聲溫度（40、50、60、70、80 ℃）和超聲時(shí)間（15、30、45、60、75 min）對白眉草總黃酮得率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化白眉草總黃酮提取工藝 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上， 以白眉草總黃酮得率為指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，各因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.3 體外抗菌測定

1.3.1 菌液的配制 分別將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌接種到已制備并滅菌的牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，于37 ℃培養(yǎng)24 h。將活化后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，制成菌懸液（Heidi 等，2012）。

1.3.2 濾紙片擴(kuò)散法測定提取物的抑菌圈 將大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌的菌懸液各0.5 mL，均勻涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上。 以無菌蒸餾水浸泡的藥敏紙片作為空白對照， 氯霉素（200 μg/mL）浸泡的濾紙片作為陽性對照。 將浸泡在最佳工藝下得到的白眉草總黃酮提取物中的藥敏紙片取出，晾干，分別放入已接好供試菌的平板相對應(yīng)的區(qū)域內(nèi)，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h 后，觀察其抑菌效果。做3 個(gè)平行試驗(yàn)，使用電子游標(biāo)卡尺測量每組平板的抑菌圈直徑，取平均值。

1.3.3 最低抑菌濃度的測定 用試管二倍稀釋法（李金煥等，2016；劉麗娟等，2013）測定白眉草總黃酮提取物的最低抑菌濃度（MIC）。 將白眉草總黃酮提取物 （100 g/L） 稀釋成50、25、12.5、6.25、3.125 g/L 和1.5625 g/L 等濃度溶液。 分別將大腸桿菌菌懸液或金黃色葡萄球菌菌懸液0.5 mL 均勻涂布于培養(yǎng)皿中， 然后將浸泡各個(gè)濃度溶液的濾紙片放入培養(yǎng)皿中，測量抑菌圈大小。

1.3.4 最低殺菌濃度的測定 于上述最低抑菌濃度測定中的藥液含量各吸取0.1 mL，分別放入相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上， 涂布均勻，并做好標(biāo)記，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h， 并觀察有無細(xì)菌生長。結(jié)果判定：以培養(yǎng)皿中計(jì)數(shù)少于5 個(gè)菌落的藥物濃度記為該藥的最低殺菌濃度（MBC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對白眉草總黃酮得率的影響 固定料液比1：20，超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間45 min，研究不同乙醇濃度對白眉草總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖1。由結(jié)果可知，在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的升高白眉草總黃酮得率增大，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值，隨后總黃酮的得率下降。 這可能是乙醇濃度過高，將白眉草中的葉綠素等雜質(zhì)溶出，從而影響總黃酮的提取。

圖1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

2.1.2 料液比對白眉草總黃酮得率的影響 固定乙醇濃度70%，超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間45 min，研究不同料液比對白眉草總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖2。 由結(jié)果可知，在一定范圍內(nèi)，隨著料液比的增加，白眉草總黃酮得率逐漸增大，當(dāng)料液比大于1:20 時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值，隨后總黃酮得率反而下降。這可能是隨著溶劑的增加，將白眉草中的雜質(zhì)溶出，影響黃酮化合物的溶解，使總黃酮得率降低。

圖2 料液比對總黃酮得率的影響

2.1.3 超聲溫度對白眉草總黃酮得率的影響 固定乙醇濃度60%，料液比1:20，超聲時(shí)間45 min，研究不同超聲溫度對白眉草總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖3。 由結(jié)果可知，在一定范圍內(nèi)，隨著超聲溫度的升高，白眉草總黃酮得率增大，在超聲溫度為60 ℃時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最高，隨后總黃酮得率開始降低。這可能是溫度過高，使黃酮部分結(jié)構(gòu)被破壞，從而使總黃酮得率降低。

圖3 超聲溫度對總黃酮得率的影響

2.1.4 超聲時(shí)間對白眉草總黃酮得率的影響 固定乙醇濃度60%，料液比1:20，超聲溫度60 ℃，研究不同超聲時(shí)間對白眉草總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖4。 由結(jié)果可知，在一定范圍內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的增加白眉草總黃酮得率增大， 但當(dāng)超聲時(shí)間超過45 min 時(shí)，總黃酮得率反而下降。 這可能是時(shí)間過長，黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致總黃酮得率下降，確定超聲時(shí)間為45 min。

圖4 超聲時(shí)間對總黃酮得率的影響

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、料液比、超聲溫度為因素，每個(gè)因素選取3 個(gè)較優(yōu)水平，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，以總黃酮得率為指標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析結(jié)果見表2。 由極差分析可知，各因素主次順序?yàn)椋阂掖紳舛龋境暅囟龋玖弦罕龋?較優(yōu)提取工藝為A2B2C2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析

2.2.2 方差分析 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。 由結(jié)果可知A、B、C 對總黃酮提取率影響顯著（P＜0.05），影響白眉草總黃酮提取率的主次因素為A ＞C ＞B， 與直觀分析結(jié)果相同。 因此， 白眉草總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度70%，料液比1:20，超聲溫度60 ℃。

表3 正交試驗(yàn)方差分析

2.2.3 提取工藝的驗(yàn)證 為驗(yàn)證工藝的準(zhǔn)確性和合理性， 按上述最優(yōu)工藝進(jìn)行提取， 平行操作3批，分別測定吸光度值，計(jì)算總黃酮提取率。 結(jié)果顯示最優(yōu)工藝下， 白眉草總黃酮平均得率為3.96%，RSD 為1.64%，說明該提取工藝穩(wěn)定、可行。

2.3 白眉草黃酮提取物體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 抑菌活性 由表4 可知， 白眉草總黃酮提取物對大腸桿菌的抑菌圈直徑為8.70 mm， 對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為8.52 mm， 均大于氯霉素的抑菌圈直徑。試驗(yàn)結(jié)果表明，白眉草總黃酮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制活性。

表4 白眉草總黃酮提取物的抑菌活性

2.3.2 最低抑菌濃度的測定結(jié)果 由表5 可知，白眉草總黃酮提取物對大腸桿菌的最低抑菌濃度為12.5 g/L， 對金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度為25 g/L。試驗(yàn)結(jié)果表明，白眉草總黃酮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用，并且抑菌活性隨著白眉草總黃酮提取物濃度的增加而增強(qiáng)。

表5 最低抑菌濃度的結(jié)果g/L

2.3.3 最低殺菌濃度的測定結(jié)果 由表6 可知，白眉草總黃酮提取物對大腸桿菌的最低殺菌濃度為25 g/L， 對金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度為50 g/L。 試驗(yàn)結(jié)果表明，白眉草總黃酮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的殺菌作用，并且殺菌活性隨著白眉草總黃酮提取物濃度的增加而增強(qiáng)。

表6 最低殺菌濃度的結(jié)果g/L

3 結(jié)論

本文采用超聲波輔助法對白眉草總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化得到最佳工藝： 在超聲功率固定為240 W 的前提下，乙醇濃度為70%，料液比為1:20， 超聲溫度為60 ℃， 超聲時(shí)間為45 min。經(jīng)過3 批驗(yàn)證，在最佳工藝條件下，白眉草總黃酮的提取得率為3.96%，該提取工藝穩(wěn)定、可行。 同時(shí)還考察了白眉草總黃酮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用。結(jié)果表明，白眉草總黃酮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制作用， 對大腸桿菌的MIC 為12.5 g/L，MBC 為25 g/L； 對金黃色葡萄球菌的MIC 為25 g/L，MBC 為50 g/L。