朱向蕾 虞堅(jiān)頤 周立晨

（上海動(dòng)物園，上海200335）

鉤端螺旋體病(Leptospirosis)為致病性鉤端螺旋體引起的人畜共患傳染病，在世界范圍內(nèi)分布(Levett, 2001)，可感染鼠科、猴科和犬科等多種動(dòng)物(Desvarset al., 2012)。人或動(dòng)物通過(guò)接觸帶菌動(dòng)物的糞便、尿液污染的水和土壤而感染(婁銀瑩等，2019)，可造成黃疸、急性腎功能衰竭、出血性素質(zhì)和嚴(yán)重肺部疾病等，因血清型或地域不同，呈現(xiàn)不同的臨床表現(xiàn)(McBrideet al.,2005;Goldsteinet al.,2006)。

華南虎(Panthera tigris amoyensis)是國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，中國(guó)特有虎物種，僅249只圈養(yǎng)于各地動(dòng)物園(2020 年華南虎譜系)，種群保護(hù)與繁育工作迫在眉睫。目前已有貓感染鉤端螺旋體的報(bào)道(Arbouret al.,2012;Murilloet al.,2020)，動(dòng)物園作為流浪貓、嚙齒類動(dòng)物的常見(jiàn)地，具備形成鉤端螺旋體傳播途徑的條件，圈養(yǎng)華南虎也暴露于傳播鏈的風(fēng)險(xiǎn)之下。除人類外，絕大多數(shù)研究集中于寵物犬貓，關(guān)于大型貓科動(dòng)物如華南虎感染情況的研究較少，但鉤端螺旋體對(duì)華南虎造成的潛在威脅不容忽視，因此對(duì)于其感染情況的研究非常必要。

本文采集11家動(dòng)物園華南虎血液119份，通過(guò)分子生物學(xué)及血清學(xué)手段，開(kāi)展鉤端螺旋體的感染情況調(diào)查，旨在摸清動(dòng)物園圈養(yǎng)華南虎中鉤端螺旋體的感染情況及潛在危險(xiǎn)，為華南虎的疾病防控提供一定的基礎(chǔ)資料，以促進(jìn)其種群的保育工作。

1 研究方法

1.1 樣本采集

2018 年9 月至2019 年4 月，采集來(lái)源于上海、杭州、南京、南昌等11家動(dòng)物園的119只華南虎血液樣本，采集樣本數(shù)量占全國(guó)華南虎飼養(yǎng)種群的47.8%。將華南虎經(jīng)化學(xué)麻醉后靜脈采集血液，分別裝入含EDTA和促凝劑的血液儲(chǔ)存管中，3 000 r/min離心10 min，分離血清，全血及血清均?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 檢測(cè)方法

分別采用PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Eenzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 對(duì)119 份華南虎樣本進(jìn)行病原學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)。

1.2.1 PCR檢測(cè)

全血樣本按照鉤端螺旋體PCR檢測(cè)試劑盒(世紀(jì)元亨)要求進(jìn)行DNA提取，PCR反應(yīng)體系為20μL，其中PCR 反應(yīng)液16μL，Taq DNA 聚合酶2μL，模板DNA 2 μL， 反 應(yīng) 在PCR 儀(Jena Biometra TRIO) 上進(jìn)行，參考以下程序：94℃，3 min；94℃，30 s，60℃，30 s，72℃，30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，每個(gè)樣本上樣10 μL，凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 1600)觀察記錄檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2 ELISA檢測(cè)

檢測(cè)前將鉤端螺旋體通用型檢測(cè)試劑盒(荷蘭EVL)及待測(cè)樣本放置室溫平衡，陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照經(jīng)蒸餾水溶解后，用稀釋液進(jìn)行30 倍稀釋，樣本用稀釋液進(jìn)行150倍稀釋。將稀釋好的樣本和陰陽(yáng)性對(duì)照分別加100 μL 至反應(yīng)板上，均設(shè)置兩個(gè)平行對(duì)照，輕輕震蕩，封板膜封板，37℃溫箱中孵育60 min；將濃縮洗滌液進(jìn)行200 倍稀釋，每孔加入300μL進(jìn)行洗滌，共洗5次；每孔加HRPO單克隆抗體100μL，封板，37℃孵育60 min；按照上述要求每孔洗滌5 次，等量混勻緩沖液A 和B，每孔加入A液和B液的混合液100μL，室溫放置10~15 min；每孔加入50μL 終止液，10 min 內(nèi)在酶標(biāo)儀(邁瑞)上應(yīng)用450 nm進(jìn)行讀數(shù)，記錄OD值。陽(yáng)性對(duì)照平均值≥0.7，陰性對(duì)照平均值≤0.35，實(shí)驗(yàn)成立。結(jié)果參照試劑盒說(shuō)明書中的判定標(biāo)準(zhǔn)，用S/P 值(樣本與陽(yáng)性對(duì)照的比值)表示，S/P=(樣本平均OD 值?陰性對(duì)照平均OD 值)/(陽(yáng)性對(duì)照平均OD 值?陰性對(duì)照平均OD 值) ，樣本S/P 值≥0.33判為陽(yáng)性，S/P值<0.33則為陰性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(Chi-square Test) 對(duì)不同動(dòng)物園以及不同性別、年齡華南虎鉤端螺旋體的ELISA 檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中不同動(dòng)物園的數(shù)據(jù)應(yīng)用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，不同性別和年齡的抗體數(shù)據(jù)應(yīng)用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，對(duì)其在性別、年齡和不同動(dòng)物園之間感染的差異進(jìn)行比較。使用SPSS 23.0對(duì)抗體檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，顯著性水平設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

119 份華南虎血液樣本PCR 擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示均為陰性。

2.2 ELISA檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 不同動(dòng)物園華南虎血清樣本鉤端螺旋體抗體

11家動(dòng)物園的119份華南虎血清樣本鉤端螺旋體抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性樣本50 份，陽(yáng)性率為42.0%，其中蘇州動(dòng)物園鉤端螺旋體抗體陽(yáng)性率為72.7%，杭州野生動(dòng)物園61.5%，廣州動(dòng)物園陽(yáng)性率較低為11.1%，不同動(dòng)物園華南虎血清抗體差異顯著(Kruskal-Wallis,χ2=19.851,P=0.002)，鄭州及臨沂動(dòng)物園采樣量較少，不參與分析。不同動(dòng)物園鉤端螺旋體抗體陽(yáng)性率及S/P值見(jiàn)表1。

表1 不同動(dòng)物園華南虎血清樣本鉤端螺旋體抗體檢測(cè)結(jié)果Table 1 Seroprevalences of antibody to leptospirosis in South China Tiger from different zoos

2.2.2 不同年齡段和不同性別華南虎血清中鉤端螺旋體抗體

不同年齡段華南虎血清鉤端螺旋體抗體檢測(cè)結(jié)果，23份幼虎，陽(yáng)性6份，陽(yáng)性率為26.1%；96份成年虎，陽(yáng)性44 份，陽(yáng)性率為45.8%，成年及幼年華南虎對(duì)鉤端螺旋體的感染差異顯著(Mann-WhitneyU,χ2= 9.233,P= 0.006)。不同年齡華南虎鉤端螺旋體抗體陽(yáng)性率及S/P值見(jiàn)表2。

不同性別的華南虎血清鉤端螺旋體抗體檢測(cè)結(jié)果，58 份雄性，陽(yáng)性24 份，陽(yáng)性率為41.4%；61 份雌性，陽(yáng)性26 份，陽(yáng)性率為42.6%，雌、雄個(gè)體感染程度差異不顯著(Mann-WhitneyU,χ2=0.006,P=0.941)。不同性別華南虎鉤端螺旋體抗體陽(yáng)性率及S/P值見(jiàn)表2。

表2 不同年齡段和不同性別華南虎血清中鉤端螺旋體抗體檢測(cè)結(jié)果Table 2 Seroprevalences of antibody to leptospirosis in South China Tiger at different ages and genders

3 討論

鉤端螺旋體作為人畜共患傳染病，可感染家養(yǎng)犬貓、嚙齒類、流浪貓、圈養(yǎng)華南虎、人類等(Lapointeet al.,2013)，其中鼠類帶菌率可達(dá)5% ~7% (張振興和沈永林，2009)，排菌時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3 個(gè)月乃至終生，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)多種動(dòng)物能攜帶不同血清型的鉤端螺旋體，包括赤狐(Vulpes vulpes)、浣熊(Procyon lotor) 等，其宿主范圍廣泛(張振興和沈永林，2009)。華南虎作為我國(guó)特有珍稀物種，目前已野外滅絕。在遷地保護(hù)過(guò)程中，華南虎的活動(dòng)、繁殖和食物等都受到影響，與野生狀態(tài)差異較大，更易受疾病困擾。在鉤端螺旋體病的多發(fā)地區(qū)及季節(jié)，應(yīng)定期開(kāi)展監(jiān)測(cè)和調(diào)查，為華南虎種群的疾病防控工作提供科學(xué)依據(jù)。

本文對(duì)11家動(dòng)物園的119份華南虎血液樣本開(kāi)展鉤端螺旋體病原及血清抗體調(diào)查。結(jié)果未檢出鉤端螺旋體的病原核酸，這可能與華南虎的個(gè)體差異有關(guān)，有可能在一定時(shí)期內(nèi)華南虎感染鉤端螺旋體，并很快自愈，因此未檢測(cè)到病原，但這并不代表華南虎不是鉤端螺旋體的易感動(dòng)物，環(huán)境污染或者免疫力低下以及與帶菌動(dòng)物接觸等，仍存在感染和暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣本50 份，抗體陽(yáng)性率為42.02%，由于使用的試劑盒為通用型，未對(duì)血清型進(jìn)行分型，其致病型、致病力等情況還有待進(jìn)一步研究，但圈養(yǎng)華南虎種群中鉤端螺旋體感染普遍存在，還應(yīng)引起充分重視。

不同地區(qū)動(dòng)物園的華南虎感染鉤端螺旋體差異顯著(P<0.05)，與以往研究中貓感染鉤端螺旋體的情況相似(Mylonakiset al., 2005; Gamageet al.,2011)，可能是飼養(yǎng)條件以及飼養(yǎng)環(huán)境的差異。有報(bào)道稱鉤端螺旋體在溫、濕度較高的亞熱帶發(fā)病率較高(Gomardet al., 2019)，表明鉤端螺旋體可能更適應(yīng)溫暖濕潤(rùn)的環(huán)境。本研究中，成年和幼年華南虎均存在感染鉤端螺旋體的情況，且S/P差異顯著(P< 0.05)，成年華南虎抗體陽(yáng)性率更高，S/P 值也更高，推測(cè)成年虎的活動(dòng)范圍更大，進(jìn)食量和食物種類更多，更容易接觸到被鉤端螺旋體污染的環(huán)境、水或食物，且成年個(gè)體暴露于傳播鏈的時(shí)間更長(zhǎng)。不同性別華南虎感染鉤端螺旋體，S/P 值差異未達(dá)到顯著水平(P> 0.05)，說(shuō)明華南虎雌、雄個(gè)體對(duì)鉤端螺旋體易感性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

鉤端螺旋體病的防控關(guān)鍵在于切斷傳染源。環(huán)境、食物、水源以及其他易感動(dòng)物都可能成為傳染源，除了華南虎飼養(yǎng)管理中的日常清潔、病獸隔離和及時(shí)治療外，還應(yīng)對(duì)種群以及周邊易感犬貓動(dòng)物開(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查，及時(shí)掌握并切斷潛在傳播鏈與傳染源。此外，國(guó)內(nèi)動(dòng)物園針對(duì)犬科、貓科動(dòng)物多進(jìn)行犬二聯(lián)、貓三聯(lián)等疫苗的免疫預(yù)防，有條件的情況下可以增加鉤端螺旋體多價(jià)疫苗的免疫接種，以降低鉤端螺旋體在圈養(yǎng)野生動(dòng)物中的感染傳播。

致謝：本研究在采樣過(guò)程中得到南昌動(dòng)物園、杭州野生動(dòng)物園、蘇州動(dòng)物園、洛陽(yáng)動(dòng)物園、廣州動(dòng)物園、重慶動(dòng)物園、梅花山虎園、成都動(dòng)物園、鄭州動(dòng)物園和臨沂動(dòng)物園等的大力支持，在此表示感謝！