龐金月 李陜 劉園 楊生妹 武瑞勇* 魏萬紅,2*

(1 揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

(2 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州大學(xué)，揚(yáng)州 225009)

捕食風(fēng)險(xiǎn)是影響獵物生態(tài)和進(jìn)化的一種重要驅(qū)動(dòng)力(Langerhans, 2007; Pettorelliet al., 2011)，有效的反捕食行為對(duì)動(dòng)物的生存至關(guān)重要。動(dòng)物可以通過減少覓食時(shí)間、提高警覺水平和防御能力等來應(yīng)對(duì)捕食風(fēng)險(xiǎn)(Hunter and Skinner, 1998;Verdolin, 2006)，也可以通過改變棲息地的利用方式或遠(yuǎn)離捕食者來規(guī)避這種風(fēng)險(xiǎn)(McCauley and Rowe, 2010; Coteet al., 2013 )。在高捕食風(fēng)險(xiǎn)下，動(dòng)物的心理和生理功能也會(huì)發(fā)生改變，比如焦慮行為增加，應(yīng)激激素、心率和血壓升高等(Ada‐mecet al., 2004; Masiniet al., 2005; Campeauet al., 2008; Zoladzet al., 2008)，這些改變往往會(huì)引起動(dòng)物繁殖成功率和整體機(jī)能的降低(Boonstraet al.,1998;Lima,1998)。

捕食風(fēng)險(xiǎn)還可以觸發(fā)獵物“非遺傳母體效應(yīng)”的跨代傳遞，最終影響后代的表型和適合度。僧帽蚤(Daphnia cucullata) 的胚胎暴露于幽靈蚊(Chaoborus flavicans) 的化學(xué)信號(hào)后，子代產(chǎn)生更大的“頭盔”以增加防御能力(Agrawalet al.,1999)。雌性三刺魚(Gasterosteus aculeatus)暴露于捕食風(fēng)險(xiǎn)后，子代表現(xiàn)出集群行為增加(Giesinget al., 2011)。懷孕的胎生蜥蜴(Zootoca vivipara) 暴露于蛇的氣味后，子代尾巴顯著增長，體溫選擇性降低，活動(dòng)明顯增加(Bestionet al., 2014)。排卵前和排卵期的大山雀(Parus major) 暴露于雀鷹的模型和聲音后，雛鳥個(gè)體較小但翅膀生長速度較快，表現(xiàn)出能逃避捕食者的選擇性優(yōu)勢(shì)(Co‐slovsky and Richner,2011)。妊娠期C57BL/6小鼠暴露于捕食者氣味可以增加子代成年后對(duì)該氣味引起的應(yīng)激相關(guān)防御反應(yīng)的改變，比如逃避行為和血清皮質(zhì)酮(corticosterone, CORT) 水平增加(St-Cyr and McGowan,2015;St-Cyret al.,2017)。妊娠中期的根田鼠(Alexandromys limnophilus)暴露于艾鼬(Mustela eversmannii)抑制了子代的運(yùn)動(dòng)和探究行為，可能對(duì)子代的適合度以及種群波動(dòng)產(chǎn)生負(fù)向效應(yīng)(吳雁等， 2006)。妊娠期的布氏田鼠(La‐sipodomys brandtii) 暴露于貓(Felis catus) 的尿液，產(chǎn)生較多體重較輕的雌性后代，而雄性后代成年后增加探究和覓食行為，并且降低了應(yīng)激下的血漿CORT 水平(Guet al.,2018,2020)。這些產(chǎn)前母性效應(yīng)可能反映了一種反捕食防御的發(fā)育編程彈性機(jī)制(a flexible mechanism of developmental pro‐gramming)(Loveet al.,2013)。

動(dòng)物的青春期應(yīng)激作為一種環(huán)境因素，也具有跨代傳遞效應(yīng)(Grogeret al.,2016)。研究發(fā)現(xiàn)青春期的雌性大鼠暴露于慢性溫和應(yīng)激會(huì)影響F1 和F2代的焦慮樣行為和恐懼反應(yīng)(Shachar-Dadonet al.,2009;Zaidan and Gaisler-Salomon,2015)，并伴隨著CORT 水平以及前額葉皮質(zhì)中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotropin releasing factor,CRF)1 型受體mRNA 表達(dá)和靶向miRNA 的改變(Zaidanet al.,2013, 2021; Harkeret al., 2015; Bocket al., 2016)。青春期雌性SD 大鼠暴露于嗎啡，會(huì)引起后代隔離誘發(fā)的求救呼叫的減少(Bodiet al.,2016)。青春期大鼠經(jīng)歷社會(huì)隔離，其后代應(yīng)激軸(下丘腦―垂體―腎上腺軸, hypothalamic?pituitary?adrenal axis,HPA 軸)的基礎(chǔ)活動(dòng)水平增加、下丘腦CRF和垂體CRF1 型受體豐度降低、海馬糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)增加，成年的雄性后代也表現(xiàn)出中樞和血漿神經(jīng)活性類固醇3α, 5α-四氫孕酮的增加(Pisuet al.,2013)。這些研究表明，青春期應(yīng)激的影響不只局限于接受應(yīng)激的一代，也可能更廣泛地影響表觀基因組，從而影響F1 代甚至F2 代。但是，青春期暴露于捕食風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)激是否也具有跨代傳遞效應(yīng)，后代的反捕食行為和應(yīng)激激素水平如何改變尚無相關(guān)報(bào)道。

布氏田鼠是分布于我國內(nèi)蒙古草原和俄羅斯貝加爾湖東南部地區(qū)的一種典型草原嚙齒動(dòng)物。由于其啃食植物，具有挖倉儲(chǔ)草習(xí)性，嚴(yán)重破壞了草原植被和畜牧作物，被認(rèn)為是草原害鼠(Zhanget al., 2003)。布氏田鼠是狐貍(Vulpes)、艾鼬、兔猻(Otocolobus manul)、獵隼(Falco cher‐rug)、高地禿鷹(Buteo hemilasius)和草原鷹(Aqui‐la nipalensis) 等食肉動(dòng)物的重要食物來源(Samjaaet al., 2000)。研究發(fā)現(xiàn)青春期和成年期的布氏田鼠暴露于貓和黃鼬(Mustela sibirica) 的尿液和糞便時(shí)，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的恐懼和防御反應(yīng)(Hegabet al., 2014b)，并隨著暴露次數(shù)的增多而表現(xiàn)出適應(yīng)(Hegabet al., 2014a；彭延等，2021)，但是妊娠期重復(fù)暴露于貓尿影響布氏田鼠的繁殖產(chǎn)量、后代質(zhì)量和行為表型(Guet al., 2018, 2020)。產(chǎn)后重復(fù)暴露于貓尿，也會(huì)抑制雌性布氏田鼠的母性行為，并增加后代的運(yùn)動(dòng)能力(Wuet al.,2020)。最近的研究發(fā)現(xiàn)布氏田鼠在青春期時(shí)重復(fù)暴露于貓尿增加了同伴之間的親密行為，以及產(chǎn)后對(duì)其幼仔的育幼行為，并且這種經(jīng)歷影響后代性比和質(zhì)量(Wuet al.,2021)，那么這種經(jīng)歷是否會(huì)影響后代的反捕食行為尚不清楚。

本研究以青春期雌性布氏田鼠作為親代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在室內(nèi)條件下重復(fù)暴露于貓尿，來測定其子代在青春期和成年期對(duì)該氣味的響應(yīng)以及基礎(chǔ)的應(yīng)激激素水平。旨在探討母體青春期捕食風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)激的跨代傳遞效應(yīng)，為進(jìn)一步豐富捕食者與獵物之間的協(xié)同進(jìn)化理論和布氏田鼠的種群動(dòng)態(tài)監(jiān)測提供一定的參考。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為捕捉于內(nèi)蒙古錫林郭勒草原，在揚(yáng)州大學(xué)室內(nèi)繁殖的布氏田鼠。幼體在出生后與其雙親共同生活到產(chǎn)后21 d 時(shí)斷奶分籠，將其單個(gè)飼養(yǎng)在22 cm×15 cm×18 cm 的飼養(yǎng)籠中，以木屑作為墊料，供給充足的水和標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料(揚(yáng)州儀征動(dòng)物生物科技有限公司)。飼養(yǎng)房的光照周期為12 L∶12 D，室溫為22℃±3℃。所有實(shí)驗(yàn)過程均按照《中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南》進(jìn)行，并由揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審核。

1.2 氣味源的制備

布氏田鼠對(duì)貓的糞便和尿液表現(xiàn)出強(qiáng)烈的恐懼和防御反應(yīng)(Hegabet al., 2014b)，因此本研究以貓尿作為捕食者氣味源，以兔尿作為非捕食者氣味源，以蒸餾水作為對(duì)照氣味源。貓氣味源來自于從揚(yáng)州大學(xué)文匯路校區(qū)捕捉的1 只成年雄貓(Felis silvestris catus)，兔氣味源來自于從揚(yáng)州市農(nóng)貿(mào)市場購買的1 只成年雄兔(Oryctolagus cunicu‐lus)。為了避免氣味的干擾，分別將貓和兔飼養(yǎng)于不同的房間，飼養(yǎng)籠的大小為120 cm×40 cm×30 cm，每天分別給予足夠的貓糧、兔飼料和水，溫度和光照周期同布氏田鼠的飼養(yǎng)環(huán)境。尿液從放置在飼養(yǎng)籠下面的干凈托盤(放置48 h) 中收集，過濾掉糞便或皮毛，在使用前儲(chǔ)存在?20℃冰箱。在開始實(shí)驗(yàn)前，將尿液解凍并稀釋5倍，以確保有足夠的氣味來源。

1.3 實(shí)驗(yàn)處理

實(shí)驗(yàn)處理參照Wu 等(2021) 的方法進(jìn)行。選擇體重、發(fā)情期基本一致的28 日齡的青春期雌性布氏田鼠36 只作為親代，將其分為3 組，每組12只個(gè)體，分別暴露于貓尿(cat odor, CO)、兔尿(rabbit odor, RO) 和蒸餾水(distilled water, DW)氣味源，每只動(dòng)物每天暴露1 次，每次60 min，連續(xù)18 d (圖1)；所有的暴露過程都在08: 00—12: 00 進(jìn)行。具體過程如下：將28 日齡的親代雌性田鼠轉(zhuǎn)運(yùn)到氣味暴露房間的暴露箱(75 cm ×40 cm × 30 cm) 中，使其適應(yīng)暴露箱60 min 后，將動(dòng)物放回原飼養(yǎng)籠，連續(xù)適應(yīng)2 d。30 日齡時(shí)開始親代應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，將大約10 g 標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料和一個(gè)浸泡1 mL 稀釋尿液或蒸餾水的棉花球(直徑5 cm)放入暴露箱中，隨后放入實(shí)驗(yàn)鼠，時(shí)長60 min，連續(xù)18 d；每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用70%酒精溶液擦拭暴露箱以消除氣味干擾。親代應(yīng)激暴露結(jié)束后在飼養(yǎng)籠中正常飼養(yǎng)至90 日齡，選取陌生正常雄鼠進(jìn)行交配。子代在出生21 日齡時(shí)斷奶分窩，每只子代個(gè)體單獨(dú)飼養(yǎng)在22 cm × 15 cm × 18 cm的飼養(yǎng)籠中。從每組親代氣味源應(yīng)激的后代中，選擇大小基本相同的子代個(gè)體進(jìn)行行為和激素水平測定。分為兩批，其中一批在子代28 日齡時(shí)測定，另一批在子代90 日齡時(shí)測定，每批中每種處理的子代選擇24只，雌、雄各12只。

1.4 子代反捕食行為觀察

按照測試時(shí)應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)的順序，將每只子代暴露于3 種氣味源，其中暴露于蒸餾水作為行為反應(yīng)的基礎(chǔ)水平，兔氣味為非捕食者氣味反應(yīng)，貓氣味為反捕食響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)步驟在以上的基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改(圖1)。選取的青春期子代在28 日齡和29 日齡時(shí)單獨(dú)放在行為觀察箱中(同親代的氣味暴露箱)適應(yīng)，隨后在30 日齡時(shí)暴露于蒸餾水，33 日齡時(shí)暴露于兔尿氣味源，36 日齡時(shí)暴露于貓尿氣味源。每次暴露15 min 并用攝像機(jī)記錄行為，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用70%酒精溶液擦拭行為觀察箱。選取的成年期子代在90 日齡暴露于蒸餾水，93 日齡暴露于兔尿氣味源，96 日齡暴露于貓尿氣味源。使用Boris 軟件分析下列行為持續(xù)時(shí)間：隱藏，指田鼠頭部和身體完全躲在隱藏室中；嗅聞，指嗅聞氣味源；警戒性直立，指田鼠后腿站立，前肢抬起不需要任何東西支撐，四處張望；探頭，指田鼠的頭部和肩部探出隱藏室，身體的大部分仍藏在隱藏室；自飾，指田鼠用四肢梳理毛發(fā)；僵住，指除呼吸外完全靜止；其他行為。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖. 在時(shí)間軸上標(biāo)出了實(shí)驗(yàn)操作，數(shù)字代表出生后日齡；DW：母體青春期暴露于蒸餾水組；RO：母體青春期暴露于兔氣味組；CO：母體青春期暴露于貓氣味組Fig. 1 Schematic illustration of the experimental procedure. The experimental manipulations are labeled on the timeline,the numbers indicates the postnatal day. DW:distilled water group;RO:rabbit odor group;CO:cat odor group

1.5 Elisa檢測血清應(yīng)激激素水平

青春期和成年期的子代在行為測試完成后快速斷頭采血，并將血漿樣品儲(chǔ)存在?20℃冰箱。用田鼠特異性的酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay, Elisa) 試 劑 盒(JL21590 和JL21595，上海江萊生物科技有限公司)，按照說明檢測血漿中促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH) 和CORT 濃度。每個(gè)樣品的濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得，樣品重復(fù)2次，重復(fù)值之間的差異小于5%。

1.6 下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)表達(dá)水平的檢測

采集布氏田鼠血液后，快速取出腦并置于冷凍的培養(yǎng)皿上，冠狀切片后從1 mm 厚的切片中取出下丘腦組織。用添加蛋白酶抑制劑的RI‐PA 提取總蛋白，隨后用10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離變性的蛋白提取物，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。隨后用兔多克隆抗CRH (1∶1000, 10944-1-AP, Proteintech) 和抗β-actin (1∶5000, bs-0061R,北京博奧森生物技術(shù)有限公司) 的一抗孵育，4°C過夜。清洗后，膜用山羊抗兔IgG 二抗孵育(1∶5000, bs-0295G-HRP, 博奧森)。最后，使用增強(qiáng)的ECL 試劑盒和Tanon 5200 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶。用Image J 軟件進(jìn)行定量分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。首先用單樣本Kolmogorov?Smirnov 檢驗(yàn)所有數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，隨后使用雙因素方差分析(two?way ANOVA) 比較母體青春期處理對(duì)子代的行為、血漿應(yīng)激激素和下丘腦CRH 表達(dá)水平的影響及性別間的差異。如果方差分析有處理主效應(yīng)或交互作用，用Turkey HSD 進(jìn)行事后多重比較檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤(mean ± SE) 表示，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 子代青春期的行為反應(yīng)

雙因素方差分析表明，母體的青春期處理顯著影響其子代在青春期暴露于蒸餾水時(shí)的警戒性直立行為(F2,66= 3.244,P= 0.05)。與DW 組的子代相比，RO 組的子代在青春期暴露于蒸餾水時(shí)表現(xiàn)較多的警戒性直立行為(P=0.041，圖2)。子代在青春期暴露于蒸餾水時(shí)，雌性后代比雄性后代表現(xiàn)較多的隱藏(F1,66= 6.189,P= 0.017)、僵住(F1,66=17.605,P<0.001)和探頭(F1,66=5.504,P=0.024)行為，較少的自飾行為(F1,38=9.983,P=0.003)。

圖2 母體青春期不同氣味源處理的子代在青春期暴露于蒸餾水的行為反應(yīng). A：隱藏的持續(xù)時(shí)間；B：自飾的持續(xù)時(shí)間；C：僵住的持續(xù)時(shí)間；D：探頭的持續(xù)時(shí)間；E：嗅聞的持續(xù)時(shí)間；F：警戒性直立的持續(xù)時(shí)間. DW：母體青春期暴露于蒸餾水組；RO：母體青春期暴露于兔氣味組；CO：母體青春期暴露于貓氣味組. *P<0.05，不同處理組之間的差異. #P<0.05，##P<0.01，不同性別之間的差異Fig. 2 The behavioral performances to acute distilled water exposure in adolescent offspring whose mother exposed to different odor resources dur‐ing adolescence. A:duration of concealing;B:duration of self-grooming;C:duration of freezing;D:duration of head-out;E:duration of sniffing;F:duration of vigilant rearing. DW: distilled water group; RO: rabbit odor group; CO: cat odor group. *P < 0.05, significant difference among the three exposure groups. #P<0.05,##P<0.01,significant difference between males and females

母體青春期處理對(duì)子代在青春期暴露于兔氣味時(shí)的行為反應(yīng)沒有影響(圖3)，但是雄性子代比雌性子代表現(xiàn)較多的探頭(F1,66= 4.940,P=0.03) 和嗅聞(F1,66= 7.353,P= 0.009) 行為。

圖3 母體青春期不同氣味源處理的子代在青春期暴露于兔氣味的行為反應(yīng). A：隱藏的持續(xù)時(shí)間；B：自飾的持續(xù)時(shí)間；C：僵住的持續(xù)時(shí)間；D：探頭的持續(xù)時(shí)間；E：嗅聞的持續(xù)時(shí)間；F：警戒性直立的持續(xù)時(shí)間. DW：母體青春期暴露于蒸餾水組；RO：母體青春期暴露于兔氣味組；CO：母體青春期暴露于貓氣味組. #P<0.05，##P<0.01，不同性別之間的差異Fig. 3 The behavioral performances to acute rabbit odor exposure in adolescent offspring whose mother exposed to different odor resources during adolescence. A:duration of concealing;B:duration of self-grooming;C:duration of freezing;D:duration of head-out;E:duration of sniffing;F:du‐ration of vigilant rearing. DW:distilled water group;RO:rabbit odor group;CO:cat odor group. #P<0.05,##P<0.01,significant difference be‐tween males and females

母體青春期處理顯著影響子代在青春期暴露于貓氣味時(shí)的隱藏(F2,66= 9.661,P< 0.001)、自飾(F2,66= 16.742,P< 0.001)、探頭(F2,66=16.916,P< 0.001)、嗅聞(F2,66= 18.693,P<0.001) 和警戒性直立(F2,66= 6.279,P= 0.003)行為，隱藏(F1,66= 4.261,P= 0.043)、自飾(F1,66= 4.781,P= 0.032) 和僵住(F1,66= 11.313,P< 0.001) 行為表現(xiàn)出性別的差異， 探頭(F2,66= 3.502,P= 0.036) 和直立(F2,66= 4.943,P= 0.001) 行為受母體青春期處理與子代性別交互作用的影響。與DW 組(雄:P= 0.008; 雌:P= 0.003) 和RO 組(雄:P= 0.04; 雌:P= 0.042)的子代相比，CO 組的子代在青春期暴露于貓氣味時(shí)的隱藏行為顯著增多。此外，CO 組和RO組子代的自飾 (CO:P< 0.001; RO: 雄P=0.001)、探 頭(CO: 雄P= 0.023, 雌P< 0.001;RO: 雄P= 0.003, 雌P= 0.004) 和嗅聞行為(CO:P< 0.001; RO:P= 0.001) 顯著低于DW 組的子代。RO 組雌性子代的直立行為顯著低于DW 組的雌性子代(P= 0.001)，而探頭(雌P= 0.013)和嗅聞(P= 0.013) 行為顯著高于CO 組的子代(圖4)。

圖4 母體青春期不同氣味源處理的子代在青春期暴露于貓氣味的行為反應(yīng). A：隱藏的持續(xù)時(shí)間；B：自飾的持續(xù)時(shí)間；C：僵住的持續(xù)時(shí)間；D：探頭的持續(xù)時(shí)間；E：嗅聞的持續(xù)時(shí)間；F：警戒性直立的持續(xù)時(shí)間. DW：母體青春期暴露于蒸餾水組；RO：母體青春期暴露于兔氣味組；CO：母體青春期暴露于貓氣味組. *P<0.05，**P<0.01，不同處理組之間的差異.#P<0.05，不同性別之間的差異Fig. 4 The behavioral performances to acute cat odor exposure in adolescent offspring whose mother exposed to different odor resources during ad‐olescence. A:duration of concealing;B:duration of self-grooming;C:duration of freezing;D:duration of head-out;E:duration of sniffing;F:dura‐tion of vigilant rearing. DW:distilled water group;RO:rabbit odor group;CO:cat odor group. *P<0.05,**P<0.01,significant difference among the three exposure groups. #P<0.05,significant difference between males and females

2.2 子代成年期的行為反應(yīng)

雙因素方差分析表明，母體青春期處理對(duì)子代在成年后暴露于蒸餾水時(shí)的行為反應(yīng)沒有影響，但是成年雄性子代比雌性子代表現(xiàn)較多的警戒性直立行為(F1,66= 14.497,P< 0.001)(圖5)。

圖5 母體青春期不同氣味源處理的子代在成年后暴露于蒸餾水的行為反應(yīng). A：隱藏的持續(xù)時(shí)間；B：自飾的持續(xù)時(shí)間；C：僵住的持續(xù)時(shí)間；D：探頭的持續(xù)時(shí)間；E：嗅聞的持續(xù)時(shí)間；F：警戒性直立的持續(xù)時(shí)間. DW：母體青春期暴露于蒸餾水組；RO：母體青春期暴露于兔氣味組；CO：母體青春期暴露于貓氣味組. #P<0.05，不同性別之間的差異Fig. 5 The behavioral performances to acute distilled water exposure in adult offspring whose mother exposed to different odor resources during ado‐lescence. A:duration of concealing;B:duration of self-grooming;C:duration of freezing;D:duration of head-out;E:duration of sniffing;F:duration of vigilant rearing. DW:distilled water group;RO:rabbit odor group;CO:cat odor group. #P<0.05,significant difference between males and females

母體青春期處理只影響子代在成年后暴露于兔氣味時(shí)的探頭行為(F2,66=5.049,P=0.009)。與DW 組子代相比，CO 組的子代在成年暴露于兔氣味時(shí)表現(xiàn)較少的探頭行為(P=0.002,圖6)。此外，成年雌性子代比雄性子代表現(xiàn)出較多的嗅聞行為(F1,66=6.949,P=0.01)。

圖6 母體青春期不同氣味源處理的子代在成年后暴露于兔氣味的行為反應(yīng). A：隱藏的持續(xù)時(shí)間；B：自飾的持續(xù)時(shí)間；C：僵住的持續(xù)時(shí)間；D：探頭的持續(xù)時(shí)間；E：嗅聞的持續(xù)時(shí)間；F：警戒性直立的持續(xù)時(shí)間. DW：母體青春期暴露于蒸餾水組；RO：母體青春期暴露于兔氣味組；CO：母體青春期暴露于貓氣味組. **P<0.01，不同處理組之間的差異. #P<0.05，不同性別的差異Fig. 6 The behavioral performances to acute rabbit odor exposure in adult offspring whose mother exposed to different odor resources during ado‐lescence. A: duration of concealing; B: duration of self-grooming; C: duration of freezing; D: duration of head-out; E: duration of sniffing; F: dura‐tion of vigilant rearing. DW: distilled water group; RO: rabbit odor group; CO: cat odor group. **P < 0.01, significant difference among the three exposure groups. #P<0.05,significant difference between males and females

母體青春期處理顯著影響子代在成年后暴露于貓氣味時(shí)的警戒性直立行為(F2,66= 3. 533,P=0. 035)，子代性別影響隱藏(F1,66= 65. 634,P<0. 001)、自飾(F1,66= 5. 495,P= 0. 032) 和探頭(F1,66= 4. 467,P= 0. 038) 行為，而自飾行為也受母體青春期處理和子代性別交互作用的影響(F2,66=5. 965,P= 0. 004)。與DW 組(P= 0. 027) 和RO組(P=0. 021)子代相比，CO組的子代在成年后暴露于貓氣味時(shí)警戒性直立行為顯著增加，雄性子代的自飾行為也顯著降低(vs. DW:P= 0. 005;vs.RO:P= 0. 003)。在暴露于貓氣味時(shí)，成年雌性子代的隱藏行為顯著高于雄性，而探頭行為顯著低于雄性。在CO組的成年子代中，雌性暴露于貓氣味時(shí)的自飾行為顯著高于雄性(P<0. 001)(圖7)。

圖7 母體青春期不同氣味源處理的子代在成年后暴露于貓氣味的行為反應(yīng). A：隱藏的持續(xù)時(shí)間；B：自飾的持續(xù)時(shí)間；C：僵住的持續(xù)時(shí)間；D：探頭的持續(xù)時(shí)間；E：嗅聞的持續(xù)時(shí)間；F：警戒性直立的持續(xù)時(shí)間.DW：母體青春期暴露于蒸餾水組；RO：母體青春期暴露于兔氣味組；CO：母體青春期暴露于貓氣味組. *P<0.05，**P<0.01，不同處理組之間的差異. #P<0.05，##P<0.01，不同性別的差異Fig. 7 The behavioral performances to acute cat odor exposure in adult offspring whose mother exposed to different odor resources during adoles‐cence. A: duration of concealing; B: duration of self-grooming; C: duration of freezing; D: duration of head-out; E: duration of sniffing; F: duration of vigilant rearing. DW:distilled water group;RO:rabbit odor group;CO:cat odor group. *P<0.05,**P<0.01,significant difference among the three exposure groups. #P<0.05,##P<0.01,significant difference between males and females

2.3 子代HPA軸的基礎(chǔ)活動(dòng)水平

Elisa 和Western Blot 的檢測結(jié)果表明，母體青春期處理顯著影響子代在青春期時(shí)的血漿ACTH (F2,66= 3.346,P= 0.041) 和 CORT(F2,66= 7.859,P= 0.001) 水平，而對(duì)下丘腦CRH 的表達(dá)沒有影響。CO 組的子代在青春期時(shí)(雌:P= 0.013; 雄:P= 0.037)，血漿中CORT的濃度顯著高于DW 組的子代；RO 組的子代在青春期時(shí)只有雄性的血漿ACTH (P= 0.052) 和CORT (P= 0.042) 濃度顯著高于DW 組的雄性子代(圖8A ~ C)。子代在青春期時(shí)的血漿ACTH (F1,66= 32.555,P< 0.001) 和 CORT(F1,66= 20.651,P< 0.001) 水平也受性別的影響，雌性比雄性具有較高的血漿ACTH (DW 組,P< 0.001; RO 組,P= 0.008; CO 組,P= 0.016 )和CORT (DW 組,P< 0.001; CO 組,P= 0.002)濃度。

母體青春期處理也顯著影響子代在成年后的血漿ACTH (F2,66= 7.752,P= 0.001) 和CORT(F2,66= 3.399,P= 0.039) 水平，而對(duì)下丘腦CRH表達(dá)沒有影響。Elisa的檢測結(jié)果表明RO組的子代在成年后血漿ACTH的濃度顯著高于DW組的成年子代(P=0.001)，而CORT 濃度低于CO 組的成年子代(P=0.03)(圖8D~F)。

圖8 母體青春期不同氣味源處理的子代在青春期和成年后的血漿ACTH 和CORT 濃度，以及下丘腦CRH 的表達(dá)水平. A：子代在青春期時(shí)的血漿CORT 濃度；B：子代在青春期時(shí)的血漿ACTH 濃度；C：子代在青春期時(shí)的下丘腦CRH 相對(duì)表達(dá)量；D：子代在成年后的血漿CORT 濃度；E：子代在成年后的血漿ACTH 濃度；F：子代在成年后的下丘腦CRH 相對(duì)表達(dá)量. * P< 0.05，不同處理組之間的差異.#P<0.05，不同性別之間的差異Fig. 8 The concentration of plasma ACTH and CORT, as well as hypothalamic CRH expression in offspring during adolescence and after adult‐hood,respectively. A:plasma CORT concentration in offspring during adolescence;B:plasma ACTH concentration in offspring during adolescence;C:relative expression of hypothalamic CRH in offspring during adolescence;D:plasma CORT concentration in offspring after adulthood;E:plasma ACTH concentration in offspring after adulthood; F: relative expression of hypothalamic CRH in offspring after adulthood. *P < 0.05, significant difference among the three exposure groups. #P<0.05,significant difference between males and females

3 討論

為了證實(shí)母體青春期捕食風(fēng)險(xiǎn)的“跨代傳遞”效應(yīng)，本研究檢測了青春期的雌性布氏田鼠在重復(fù)暴露于貓氣味后，其子代在青春期和成年期的反捕食響應(yīng)和應(yīng)激激素水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)母體青春期的捕食風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)激可能影響后代的防御策略，子代在青春期暴露于相同的捕食風(fēng)險(xiǎn)氣味源時(shí)采用隱藏的消極回避策略，而子代在成年后采用警戒性直立的主動(dòng)防御策略。這些可能與應(yīng)激激素的基礎(chǔ)水平相關(guān)，因?yàn)楸狙芯窟€發(fā)現(xiàn)子代在青春期時(shí)的血漿皮質(zhì)酮水平升高，而成年時(shí)沒有變化。這些結(jié)果表明母體青春期暴露于捕食風(fēng)險(xiǎn)可以促進(jìn)后代反捕食行為的表達(dá)，表現(xiàn)出“跨代傳遞”效應(yīng)，后代的不同發(fā)育階段通過采用不同的反捕食策略，提高其在被捕食風(fēng)險(xiǎn)下的適應(yīng)性生存能力。

本研究中，母體青春期重復(fù)暴露于貓氣味的子代在青春期時(shí)遭遇同樣的捕食風(fēng)險(xiǎn)氣味源時(shí)隱藏行為增多，嗅聞和探頭行為減少。通常情況下，獵物會(huì)尋找安全的位置減少遭遇捕食者或被捕食者攻擊的風(fēng)險(xiǎn)(Sievertet al.,2020)。本研究隱藏箱與自然狀態(tài)下的洞道相似，代表了這一安全的位置，因此隱藏行為是主要的行為反應(yīng)，約占70%。隱藏行為增多，說明母體青春期暴露于貓氣味的子代在青春期時(shí)對(duì)捕食者氣味更為敏感，采用隱匿的策略來提高存活的可能。探頭行為指嚙齒動(dòng)物將頭從洞道里探出來收集周圍環(huán)境信息的行為，一般被認(rèn)為是一種風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估行為(Dielenberget al.,2001;Hegabet al.,2014b)。正常的邏輯是，獵物在嗅聞到捕食者氣味后會(huì)撤退到安全位置，然后探頭進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。隱藏行為的增多，嗅聞和探頭行為的減少則說明這些子代在青春期時(shí)主要采用消極回避的防御策略來提高個(gè)體適合度。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)子代在青春期暴露于貓尿時(shí)的自飾行為減少。自飾行為是一種復(fù)雜的本能行為，在應(yīng)對(duì)應(yīng)激的行為適應(yīng)中起重要作用。研究表明焦慮模型的嚙齒動(dòng)物表現(xiàn)出自飾行為減少，互飾行為增多(Kalueffet al., 2016)，自飾行為的減少可能反映了較高的焦慮水平(Spruijtet al., 1992; Wuet al., 2013)。因此我們推測子代在青春期暴露于貓尿時(shí)，應(yīng)激水平增加，表現(xiàn)出較高的焦慮，伴隨著自飾行為的降低。本研究中母體青春期重復(fù)暴露于貓氣味的子代在青春期時(shí)的血漿CORT水平明顯高于對(duì)照組子代，支持這一推測，說明這些子代在青春期時(shí)的應(yīng)激水平較高。

警戒性直立是鼠類用后腿站立，并環(huán)視周圍環(huán)境發(fā)現(xiàn)潛在威脅的行為。這也是一種典型的防御反應(yīng)，旨在幫助獵物收集較遠(yuǎn)的威脅源信息，與探頭行為類似，也是一種風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估行為(Dielen‐berget al., 2001; Bowenet al., 2012)。本研究發(fā)現(xiàn)母體青春期暴露于貓氣味的子代在成年后暴露于兔氣味時(shí)探頭行為減少，而暴露于貓氣味時(shí)探頭行為沒有改變，但警戒性直立行為增加，說明這些子代在成年后可能對(duì)捕食風(fēng)險(xiǎn)更為敏感。探頭和警戒性直立行為的目的都是為了收集周圍環(huán)境信息，當(dāng)需要收集較遠(yuǎn)的環(huán)境信息時(shí)，與捕食者沒有直接身體接觸的情況下，警戒性直立行為可能會(huì)比探頭行為更為頻繁。有學(xué)者認(rèn)為警戒性直立行為的增加和探究行為的減少是對(duì)危險(xiǎn)產(chǎn)生的一種長期適應(yīng)性的改變(Fendt and Fanselow, 1999;Dielenberget al., 2001; Misslin, 2003; Kindermannet al., 2009)。因此我們推測母體青春期暴露于捕食風(fēng)險(xiǎn)會(huì)促進(jìn)子代在成年后對(duì)這種風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)激的適應(yīng)。與對(duì)照組子代相比，母體青春期暴露于貓氣味的子代在成年后CORT水平?jīng)]有明顯變化，也證實(shí)了這種適應(yīng)性。在這種情況下，獵物往往選擇主動(dòng)的防御策略，比如提高警戒水平。

母體青春期暴露于捕食風(fēng)險(xiǎn)后，子代在青春期時(shí)采用消極回避的防御策略，而在成年后采用警戒性的主動(dòng)防御策略，這些結(jié)果都證明母體青春期的這種捕食風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)歷提高了后代的反捕食行為水平，從而可能提高個(gè)體適合度。很多研究已經(jīng)證實(shí)了捕食風(fēng)險(xiǎn)在孕期和產(chǎn)后的“跨代母體傳遞效應(yīng)”，比如大山雀翅膀長度的增加(Coslovsky and Richner, 2011)，三刺魚更緊密的集群行為(Giesinget al., 2011) 和蟋蟀靜止時(shí)間的增加(Storm and Lima,2010)，都支持本研究結(jié)果。這些研究說明，母體在任何階段遭遇應(yīng)激都可能對(duì)后代產(chǎn)生持久的影響。母體效應(yīng)引起子代表型的變化，可能是母體對(duì)子代出生后頻繁遭遇的生態(tài)應(yīng)激源的一種預(yù)防和準(zhǔn)備，當(dāng)母體環(huán)境與子代環(huán)境相匹配時(shí)，可以提高子代對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性(Monaghanet al.,2009)。

綜上所述，本研究證實(shí)母體青春期捕食風(fēng)險(xiǎn)的“跨代傳遞”效應(yīng)，這種經(jīng)歷以階段性的效應(yīng)提高后代的反捕食防御水平，子代青春期傾向于被動(dòng)防御，成年后采用主動(dòng)防御，這可能與基礎(chǔ)的應(yīng)激激素水平相關(guān)。表明母體青春期的經(jīng)歷對(duì)于后代行為和生理表型的重塑也非常重要，對(duì)于理解不同階段的“母體跨代傳遞”效應(yīng)對(duì)后代行為表型的影響具有重要意義。