邢靜如，石海英，王燕碧，趙采芹，唐 宏，段志強(qiáng)

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

0 引言

【研究意義】酸性亮氨酸磷酸核蛋白（Acidic leucine nuclear phosphoprotein 32，ANP32）是一類(lèi)進(jìn)化高度保守的酸性核磷蛋白家族，其成員包括ANP32A、ANP32B和ANP32E，一般含有220～290個(gè)氨基酸，分子量約32 kD。ANP32家族蛋白成員間具有相似的結(jié)構(gòu)特征，N端為富含亮氨酸的重復(fù)區(qū)域（Leucine-rich repeats，LRR），以LRR串聯(lián)陣列的形式存在，為蛋白的相互作用提供了框架；C端為低復(fù)雜性的酸性區(qū)域（Low complexity acidic region，LCAR），約由100個(gè)氨基酸組成，其中天冬氨酸和谷氨酸占60%～75%，由于LCAR結(jié)構(gòu)缺乏疏水性氨基酸而影響三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，致使該結(jié)構(gòu)是以游離的形式存在，從而具有與帶正電荷蛋白發(fā)生相互作用的能力（Matilla and Radrizzani，2005；de Chiara et al.，2008；Reilly et al.，2014）。ANP32家族蛋白具有多種生物學(xué)功能，如抑制蛋白磷酸化（Habrukowich et al.，2010）、染色體修飾和重構(gòu)（Tochio et al.，2010；Obri et al.，2014）、細(xì)胞凋亡調(diào)控（Shen et al.，2010）和病毒復(fù)制（Long et al.，2016），以及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)（Fries et al.，2007）等。因此，開(kāi)展雞ANP32家族蛋白亞細(xì)胞定位及其在免疫器官中的表達(dá)特征分析，可為后續(xù)探討雞ANP32家族蛋白在相關(guān)病毒復(fù)制中的作用機(jī)理提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ANP32A基因于1994年首次被克?。╒aesen et al.，1994），隨后研究人員基于氨基酸序列相似性、進(jìn)化保守性和結(jié)構(gòu)相似性定義了ANP32家族其他蛋白成員（Matilla and Radrizzani，2005）。ANP32家族蛋白具有磷酸酶活性，其中ANP32A能有效抑制蛋白磷酸酶2A（Protein phosphatase 2A，PP2A）（Li et al.，1996），可與鞘氨醇相互作用以調(diào)節(jié)人類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞中的PP2A活性及環(huán)氧合酶-2（COX-2）表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和炎癥反應(yīng)（Habrukowich et al.，2010）。此外，ANP32A能與突變的人類(lèi)共濟(jì)失調(diào)蛋白1（Ataxin-1）結(jié)合而調(diào)節(jié)PP2A活性（Sánchez et al.，2013），ANP32E也可抑制PP2A活性（Costanzo et al.，2006），但ANP32B不具備此功能（Sun et al.，2006）。ANP32家族具有調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并影響轉(zhuǎn)錄過(guò)程的功能，其中，ANP32A主要通過(guò)電荷作用與組蛋白H3的N末端結(jié)合而影響組蛋白H3修飾，進(jìn)而抑制其乙?；^(guò)程（Schneider et al.，2004）；ANP32B與Krüppel樣因子5（Krüppel-like factor 5，KLF5）直接相互作用，且被KLF5招募至啟動(dòng)子區(qū)域，阻止組蛋白乙酰化，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程（Munemasa et al.，2008）；ANP32E能解離由DNA和組蛋白變體H2A.Z（Histone variant H2A.Z，H2A.Z）形成的非核小體聚集體，因此H2A.Z蛋白可結(jié)合在特定的DNA轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過(guò)程（Mao et al.，2014）。ANP32家族蛋白還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，ANP32A和ANP32B作為mRNA結(jié)合蛋白HuR與核輸出受體CRM1間的銜接成分，調(diào)節(jié)富含腺苷酸元素的mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)（Brennan et al.，2000）。ANP32家族蛋白在病毒的復(fù)制中也發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，ANP32A和ANP32B蛋白是A型流感病毒（Influenza A virus，IAV）復(fù)制及其聚合酶活性的決定性宿主因子，ANP32E蛋白不能支持IAV復(fù)制，但解析了IAV跨物種傳播的分子機(jī)制（Zhang et al.，2019，2020）；ANP32家族蛋白也是B型流感病毒（Influenza B virus，IBV）聚合酶活性的關(guān)鍵性宿主蛋白，哺乳動(dòng)物的ANP32A和ANP32B蛋白可單獨(dú)支持IBV復(fù)制，而ANP32E蛋白只起到一定的支持作用，揭示了禽類(lèi)ANP32家族蛋白無(wú)法有效支持IBV聚合酶活性的分子機(jī)制（Zhang et al.，2020）。此外，有研究發(fā)現(xiàn)ANP32A和ANP32B蛋白對(duì)人類(lèi)艾滋病病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）的復(fù)制起關(guān)鍵作用，且ANP32A、ANP32B蛋白分別與CRM1和Rev發(fā)生相互作用而介導(dǎo)HIV未完全剪切RNA的核輸出（Wang et al.，2019）。【本研究切入點(diǎn)】目前，有關(guān)ANP32家族蛋白的生物學(xué)功能研究主要集中在人類(lèi)和小鼠上，針對(duì)其他物種的研究相對(duì)較少。雞ANP32B蛋白能與新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）M蛋白發(fā)生相互作用，并促進(jìn)M蛋白在細(xì)胞核的聚集（Günther et al.，2020），但雞ANP32家族蛋白的亞細(xì)胞定位、在免疫器官（脾臟、胸腺和法氏囊）中的表達(dá)特征及調(diào)控NDV復(fù)制的作用機(jī)制尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】根據(jù)GenBank已公布的雞ANP32家族蛋白基因序列構(gòu)建其重組真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后進(jìn)行融合蛋白表達(dá)和亞細(xì)胞定位分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)分析ANP32家族蛋白基因在不同月齡雞免疫器官中的表達(dá)特征，為后續(xù)研究雞ANP32家族蛋白與NDV復(fù)制及其致病性的關(guān)系打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

貴州瑤山雞來(lái)自貴州大學(xué)種雞場(chǎng)，在相同條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，隨機(jī)選取1～6月齡的雞各3羽，分別采集其免疫器官（脾臟、胸腺和法氏囊）置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。真核表達(dá)載體pEGFP-C1、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞（DF-1）、人胚胎腎細(xì)胞（HEK-293T）由貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供；2×EsTaqMasterMix（Dye）、抗GFP標(biāo)簽鼠單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG（H+L）和HRP購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；Total RNA Kit II R6934試劑盒、Gel Extraction Kit試劑盒及Endo-free Plasmid Mini Kit II試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶（XhoI、KpnI、EcoR I和BamH I）和TurboFect Transfection Reagent 購(gòu)自Thermo Fisher公司；RIPA細(xì)胞裂解液（弱）和增強(qiáng)型ECL顯色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；StarScript II反轉(zhuǎn)錄試劑和5×SDS-PAGE上樣緩沖液購(gòu)自GenStar公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix購(gòu)自APExBIO公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank已公布的雞ANP32A基因序列（XM_040680256.1）、ANP32B基因序列（NM_0010 30934.1）、ANP32E基因序列（NM_001006564.2），使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增雞ANP32A、ANP32B和ANP32E基因編碼區(qū)（CDS）的PCR擴(kuò)增引物及檢測(cè)其表達(dá)水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物，以β-actin為內(nèi)參基因。所有引物（表1）均委托重慶擎科興業(yè)生物科技有限公司合成。

表1 PCR擴(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物信息Table 1 The primer information of PCR amplification and real-time fluorescence quantitative PCR

1.3 雞ANP32家族基因重組真核表達(dá)載體構(gòu)建

提取DF-1細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，采用特異性引物分別擴(kuò)增雞ANP32家族基因CDS序列。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×EsTaqMasterMix（Dye）10.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，然后將其與真核表達(dá)載體pEGFP-C1分別進(jìn)行雙酶切，再次膠回收后進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定，然后提取陽(yáng)性菌液質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并將鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒送至重慶擎科興業(yè)生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 融合蛋白表達(dá)檢測(cè)

將HEK-293T細(xì)胞接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入15%胎牛血清培養(yǎng)基，控制細(xì)胞初始接種密度為50%，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～90%時(shí)以TurboFect Transfection Reagent將重組真核表達(dá)載體和空載體pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染36 h后，采用RIPA細(xì)胞裂解液（弱）進(jìn)行裂解，4 ℃離心收集上清液，加入適量上樣緩沖液煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。使用5%脫脂乳于37 ℃下將PVDF膜封閉2 h，加入1∶1500稀釋的抗GFP標(biāo)簽鼠單克隆抗體4 ℃孵育16 h；TBST洗3次，再加入1∶2000稀釋的山羊抗小鼠IgG（H+L）37 ℃孵育2 h；TBST洗3次，使用增強(qiáng)型ECL顯色劑進(jìn)行顯色。

1.5 融合蛋白亞細(xì)胞定位分析

按照1.4的方法，將重組真核表達(dá)載體和空載體pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36 h后以PBS洗滌3次，加入預(yù)冷的4%多聚甲醛固定20 min；PBS洗滌3次，加入0.25%TritonX-100室溫作用5 min；PBS洗滌3次，再加入DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色；PBS洗滌3次，將細(xì)胞置于正置熒光顯微鏡下采集熒光照片。熒光照片采用Photoshop進(jìn)行Merge處理，根據(jù)融合蛋白熒光與細(xì)胞核熒光的重疊情況，判斷融合蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)雞ANP32家族基因表達(dá)情況

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ANP32家族基因在1、2、3、4、5和6月齡雞免疫器官中的表達(dá)情況，以β-actin為內(nèi)參基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μL：cDNA模板1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×SYBR Green qPCR Master Mix 10.0 μL，ROX染料0.4 μL，ddH2O 7.6 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃15 s，退火40 s，72 ℃30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。熔解曲線(xiàn)程序?yàn)閮x器默認(rèn)設(shè)置，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行處理，以6月齡脾臟為對(duì)照，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算雞ANP32家族基因相對(duì)表達(dá)量，并以SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析（Oneway ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞ANP32家族基因重組真核表達(dá)載體鑒定結(jié)果

以DF-1細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用特異性引物擴(kuò)增雞ANP32家族基因CDS序列，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示擴(kuò)增獲得的目的基因片段大?。▓D1）與預(yù)期結(jié)果相符。對(duì)構(gòu)建的重組真核表達(dá)載體進(jìn)行單酶切和雙酶切鑒定，結(jié)果表明，重組真核表達(dá)載體pEGFP-C1-ANP32A、pEGFP-C1-ANP32B和pEGFP-C1-ANP32E經(jīng)單酶切后均得到約5500 bp的載體條帶，而經(jīng)雙酶切后獲得4700 bp的載體條帶及與預(yù)期結(jié)果相符的目的基因條帶（圖2）。測(cè)序結(jié)果表明，雞ANP32A、ANP32B和ANP32E基因均正確插入到真核表達(dá)載體pEGFP-C1的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，且未發(fā)生基因突變和開(kāi)放閱讀框移碼，即重組真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 雞ANP32家族基因CDS序列PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.1 PCR amplification electrophoresis of chicken ANP32 family gene CDS sequence

圖2 雞ANP32家族基因重組真核表達(dá)載體酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Enzyme digestion identification of recombinant eukaryotic expression vector of chicken ANP32 family gene

2.2 雞ANP32家族基因融合蛋白表達(dá)分析結(jié)果

為檢測(cè)構(gòu)建的雞ANP32家族基因重組真核表達(dá)載體在細(xì)胞中是否正確表達(dá)，將空載體pEGFP-C1和重組真核表達(dá)載體（pEGFP-C1-ANP32A、pEGFP-C1-ANP32B和pEGFP-C1-ANP32E）分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞并進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。結(jié)果顯示：在細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)的標(biāo)簽蛋白EGFP及融合蛋白EGFPANP32A、EGFP-ANP32B和EGFP-ANP32E，經(jīng)Western blotting檢測(cè)均得到與預(yù)期結(jié)果相符的蛋白條帶（圖3），從左到右蛋白大小依次為28.0、60.0、57.9和56.9 kD，對(duì)應(yīng)的融合蛋白ANP32A、ANP32B、ANP32E分子量分別為32.0、29.9和28.9 kD。說(shuō)明雞ANP32家族基因融合蛋白在HEK-293T細(xì)胞中正確表達(dá)。

圖3 雞ANP32家族基因融合蛋白Western blotting檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Western blotting results of chicken ANP32 family gene fusion proteins1：標(biāo)簽蛋白EGFP；2：融合蛋白EGFP-ANP32A；3：融合蛋白EGFPANP32B；4：融合蛋白EGFP-ANP32E1：Tag protein EGFP；2：Fusion protein EGFP-ANP32A；3：Fusion protein EGFP-ANP32B；4：Fusion protein EGFP-ANP32E

2.3 雞ANP32家族基因融合蛋白亞細(xì)胞定位分析結(jié)果

為確定雞ANP32家族基因融合蛋白亞細(xì)胞定位情況，將空載體pEGFP-C1和重組真核表達(dá)載體（pEGFP-C1-ANP32A、pEGFP-C1-ANP32B和pEGFP-C1-ANP32E）分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞固定、破膜及細(xì)胞核染色后進(jìn)行熒光觀察。結(jié)果（圖4）顯示：標(biāo)簽蛋白EGFP呈綠色，其細(xì)胞核呈藍(lán)色，二者的熒光不完全重合，因此標(biāo)簽蛋白EGFP定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)；而融合蛋白EGFPANP32A、EGFP-ANP32B和EGFP-ANP32E的熒光與細(xì)胞核熒光完全重合，即主要定位在細(xì)胞核。

圖4 雞ANP32家族基因融合蛋白亞細(xì)胞定位分析結(jié)果（100×）Fig.4 Subcellular localization analysis of fusion proteins of chicken ANP32 family genes（100×）

2.4 ANP32家族基因在不同月齡雞免疫器官中的表達(dá)特征

2.4.1ANP32A基因在不同月齡雞免疫器官中的表達(dá)特征 如圖5所示，ANP32A基因在1～6月齡雞免疫器官中均有表達(dá)，且在不同免疫器官中的表達(dá)水平存在差異。ANP32A基因在不同月齡雞脾臟、胸腺和法氏囊中的相對(duì)表達(dá)量整體上均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，且以2月齡雞免疫器官中的相對(duì)表達(dá)量最高。其中，2月齡雞脾臟中的ANP32A基因相對(duì)表達(dá)量比3月齡極顯著提高1.6倍（P＜0.01，下同），比4～6月齡極顯著提高6.9～10.9 倍；2 月齡雞胸腺中的ANP32A基因相對(duì)表達(dá)量比1月齡極顯著提高1.6倍，比3月齡極顯著提高2.6倍，比4～6月齡極顯著提高8.3～18.8倍；2月齡雞法氏囊中的ANP32A基因相對(duì)表達(dá)量比1月齡極顯著提高3.4倍，比3～6月齡極顯著提高5.3～14.5倍。

圖5 ANP32A基因在1～6月齡雞免疫器官中的表達(dá)特征Fig.5 Expression analysis of ANP32A gene in immune organs of 1-to 6-month-old chicken

2.4.2ANP32B基因在不同月齡雞免疫器官中的表達(dá)特征 如圖6所示，ANP32B基因在1～6月齡雞免疫器官中均有表達(dá)，且在不同免疫器官中的表達(dá)水平存在差異。ANP32B基因在不同月齡雞脾臟、胸腺和法氏囊中的相對(duì)表達(dá)量整體上呈逐漸下降的變化趨勢(shì)。其中，1月齡雞脾臟中的ANP32B基因相對(duì)表達(dá)量比2月齡極顯著提高1.7倍，比3～4月齡極顯著提高3.5～3.6倍，比5～6月齡極顯著提高14.4～16.8倍；1月齡雞胸腺中的ANP32B基因相對(duì)表達(dá)量比3月齡極顯著提高2.2倍，比4～6月齡極顯著提高4.9～31.3倍；1月齡雞法氏囊中的ANP32B基因相對(duì)表達(dá)量比2月齡極顯著提高2.8倍，比3～6月齡極顯著提高9.4～20.1倍。

圖6 雞ANP32B基因在1～6月齡免疫器官中的表達(dá)特征Fig.6 Expression analysis of ANP32B gene in immune organs of 1-to 6-month-old chicken

2.4.3ANP32E基因在雞不同月齡免疫器官中的表達(dá)特征 如圖7所示，ANP32E基因在1～6月齡雞免疫器官中也均有表達(dá)，且在不同免疫器官中的表達(dá)水平存在差異。ANP32E基因在不同月齡雞脾臟和法氏囊中的相對(duì)表達(dá)量整體上呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，均以2月齡雞免疫器官中的相對(duì)表達(dá)量最高，而在不同月齡雞胸腺中的相對(duì)表達(dá)量整體上呈逐漸下降趨勢(shì)。其中，2月齡雞脾臟中的ANP32E基因相對(duì)表達(dá)量比4月齡極顯著提高3.4倍，比1月齡和3月齡極顯著提高5.4和5.6倍，比5～6月齡極顯著提高54.7～61.9倍；1月齡雞胸腺中的ANP32E基因相對(duì)表達(dá)量比2～4月齡極顯著提高2.3～4.8倍，比5～6月齡極顯著提高28.8～31.7倍；2月齡雞法氏囊中的ANP32E基因相對(duì)表達(dá)量比1月齡極顯著提高1.7倍，比3～6月齡極顯著提高21.2～132.4倍。

圖7 雞ANP32E基因在1～6月齡免疫器官中的表達(dá)特征Fig.7 Expression analysis of ANP32E gene in immune organs of 1-to 6-month-old chicken

3 討論

ANP32家族蛋白成員共有5個(gè)，分別是ANP32A、ANP32B、ANP32C、ANP32D和ANP32E，由于ANP32C和ANP32D是由內(nèi)含子編碼通常被認(rèn)為是假基因，因此對(duì)該家族蛋白的研究主要集中在ANP32A、ANP32B和ANP32E（Matilla and Radrizzani，2005）。ANP32家族蛋白成員間具有相似的結(jié)構(gòu)特征，其C端第246～260位氨基酸間包含特定的核定位信號(hào)KRKR，介導(dǎo)其完成入核轉(zhuǎn)運(yùn)（Matsubae et al.，2000）；而N端的LCAR結(jié)構(gòu)與核輸出蛋白CRM1相互作用，介導(dǎo)其完成出核轉(zhuǎn)運(yùn)，即ANP32家族蛋白是一種細(xì)胞核—細(xì)胞質(zhì)穿梭蛋白。在ANP32家族蛋白核質(zhì)穿梭功能研究方面，Opal等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，ANP32A在神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)且其細(xì)胞定位與神經(jīng)元分化存在一定關(guān)聯(lián)，即在神經(jīng)元軸突形成過(guò)程中ANP32A從細(xì)胞核遷移至細(xì)胞質(zhì)，而在未分化的小鼠腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（neuro-2a）中ANP32A主要定位于細(xì)胞核，分化后則分布于細(xì)胞質(zhì)和軸突。此外，ANP32A作為細(xì)胞凋亡增強(qiáng)因子，可通過(guò)刺激凋亡小體而激活Caspase，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)（Pan et al.，2009）。ANP32B在G1期和S期特異性表達(dá)，且在S期聚集在細(xì)胞核中（Sun et al.，2001）。劉思瑤（2021）研究表明，ANP32B在乳腺癌MCF7細(xì)胞分裂間期主要定位于細(xì)胞核，在分裂期則彌散性分布于細(xì)胞質(zhì)。關(guān)于ANP32E的細(xì)胞定位至今未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建雞ANP32家族基因重組真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白ANP32A、ANP32B和ANP32E主要定位于細(xì)胞核，該結(jié)了為進(jìn)一步研究雞ANP32家族蛋白細(xì)胞核定位的分子機(jī)制及組織內(nèi)定位功能研究打下了基礎(chǔ)。

ANP32家族蛋白在人類(lèi)和小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。ANP32A在腦組織中的表達(dá)最豐富，且在成人腦組織不同區(qū)域的分布存在顯著差異，在小腦、顳葉和大腦皮層呈高表達(dá)，而在腦橋、延髓和脊髓呈低表達(dá)；且在成年大腦的表達(dá)水平高于幼年（Wang et al.，2015）。因此，ANP32A基因在大腦組織中的分布及表達(dá)水平提示著ANP32A可能在哺乳動(dòng)物大腦發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，ANP32A基因在小鼠的心臟、肝臟、脾臟和肺臟組織中均有表達(dá)，但幼齡小鼠的表達(dá)量顯著低于成年小鼠，即ANP32A基因在組織中的表達(dá)差異與年齡有關(guān)（王躍群，2016）。有關(guān)ANP32B和ANP32E的組織表達(dá)特征研究表明，ANP32B基因在小鼠免疫器官（脾臟、胸腺）中的表達(dá)水平高于腦組織（Reilly et al.，2011）；ANP32E基因中在小鼠小腦中高表達(dá)，且在小鼠出生后第7 d的相對(duì)表達(dá)量最高，在成熟小鼠小腦中不表達(dá)（Radrizzani et al.，2001）。本研究對(duì)ANP32家族基因在不同月齡雞免疫器官（脾臟、胸腺、法氏囊）中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANP32家族基因在雞不同免疫器官中均有表達(dá)，但ANP32A和ANP32E基因在1～6月齡雞免疫器官中呈先上升后下降的表達(dá)趨勢(shì)，且在2月齡免疫器官中的相對(duì)表達(dá)量達(dá)峰值；ANP32B基因的表達(dá)則呈下降趨勢(shì)?？梢?jiàn)，ANP32家族基因在雞免疫器官中具有獨(dú)特的表達(dá)特征，其表達(dá)差異與免疫器官發(fā)育及免疫功能間的關(guān)系有待進(jìn)一步探究。

近年來(lái)，ANP32家族蛋白除了具有在細(xì)胞內(nèi)的已知生物學(xué)功能外，大量研究還發(fā)現(xiàn)其與病毒復(fù)制存在聯(lián)系（Wang et al.，2019；Zhang et al.，2019，2020）。ANP32A和ANP32B能與流感病毒聚合酶RdRP三亞基聚合體發(fā)生相互作用，促進(jìn)流感病毒感染細(xì)胞后的cRNA-vRNA合成（Sugiyama et al.，2015）。此外，ANP32B蛋白能與NDV、尼帕病毒及仙臺(tái)病毒等副黏病毒M蛋白發(fā)生相互作用，促進(jìn)M蛋白在細(xì)胞核中的積累，即在副黏病毒的復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用（Duan et al.，2020；Günther et al.，2020）。鑒于ANP32家族蛋白成員能參與調(diào)節(jié)病毒復(fù)制，其在家禽相關(guān)病毒如禽流感病毒和NDV復(fù)制中的作用機(jī)制值得深入研究。因此，今后應(yīng)對(duì)NDV感染后雞免疫器官中的ANP32家族基因表達(dá)水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并從細(xì)胞水平深入解析其調(diào)控NDV復(fù)制的作用機(jī)制，為后續(xù)開(kāi)展NDV致病分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

雞ANP32家族蛋白主要定位于細(xì)胞核，且ANP32家族基因在不同月齡雞免疫器官中均有表達(dá)，但這3個(gè)基因具有獨(dú)特的表達(dá)特征，其表達(dá)差異與免疫器官發(fā)育及免疫功能間的關(guān)系有待進(jìn)一步探究。