陳子釗，劉雪媚，許振民，梁秋璐，王中鐸*，郭昱嵩，2*

（1廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

0 引言

【研究意義】視蛋白（Opsin）是一類(lèi)約含350個(gè)氨基酸殘基，含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，隸屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族（G protein-coupled receptors，GPCR）的成員（Bowmaker and Hunt，2006）。根據(jù)是否參與視覺(jué)成像，可將視蛋白分為視覺(jué)視蛋白和非視覺(jué)視蛋白兩大類(lèi)。視桿蛋白（Rhodopsin，RH1）和長(zhǎng)波敏感視蛋白（Long-wave sensitive opsin，LWS）作為直接參與視覺(jué)成像的2種重要視覺(jué)視蛋白，不僅對(duì)外界不斷變化的光環(huán)境視覺(jué)和信號(hào)系統(tǒng)適應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，而且在物種的進(jìn)化上也具有重要影響（Cortesi et al.，2015）。相關(guān)研究表明，魚(yú)類(lèi)在不同發(fā)育階段的視蛋白表達(dá)種類(lèi)及生物表達(dá)量是適應(yīng)光譜環(huán)境變化的自身調(diào)節(jié)機(jī)制，如黃蓋鰈（Pseudopleuronectes yokohamae）在生長(zhǎng)發(fā)育中，RH1基因和LWS基因表達(dá)量逐漸上升，SWS1和SWS2b等短波敏感視蛋白基因則逐漸下降（Sato et al.，2021）。此外，鱖魚(yú)（Siniperca chuatsi）、斑馬魚(yú)（Danio rerio）等不同魚(yú)類(lèi)也具有視蛋白基因，且隨生長(zhǎng)發(fā)育其表達(dá)量呈動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律（Takechi，2005；Tang et al.，2022）。紅鰭笛鯛（Lutjanus erythropterus）是一種廣泛分布于熱帶和亞熱帶海域及巖礁地區(qū)的暖水性近底層魚(yú)類(lèi)，是我國(guó)南部沿海地區(qū)的重要養(yǎng)殖對(duì)象，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。紅鰭笛鯛早期發(fā)育過(guò)程中歷經(jīng)幾次重要的變態(tài)發(fā)育，從早期的浮游生活到后期的底棲生活，其不同棲息水層的光照環(huán)境變化大，視蛋白基因在驅(qū)動(dòng)紅鰭笛鯛變態(tài)發(fā)育過(guò)程中起作用。因此，克隆紅鰭笛鯛RH1基因和LWS基因，并分析其在早期發(fā)育階段及成魚(yú)不同組織的表達(dá)規(guī)律，對(duì)探究笛鯛屬魚(yú)類(lèi)視覺(jué)形成在早期發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)中的變化機(jī)制具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】視覺(jué)是動(dòng)物獲取外界信息的重要途徑，在覓食、求偶及躲避敵害等方面具有重要作用（Liang et al.，2022）。動(dòng)物的視覺(jué)形成與視網(wǎng)膜上的視覺(jué)色素形成有關(guān)。Wald（1968）發(fā)現(xiàn)了視覺(jué)色素的分子結(jié)構(gòu)，組成單位為一個(gè)生色基團(tuán)和一個(gè)視蛋白，同時(shí)提出視覺(jué)色素的光敏感性變化規(guī)律和對(duì)不同波長(zhǎng)的最大吸收峰（λmax）是由這兩者的相互作用而決定。根據(jù)序列之間的相似性和λmax不同，可將視蛋白基因劃分為5種亞型，分別為視錐蛋白中的長(zhǎng)波敏感視蛋白（Long-wave or middle-wave sensitive opsin，LWS/MWS）、紫外敏感視蛋白和藍(lán)色敏感視蛋白（Shortwave sensitive opsin/SWS1-like opsin，SWS1/SWS2）、綠色敏感視蛋白（Rhodopsin-like opsin）及視桿蛋白中的RH1（Rhodopsin）（劉楚吾等，2015）。國(guó)外學(xué)者對(duì)視蛋白的研究早于國(guó)內(nèi)，Nathans 和Hogness（1983）于1983年在牛眼睛上克隆獲得第一個(gè)視桿蛋白基因；Kim等（2019）則通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和石蠟切片探究赤點(diǎn)石斑魚(yú)（Epinephelus akaara）幼體發(fā)育過(guò)程中視蛋白基因的表達(dá)和定位情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MWS、LWS和RH1基因在視網(wǎng)膜中高度表達(dá)。此外，Kasagi等（2015）研究了日本比目魚(yú)（Veraspermoseri）在發(fā)育過(guò)程及棲息水域的變化過(guò)程中相關(guān)視蛋白基因的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著日本比目魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育，RH1基因的表達(dá)量逐漸增高，LWS、SWS2b和SWS1等視蛋白基因則逐漸下降。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)視蛋白基因的研究，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，已由模式生物逐漸轉(zhuǎn)移到非模式生物上。Liu等（2020）通過(guò)基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)鑒定了牙鲆（Paralichthys olivaceus）32個(gè)視蛋白基因，包括10個(gè)視覺(jué)視蛋白和22個(gè)非視覺(jué)視蛋白，并對(duì)非視覺(jué)視蛋白進(jìn)行表達(dá)譜分析。【本研究切入點(diǎn)】目前對(duì)紅鰭笛鯛早期發(fā)育階段的劃分及形態(tài)數(shù)據(jù)已有較多報(bào)道（劉皓等，2015；陳子釗等，2022），但與此過(guò)程密切相關(guān)的視蛋白基因表達(dá)變化尚未見(jiàn)報(bào)道，在紅鰭笛鯛生長(zhǎng)發(fā)育中的變化機(jī)制也尚未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用RACE克隆紅鰭笛鯛2個(gè)視蛋白基因RH1和LWS的cDNA全長(zhǎng)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的表達(dá)規(guī)律，明確紅鰭笛鯛早期視蛋白基因隨光譜變化的表達(dá)特征，為揭示笛鯛屬魚(yú)類(lèi)視覺(jué)形成在早期發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)中的變化機(jī)制打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅鰭笛鯛早期發(fā)育階段樣品取自三亞市陵水縣藍(lán)海洋水產(chǎn)有限公司，包括胚胎發(fā)育階段的原腸下包1/2期（1/2）、胚孔封閉期（bc）、視囊期（oc）、晶體出現(xiàn)期（eIf）、心臟跳動(dòng)期（hb）和孵化出膜期（hat），每管取樣30～40枚受精卵，以及孵化出膜后1、3、10、15和20 d共5個(gè)時(shí)期的仔魚(yú)，樣品保存于液氮中。試驗(yàn)成魚(yú)3尾均購(gòu)自廣東省湛江市霞山水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，體重497±23 g，體長(zhǎng)29±2 cm，于自然光下暫養(yǎng)2 h，暫養(yǎng)水溫（26±2）℃，采用適量MS-222（25 mg/L）將試驗(yàn)成魚(yú)麻醉后，用高溫滅菌過(guò)無(wú)RNA酶的解剖剪快速解剖，取腦、心臟、肝臟、肌肉、黑色皮膚、紅色皮膚、胃和視網(wǎng)膜等8個(gè)組織樣品放于液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

MS-222購(gòu)自Sigma公司；TRIzol Reagent RNA購(gòu)自Invitrogen公司；TransScript Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SYBR?Green qPCR Mix 購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；RACE試劑盒購(gòu)自Clontech公司；pMD18-T載體和JM109感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

采用TRIzol法提取總RNA，全程冰上操作，經(jīng)NanoDrop 2000核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA濃度及A260/A280比值，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.4 RH1和LWS基因cDNA全長(zhǎng)序列克隆

從南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取RH1和LWS2個(gè)基因的EST序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物（表1）。以視網(wǎng)膜cDNA為模板，對(duì)紅鰭笛鯛RH1和LWS基因中間片段進(jìn)行擴(kuò)增，并按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit說(shuō)明進(jìn)行5'-RACE和3'-RACE。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并切膠回收和純化目的條帶，然后將其與pMD18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，于37 ℃恒溫箱中倒置振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，菌液PCR鑒定后挑取陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

通過(guò)DNAMAN 9.0對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行拼接，分別得到RH1基因和LWS基因cDNA序列全長(zhǎng)。使用ORFfinder預(yù)測(cè)2個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）及其編碼的蛋白序列。利用ExPaSy中的ProtParam對(duì)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析；分別用ProtScale和SignalP 4.1預(yù)測(cè)蛋白的親水性和信號(hào)肽；用SMART預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)域；分別用SOPMA和SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用DNAMAN 9.0進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，以MEGA X中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，各分支的置信度以Bootstrap為1000次進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

根據(jù)RH1基因和LWS基因序列，分別設(shè)計(jì)不同外顯子的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物（表1），以RPL13為內(nèi)參基因（Liang et al.，2022）。反應(yīng)體系：50 ng/μL cDNA模板1.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.3 μL，2×SYBR Green qPCR Mix 7.5 μL，超純水補(bǔ)足至15.0 μL。利用Light Cycler?96 PCR System定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃15 s，58 ℃15 s，72 ℃20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算RH1基因和LWS基因在不同發(fā)育時(shí)期及不同組織的相對(duì)表達(dá)量，用Graphpad Prism 8.0和SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 引物序列信息Table 1 The primer sequences used in the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 紅鰭笛鯛RH1和LWS基因cDNA全長(zhǎng)序列分析結(jié)果

利用DNAMAN 9.0拼接出2個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)序列，其中RH1基因（GenBank登錄號(hào)為ON623871）cDNA序列全長(zhǎng)1723 bp，ORF長(zhǎng)度為1062 bp，編碼353個(gè)氨基酸殘基，3'-UTR長(zhǎng)度為465 bp，5'-UTR長(zhǎng)度為196 bp；LWS基因（GenBank登錄號(hào)ON623870）cDNA序列全長(zhǎng)為1302 bp，其中ORF長(zhǎng)度為1074 bp，編碼357個(gè)氨基酸殘基，3'-UTR長(zhǎng)度為213 bp，5'-UTR長(zhǎng)度為15 bp，3'末端均具有明顯的ploy（A）尾巴（圖1和圖2）。

圖1 紅鰭笛鯛RH1基因全長(zhǎng)cDNA序列Fig.1 Full-length cDNA sequence information of L.erythropterus RH1 gene

圖2 紅鰭笛鯛LWS基因全長(zhǎng)cDNA序列Fig.2 Full-length cDNA sequence of L.erythropterus LWS gene

2.2 RH1和LWS氨基酸多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

從GenBank搜索其他物種的RH1氨基酸序列（表2）和LWS氨基酸序列（表3），再利用DNAMAN 9.0將獲得的紅鰭笛鯛RH1和LWS氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物對(duì)應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果如圖3所示。紅鰭笛鯛RH1氨基酸序列與魚(yú)類(lèi)的RH1氨基酸序列相似性最高，其次是陸生脊椎動(dòng)物，其中與鱸形目魚(yú)類(lèi)的相似性最高，最高達(dá)92%；LWS氨基酸序列的多序列比對(duì)結(jié)果與RH1氨基酸序列相似，與陸生哺乳動(dòng)物L(fēng)WS氨基酸序列的相似性最低，只有72%～78%，而與魚(yú)類(lèi)LWS氨基酸序列的相似性達(dá)80%～90%，其中與鱸形目的相似性較高，與鳉形目的相似性稍低，達(dá)85%～89%，與鮭形目的相似性最低，為74%～80%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，所有物種的RH1氨基酸序列聚為兩大分支，其中魚(yú)類(lèi)聚為一支，陸生脊椎動(dòng)物聚為一支，在魚(yú)類(lèi)分支中，紅鰭笛鯛與金頭鯛（Sparus aurata）、快樂(lè)東方鯛（Astatotilapia calliptera）等鱸形目的遺傳距離最近，其次與鰈形目、鮭形目和鯉形目等魚(yú)類(lèi)均具有較近的親緣關(guān)系（圖3-A）；所有物種的LWS氨基酸序列也聚為兩大分支，陸生脊椎動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)同樣各為一大分支，在魚(yú)類(lèi)分支中，紅鰭笛鯛與奈里樸麗魚(yú)（Pundamilia nyererei）的遺傳距離最近，與孔雀花鳉（Poecilia reticulata）、海水青鳉（Oryzias melastigma）等鳉形目有較近的親緣關(guān)系，與水牛（Bubalus bubalis）、灰短尾負(fù)鼠（Monodelphis domestica）等陸生脊椎動(dòng)物的遺傳距離最遠(yuǎn)，與傳統(tǒng)的物種分類(lèi)相一致（圖3-B）。

表2 不同物種RH1氨基酸序列的GenBank登錄號(hào)Table 2 GenBank accession numbers of amino acid sequences of RH1 in different species

表3 不同物種LWS氨基酸序列的GenBank登錄號(hào)Table 3 GenBank accession numbers of amino acid sequences of LWS in different species

2.3 紅鰭笛鯛RH1和LWS蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果

ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，RH1和LWS蛋白的分子量大小分別為39.57和40.22 kD，理論等電點(diǎn)（pI）分別為6.31和8.36，其中RH1蛋白帶有22個(gè)負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）和20個(gè)正電荷殘基（Arg+Lys），總平均疏水指數(shù)值（GRAVY）為0.415，屬于疏水性蛋白，LWS蛋白帶有23個(gè)負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）和27個(gè)正電荷殘基（Arg+Lys），總平均疏水指數(shù)值為0.395，同樣屬于疏水性蛋白。親水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，RH1和LWS蛋白的最小親水性指數(shù)分別為-2.689和-2.933，最大親水性指數(shù)分別為3.544和3.178（圖5）。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，2個(gè)視蛋白均無(wú)信號(hào)肽，證明RH1和LWS蛋白均屬于非分泌型蛋白。據(jù)SMART在線(xiàn)網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果（圖7）顯示，2個(gè)視蛋白均含有典型的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其中RH1還含有一個(gè)Rhodopsin_N結(jié)構(gòu)域。

圖5 紅鰭笛鯛視蛋白R(shí)H1（A）和LWS（B）的親/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.5 Hydrophilicity/hydrophobicity prediction of L.erythropterus opsins RH1（A）and LWS（B）

圖6 紅鰭笛鯛視蛋白R(shí)H1（A）和LWS（B）的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.6 Signal peptide prediction of L.erythropterus opsins RH1（A）and LWS（B）

圖7 紅鰭笛鯛視蛋白R(shí)H1（A）和LWS（B）的蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.7 Protein domains prediction of L.erythropterus opsins RH1（A）and LWS（B）

2.4 紅鰭笛鯛RH1和LWS的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

利用SOPMA在線(xiàn)分析2個(gè)視蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，RH1的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋（42.21%）、延伸連（16.43%）、β-轉(zhuǎn)角（3.97%）和無(wú)規(guī)則卷曲（37.39%）；LWS的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋（44.26%）、延伸連（16.53%）、β-轉(zhuǎn)角（2.52%）和無(wú)規(guī)則卷曲（36.69%）（圖8）。

圖8 紅鰭笛鯛RH1（A）和LWS（B）蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.8 Protein secondary structure prediction of L. erythropterus RH1（A）and LWS（B）

利用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)RH1和LWS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，這兩個(gè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，均具有典型的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖9）。

圖9 紅鰭笛鯛視蛋白R(shí)H1（A）和LWS（B）的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.9 Protein tertiary structure prediction of L.erythropterus opsin RH1（A）and LWS（B）

2.5 紅鰭笛鯛RH1基因和LWS基因時(shí)空表達(dá)分析結(jié)果

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)紅鰭笛鯛RH1基因和LWS基因在早期發(fā)育11個(gè)階段和成魚(yú)8個(gè)不同組織的表達(dá)情況，結(jié)果如圖10和圖11所示。在早期發(fā)育過(guò)程中，RH1基因的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，在孵化出膜前的下包1/2期和胚孔封閉期均有微弱表達(dá)，然后相對(duì)表達(dá)量降低，趨近于0，孵化出膜后相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，在15 d和20 d達(dá)最高值，顯著高于其他時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05，下同）；在成魚(yú)各組織中，RH1基因在視網(wǎng)膜中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于在其他7個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量。LWS基因在孵化出膜后的20 d相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他時(shí)期，其早期發(fā)育的表達(dá)水平變化模式與RH1基因相似，LWS基因同樣具有組織表達(dá)特異性，在視網(wǎng)膜上的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織，而其他組織間的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖4 基于紅鰭笛鯛RH1（A）和LWS（B）氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of L.erythropterus RH1（A）and LWS（B）

圖10 RH1和LWS基因在紅鰭笛鯛早期發(fā)育的表達(dá)情況Fig.10 Expression of RH1 and LWS genes in early development of L.erythropterus

圖11 RH1和LWS基因在紅鰭笛鯛不同組織的表達(dá)情況Fig.11 Expression of RH1 and LWS genes in various tissues of L.erythropterus

3 討論

3.1 RH1和LWS基因序列特征和系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究通過(guò)RACE克隆紅鰭笛鯛RH1基因和LWS基因cDNA全長(zhǎng)，分別為1723和1302 bp，二者分別是視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞中的視蛋白（Yokoyama et al.，2000），是具有典型的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。通過(guò)氨基酸多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，紅鰭笛鯛和其他物種的視蛋白基因序列相似性很高，其中與魚(yú)類(lèi)RH1氨基酸序列相似性達(dá)84%～92%，而與陸生脊椎動(dòng)物的相似性稍低，只有68%～74%，LWS氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果與RH1氨基酸序列類(lèi)似。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，基于RH1和LWS氨基酸序列的相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)大致相同，所有物種可分為五大分支，紅鰭笛鯛先與同屬于鱸形目的魚(yú)類(lèi)聚為一支，其次與親屬關(guān)系較遠(yuǎn)的鰈形目、鮭形目和鯉形目等聚為一支，最后再與親屬關(guān)系最遠(yuǎn)的陸生脊椎動(dòng)物聚為一支。2個(gè)視蛋白基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)所體現(xiàn)的高級(jí)階元親緣關(guān)系與傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)和分子分類(lèi)學(xué)基本一致（Allen et al.，1985；Guo et al.，2016），表明視蛋白基因同樣適用于高級(jí)階元的系統(tǒng)發(fā)育分析（劉楚吾等，2015）。

3.2 RH1和LWS基因的進(jìn)化分析

視蛋白基因?qū)︳~(yú)類(lèi)的進(jìn)化和物種的形成具有重要作用（劉楚吾等，2015），自Archer等（1992）研究大堡礁笛鯛屬魚(yú)類(lèi)視蛋白λmax與水色的關(guān)系以來(lái)，珊瑚礁魚(yú)類(lèi)的視蛋白基因研究逐漸引起學(xué)者的關(guān)注，從而獲得較多成果，從單一的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)和視蛋白λmax數(shù)據(jù)分析逐漸轉(zhuǎn)為以分子生物學(xué)手段對(duì)視蛋白基因介導(dǎo)環(huán)境適應(yīng)性的研究。研究表明，RH1等視覺(jué)視蛋白基因主要起感受暗視覺(jué)的調(diào)控功能，對(duì)于海洋物種在海洋底棲環(huán)境下攝食、逃避敵害等方面發(fā)揮重要的作用，推測(cè)這些視覺(jué)視蛋白基因在昏暗且光譜受限制的海洋環(huán)境下承受更強(qiáng)的選擇壓力（Larmuseau et al.，2011）。多數(shù)脊椎動(dòng)物RH1的λmax約500 nm（陳新頁(yè)等，2015；Hart，2020；Sato et al.，2021），且根據(jù)棲息水域深度不同，RH1的λmax也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的紅移或藍(lán)移，表明大多數(shù)海水魚(yú)類(lèi)通過(guò)改變RH1氨基酸序列中的某些氨基酸殘基位點(diǎn)來(lái)適應(yīng)海洋光環(huán)境的變化（Larmuseau et al.，2011；Shozo，2012），在不同棲息水域環(huán)境下吸收不同波長(zhǎng)的光線(xiàn)反映出魚(yú)類(lèi)的適應(yīng)性進(jìn)化。相對(duì)于淡水魚(yú)類(lèi)，海洋魚(yú)類(lèi)要面對(duì)深海更復(fù)雜的環(huán)境及光線(xiàn)變化，導(dǎo)致其視蛋白基因分化程度遠(yuǎn)高于淡水魚(yú)類(lèi)，發(fā)生基因復(fù)制的概率也會(huì)更高。LWS是一類(lèi)負(fù)責(zé)參與動(dòng)物視覺(jué)中紅綠色成像的視蛋白，又被稱(chēng)作紅—綠視蛋白（謝子強(qiáng)等，2015）。在視蛋白基因中，LWS基因分化程度最高，受各方面的選擇壓力也最大（劉旦，2012）。因此，LWS基因是5種視蛋白基因中探究分子進(jìn)化和遺傳學(xué)的理想基因。在笛鯛屬魚(yú)類(lèi)中，LWS基因的選擇性進(jìn)化在笛鯛魚(yú)類(lèi)生態(tài)重疊區(qū)的物種分化過(guò)程中可能起到重要的作用（王中鐸，2009）。

3.3 RH1和LWS基因的表達(dá)規(guī)律

本研究中RH1基因和LWS基因在早期發(fā)育的不同階段和成魚(yú)不同組織均呈現(xiàn)出非常相似的表達(dá)模式，視蛋白基因在魚(yú)類(lèi)不同發(fā)育階段的表達(dá)變化模式，體現(xiàn)了魚(yú)類(lèi)自身眼睛發(fā)育及適應(yīng)不同光境下的強(qiáng)大調(diào)節(jié)機(jī)制（Carleton et al.，2008）。在孵化出膜前，紅鰭笛鯛2個(gè)視蛋白基因在原腸下包1/2期和胚孔封閉期均有較高表達(dá)，其余階段表達(dá)量較低，可能與魚(yú)類(lèi)眼睛器官的形成與胚層分化和神經(jīng)分化有關(guān)（謝子強(qiáng)等，2015），其原因是魚(yú)類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)的形成與原腸胚的下包有關(guān)，原腸胚的下包影響了眼睛的發(fā)育，且與神經(jīng)胚的形成密切相關(guān)。作為在視網(wǎng)膜上介導(dǎo)明暗視覺(jué)的視蛋白，紅鰭笛鯛早期階段RH1基因和LWS基因的表達(dá)可能與自身眼睛的開(kāi)始發(fā)育有關(guān)。在孵化出膜后，紅鰭笛鯛2個(gè)視蛋白基因的表達(dá)量均開(kāi)始上升，其表達(dá)模式與大多數(shù)魚(yú)類(lèi)一致（Chang et al.，2020；Wang et al.，2021；Tang et al.，2022）。紅鰭笛鯛在早期仔魚(yú)階段以浮游生活，且具有趨光性，此時(shí)波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光能到達(dá)海水水層上方，而LWS主要感受長(zhǎng)波的紅色光（λmax約560 nm）（陳新頁(yè)等，2015），表明對(duì)光環(huán)境的適應(yīng)及攝食迫切需要相應(yīng)視蛋白的表達(dá)回升（Luehrmann et al.，2018）。紅鰭笛鯛由仔稚幼魚(yú)轉(zhuǎn)變?yōu)槌婶~(yú)之后，開(kāi)始以底棲生活為主（30～100 m），視桿蛋白R(shí)H1在對(duì)魚(yú)類(lèi)適應(yīng)黑暗環(huán)境、攝食及躲避敵害等方面發(fā)揮重要作用，此時(shí)RH1基因在視網(wǎng)膜中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而視錐蛋白的作用相對(duì)被弱化（Lup?e et al.，2021）。RH1基因和LWS基因在紅鰭笛鯛不同組織中的表達(dá)情況與其他魚(yú)類(lèi)相似，均在視網(wǎng)膜中高表達(dá)，盡管某些魚(yú)類(lèi)如藍(lán)刻齒雀鯛（Chrysiptera cyanea）（Takeuchi et al.，2011）存在視網(wǎng)膜以外的光感受器，但視網(wǎng)膜依然是視蛋白基因的表達(dá)的主要部位。

4 結(jié)論

紅鰭笛鯛2個(gè)視蛋白基因RH1和LWS基因的表達(dá)具有組織特異性，且在早期發(fā)育階段的表達(dá)水平與紅鰭笛鯛的生活習(xí)性變化相關(guān)，表明紅鰭笛鯛RH1和LWS基因表達(dá)與其生活光環(huán)境的變化密切呼應(yīng)，在早期發(fā)育變態(tài)階段的光線(xiàn)調(diào)節(jié)，以及適應(yīng)黑暗環(huán)境等方面發(fā)揮重要作用。