邱 倩

(隴東學(xué)院 岐伯醫(yī)學(xué)院，甘肅 慶陽(yáng) 745000)

原癌基因c-fos是一種可被第二信使所誘導(dǎo)的即刻早期基因(Imdeiately Ealry Genes,IEGs)，高度保守地存在于人類、豚鼠和鳥類細(xì)胞核DNA中[1-3]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有十幾種即刻早期基因，除c-fos外還有如c-jun、c-myc等，而c-fos和c-jun可被外源性刺激激活，在細(xì)胞代謝活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[4]。c-fos原癌基因及其表達(dá)產(chǎn)物c-Fos蛋白，一方面參與細(xì)胞的正常生長(zhǎng)分化過(guò)程，同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞和能量代謝等生命過(guò)程中也同樣起著不可或缺的重要作用[5，6]。一般情況下原癌基因c-fos處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，表達(dá)水平較低，當(dāng)細(xì)胞受到外界缺氧、機(jī)械、光線等異常刺激后最先被激活，轉(zhuǎn)錄形成2.2kb的成熟mRNA，進(jìn)而編碼翻譯成55kDa的核內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)，即c-Fos蛋白，可以在細(xì)胞內(nèi)大量和持續(xù)性地積聚發(fā)揮轉(zhuǎn)染能力，或當(dāng)機(jī)體處于正常的胚胎發(fā)育的某一時(shí)期可大量表達(dá)，使得原始細(xì)胞分化為具有特異結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞從而發(fā)揮作用[2,6]，在程序性細(xì)胞死亡等病理性過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

抗體是漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生的對(duì)抗原有特異結(jié)合能力的免疫球蛋白(Ig)，在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中具有重要的作用。大多數(shù)抗原是由大分子蛋白質(zhì)組成的，具有多種不同的表位，當(dāng)一種異源抗原(大分子抗原、抗原偶聯(lián)物)經(jīng)多種途徑進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí)，可刺激動(dòng)物機(jī)體合成并分泌具有多種表位的抗體，而針對(duì)多種不同抗原決定簇的抗體組成的混合物就是多克隆抗體(Polyclonal antibody，PcAb)，簡(jiǎn)稱多抗。與單克隆抗體相比，多克隆抗體由于可識(shí)別多個(gè)抗原表位，引起沉淀反應(yīng)，制備周期短，成本低、效果好[7]的原因，作為研究工具，已廣泛應(yīng)用于自然科學(xué)研究和醫(yī)療診斷領(lǐng)域，并發(fā)揮不可或缺的重要作用。目前，使用原核表達(dá)蛋白免疫小鼠或者兔子以獲取多克隆抗體是一種最常用的抗體制備方式。c-Fos蛋白多克隆抗體可與細(xì)胞發(fā)生異常后產(chǎn)生的c-Fos蛋白結(jié)合，可作為對(duì)細(xì)胞異常反應(yīng)所導(dǎo)致的c-fos異常表達(dá)的重要指示，在相關(guān)研究中發(fā)揮重要作用。

目前，市面上有關(guān)草魚(Ctenopharyngodonidella)原癌基因蛋白的檢測(cè)抗體種類較少，尚未見(jiàn)c-Fos蛋白的抗體，本研究通過(guò)選取c-Fos蛋白抗原系數(shù)較高的一段多肽的核酸片段進(jìn)行克隆，構(gòu)建原核表達(dá)載體，并利用原核表達(dá)系統(tǒng)即大腸桿菌表達(dá)，純化得到了c-Fos蛋白，可用于進(jìn)一步免疫新西蘭大白兔，以得到c-Fos蛋白的多克隆抗體，這為后期草魚c-Fos蛋白的亞細(xì)胞定位及抗凋亡等功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

本研究所用的草魚來(lái)源于甘肅省蘭州市雁灘區(qū)花鳥魚市場(chǎng)；pMD19-T simple vector試劑盒購(gòu)自TaKaRa(寶生物中國(guó)，北京)公司；原核克隆、表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌(Escherichiacoli，簡(jiǎn)寫E.coli)DH5α、Rosetta，質(zhì)粒pET-28a由蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物學(xué)研究所張迎梅教授實(shí)驗(yàn)室提供。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ，T4連接酶購(gòu)自NEB(New England Biolabs，北京)公司；RNA提取試劑盒RNAiso Plus、Taq DNA聚合酶、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa(寶生物，大連)公司；蛋白分離His-鎳柱Ni-NTA His·Bind購(gòu)自Merck(默克，中國(guó))公司；c-fos基因擴(kuò)增的特異性引物由金唯智生物科技(北京)有限公司合成；其它用到的試劑均購(gòu)自國(guó)內(nèi)試劑公司，為國(guó)產(chǎn)化學(xué)分析純級(jí)別。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information Search database，NCBI)網(wǎng)站GenBank中公布的草魚c-fos基因的mRNA序列(No.AF380155)，通過(guò)生物綜合性序列分析軟件DNA star分析獲得目標(biāo)基因c-fos表達(dá)蛋白序列親水性最佳的一個(gè)片段，即其抗原系數(shù)較高的區(qū)域，作為目標(biāo)基因擴(kuò)增片段，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)出可擴(kuò)增該編碼區(qū)的一對(duì)特異性引物，擴(kuò)增目的基因可得到長(zhǎng)度為883bp的c-fos基因片段，以備下一步的原核克隆[8，9]。

1.2.2 總RNA提取

取草魚新鮮的肝臟組織，用錫紙和分析天平準(zhǔn)確稱取2g置于陶瓷研缽中，加入適量液氮快速反復(fù)研磨，直至肝臟組織完全被研磨成細(xì)粉狀，選用TaKaRa公司的RNA提取試劑盒RNAiso Plus在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌環(huán)境下提取草魚總RNA，具體操作步驟參考RNAiso Plus試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。提取完成后利用濃度為1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，并利用Nanodrop 2000型超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和純度，以確?？捎糜谙乱徊降臄U(kuò)增。

1.2.3 RT-PCR及c-fos基因片段的克隆

以草魚總RNA為模板，利用TaKaRa公司的PrimeScript? RT reagent Kit試劑盒將草魚總RNA反轉(zhuǎn)錄成總DNA，并將此總DNA作為模板進(jìn)行c-fos基因的擴(kuò)增。具體擴(kuò)增反應(yīng)條件是：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；共25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃，forever[8,10]。擴(kuò)增所得的核酸產(chǎn)物用濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，在紫外線透照下切取目標(biāo)條帶，并按照凝膠回收試劑盒說(shuō)明書回收擴(kuò)增所得目的片段。利用T4連接酶將回收片段連接到pMD19-T simple載體上，并將重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α，利用藍(lán)白斑陽(yáng)性克隆篩選原理挑取陽(yáng)性克隆的白色菌斑進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)目標(biāo)基因的克隆情況[11]，檢測(cè)到目標(biāo)條帶后，取適當(dāng)量菌液按照TaKaRa公司的質(zhì)粒小量抽提試劑盒說(shuō)明提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ兩個(gè)限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定[8，9]。初步酶切鑒定正確后，將適量含有重組克隆載體的DH5α菌液送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行載體序列的測(cè)定。

1.2.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將核酸序列測(cè)定正確的重組克隆載體命名為pMD19-T/c-fos，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)pMD19-T/c-fos重組克隆載體和原核表達(dá)載體pET-28a進(jìn)行雙酶切以備重組表達(dá)載體的構(gòu)建，瓊脂糖凝膠電泳分離并回收酶切所得的c-fos核酸片段和pET-28a大片段。用T4連接酶將兩部分核酸片段在16℃水浴鍋中連接過(guò)夜，E.coliRosetta，并經(jīng)菌落PCR鑒定目標(biāo)片段與原核表達(dá)載體是否連接及感受態(tài)菌的轉(zhuǎn)化是否成功，最后通過(guò)篩選將構(gòu)建成功的表達(dá)載體命名為pET-28a/c-fos。

1.2.5 c-Fos融合蛋白的誘導(dǎo)與表達(dá)

取轉(zhuǎn)化成功有表達(dá)載體pET-28a/c-fos的E.coliRosetta菌液接種培養(yǎng)基，培養(yǎng)到適當(dāng)濃度后，在不同溫度，不同誘導(dǎo)時(shí)間和不同濃度誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside，IPTG)作用下誘導(dǎo)c-Fos融合蛋白的表達(dá)。利用摸索所得的最佳溫度、時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度條件小量培養(yǎng)Rosetta菌，誘導(dǎo)c-Fos融合蛋白的表達(dá)。最后取誘導(dǎo)后的菌液，提取其總蛋白，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6 c-Fos融合蛋白的大量表達(dá)和純化定量[8，9]

以小量誘導(dǎo)的最佳溫度將菌株擴(kuò)大至1～2L培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至菌液的OD600≈0.8時(shí)加入IPTG至終濃度為0.5mM，并按最優(yōu)誘導(dǎo)時(shí)間培養(yǎng)以誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。培養(yǎng)結(jié)束后，在4℃條件下8000rpm離心菌液10min，棄掉上清培養(yǎng)基收集沉淀，按49∶1(培養(yǎng)物：結(jié)合緩沖液)的濃度加入結(jié)合緩沖液重新將沉淀混懸；接著依次加入溶菌酶至終濃度為1mg/ml，冰浴反應(yīng)30min，4℃搖床震蕩反應(yīng)10min；加入TritonX-100至終濃度為1%，冰浴條件下4℃搖床震蕩反應(yīng)10min；冰浴條件下利用超聲細(xì)胞破碎儀超聲(超聲3s，停7s)破碎菌體，4℃下1000rpm離心20min，將得到的上清和沉淀分別收集后，上清液用0.45μm濾膜過(guò)濾，沉淀用含有8M尿素的結(jié)合緩沖液溶解后過(guò)濾，將含有目標(biāo)蛋白的上清或者沉淀溶解液用默克公司的鎳柱純化樹脂Ni-NTA His·Bind進(jìn)行目標(biāo)蛋白純化。利用SDS-PAGE凝膠電泳繼續(xù)檢測(cè)純化后所得的組分，并用BCA法測(cè)定純化后的蛋白濃度，并將所得純化后的蛋白濃度稀釋為1mg/ml后分裝保存于-80℃冰箱，以備后續(xù)研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增片段的確定

利用生物序列分析軟件DNAstar分析c-Fos蛋白的親水性和抗原系數(shù)，選取親水性和抗原系數(shù)均較高的最佳片段(圖1)作為目標(biāo)基因片段表達(dá)c-Fos融合蛋白，利用特異性引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因片段的特異性引物(圖2)，上游引物序列：5’-GGCGGATCCTTTACCAGCCTTAG’；下游引物序列：5’-ATTCTCGAGTTCGGTGTTAGCGG-3’，下劃線部分是在上下游引物中分別引入的BamHI和XhoI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基序列加粗顯示。

圖1 c-Fos蛋白親水性和抗原系數(shù)分析

2.2 RNA提取與RT-PCR

利用TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑盒提取草魚肝臟總RNA，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，提取結(jié)果理想，未發(fā)生核酸降解和污染。以提取所得總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增c-fos基因片段，結(jié)果顯示(見(jiàn)圖2)在900bp(c-fos基因片段理論長(zhǎng)度為883bp：867bp+12bp酶切位點(diǎn)+4bp保護(hù)堿基)處可見(jiàn)一條特異性的DNA條帶十分明亮，即為所要擴(kuò)增的c-fos基因片段。

圖2 c-fos基因片段擴(kuò)增結(jié)果

2.3 目的片段的克隆與鑒定

重組原核克隆載體pMD19-T/IAP轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α后，利用菌落PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化效果，少量抽提質(zhì)粒后使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定結(jié)果顯示，特異性目的條帶在900bp處(圖3)，送測(cè)序公司，測(cè)序結(jié)果與GenBank上公布的c-fos基因?qū)?yīng)區(qū)域的序列一致，即重組和轉(zhuǎn)化成功，可進(jìn)行下一步的原核表達(dá)載體構(gòu)建。

圖3 重組克隆載體pMD19-T/c-fos菌落PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組原核克隆載體pMD19-T/c-fos和原核表達(dá)載體pET-28a(見(jiàn)圖4)，將目標(biāo)片段連接到pET-28a后構(gòu)建成原核表達(dá)載體pET-28a/c-fos，轉(zhuǎn)化E.coliRosetta，同樣經(jīng)菌落PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有一條明亮的特異性的條帶在900bp處(見(jiàn)圖5)即為目標(biāo)條帶，說(shuō)明原核表達(dá)載體pET-28a/c-fos構(gòu)建成功。

圖4 pET-28a載體和重組克隆載體pMD19-T/c-fos雙酶切結(jié)果

圖5 重組原核表達(dá)載體pET-28a/c-fos菌落PCR結(jié)果

2.5 c-Fos融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)菌落PCR檢測(cè)篩選得到含有表達(dá)載體的菌株，繼續(xù)培養(yǎng)，并加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mM/L，在30℃條件下分別誘導(dǎo)表達(dá)2h、4h、6h后，利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示(見(jiàn)圖6)，所有誘導(dǎo)條件均可成功誘導(dǎo)表達(dá)c-Fos融合蛋白，目標(biāo)蛋白分子量在40kDa左右，與理論推算分子量(36.56kDa)相符，且30℃、6h為最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。

圖6 0.5mM IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間的目標(biāo)蛋白表達(dá)情況

2.6 c-Fos融合蛋白的純化

取適量含有表達(dá)載體的菌株在500ml培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)，在30℃誘導(dǎo)表達(dá)6h(小量表達(dá)測(cè)試所得最佳條件)后，高速冷凍離心收集菌體，加入結(jié)合緩沖液和溶菌酶后進(jìn)行超聲破碎細(xì)胞，其后再次離心得到沉淀和上清液，SDS-PAGE凝膠電泳分別檢測(cè)上清和沉淀中目標(biāo)蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)c-Fos融合蛋白基本都包含在沉淀中(見(jiàn)圖7)，即目標(biāo)蛋白屬不可溶性蛋白。取沉淀繼續(xù)超聲并過(guò)濾后利用鎳柱純化樹脂Ni-NTA His·Bind純化目標(biāo)蛋白，結(jié)果可見(jiàn)一單一的目標(biāo)蛋白條帶，且在150mM咪唑洗脫液中的蛋白含量最高，濃度為303μg/ml(見(jiàn)圖8)。

圖7 c-Fos融合蛋白大量表達(dá)后沉淀和上清液分析

圖8 c-Fos融合蛋白大量表達(dá)后純化分析

3 討論

作為即刻早期反應(yīng)家族成員，c-fos基因在無(wú)外界刺激的狀況下，正常參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、信息傳遞、學(xué)習(xí)和記憶等多種生理過(guò)程，而當(dāng)受到內(nèi)外環(huán)境缺血、缺氧、外傷、癲癇和外周神經(jīng)刺激時(shí),可以快速反應(yīng)，高水平表達(dá)[12]，而在刺激解除后又恢復(fù)正常，被認(rèn)為是最適宜進(jìn)行中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究的基因[13，14]。

本研究選擇鯉科、草魚屬，草魚肝臟作為研究材料，提取cDNA序列，并反轉(zhuǎn)錄其mRNA，對(duì)其原癌基因c-fos高親水性和高抗原性的基因片段進(jìn)行原核克隆，并構(gòu)建了原核表達(dá)載體，成功地誘導(dǎo)表達(dá)了His-c-Fos融合蛋白。高親水性的原核表達(dá)蛋白易于純化，而高的抗原系數(shù)可使目標(biāo)蛋白在動(dòng)物免疫時(shí)具有較高的免疫原性，易于產(chǎn)生抗體。為此我們利用生物信息學(xué)軟件分析了c-fos基因表達(dá)蛋白的親水性和抗原系數(shù)，并選擇了親水性和抗原系數(shù)均較好的區(qū)段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行目標(biāo)片段的基因克隆和原核表達(dá)體系構(gòu)建，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，我們得到的蛋白親水性仍不高，大量形成包涵體沉淀，為不可水溶性表達(dá)蛋白，但可溶于咪唑洗脫液，經(jīng)超聲破碎洗脫液溶解后也得到了一定濃度的蛋白。另外，本研究中我們選擇了E.coliRosetta菌株進(jìn)行原核蛋白表達(dá)，可有效避免稀有密碼子導(dǎo)致的翻譯問(wèn)題，在誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)30℃培養(yǎng)效果較好，蛋白可大量表達(dá)，且該蛋白表達(dá)量在誘導(dǎo)6h時(shí)即可達(dá)到理想狀態(tài)。目標(biāo)蛋白所帶His標(biāo)簽較小，不影響該蛋白的功能和免疫原性，經(jīng)分離純化最終成功獲得了c-fos原核表達(dá)蛋白。

本研究成功構(gòu)建了草魚c-fos原核表達(dá)載體，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)獲得融合蛋白表達(dá)，分離純化后的草魚c-Fos融合蛋白經(jīng)進(jìn)一步濃縮后可用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫以得到多克隆抗體，為草魚凋亡相關(guān)研究中的c-Fos蛋白的檢測(cè)，也為我們后期對(duì)該蛋白的組織和亞細(xì)胞定位及生物學(xué)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。