叢文欽,陳 罡,祝儒剛,高英旭*,趙濟(jì)川,范俊崗
(1.遼寧大學(xué) 輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110036;2.遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院,遼寧 沈陽(yáng) 110032)
殼聚糖(Chitosan)是一種由2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖通過(guò)β-(1→4)糖苷鍵連接而成的線性多糖,也是唯一大量存在的陽(yáng)性多糖,主要來(lái)源于幾丁質(zhì)(Chitin,又名甲殼素)經(jīng)強(qiáng)烈堿水解或生物酶分解脫去N-乙酰基的過(guò)程[1]。相較于幾丁質(zhì),殼聚糖具有更高的溶解性和更完善的功能特性,如抗菌性、抗氧化性、生物相容性、組織相容性等性質(zhì)[2]。正因如此,殼聚糖在食品、醫(yī)藥、化妝品等眾多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,是一種極具應(yīng)用前景的天然多糖。傳統(tǒng)市售商品化殼聚糖來(lái)源于海洋副產(chǎn)品,制備過(guò)程需脫鹽、脫礦、脫蛋白等眾多化學(xué)反應(yīng)步驟,既不能免除蝦蟹等海洋副產(chǎn)品帶來(lái)的致敏性問(wèn)題[3],又可能受到來(lái)自眾多反應(yīng)過(guò)程中的污染。因此,探究更多天然殼聚糖來(lái)源的研究十分具有現(xiàn)實(shí)意義。
靈芝孢子是擔(dān)子菌門(mén)多孔菌科腐生真菌靈芝Ganodermalucidum的生殖細(xì)胞,具有靈芝全部遺傳生物活性物質(zhì),如多糖、三萜、甾醇等物質(zhì),有多種功效和醫(yī)學(xué)研究?jī)r(jià)值。其主要結(jié)構(gòu)為雙層壁結(jié)構(gòu),以透明外孢壁和深褐色內(nèi)壁組成,主要成分為幾丁質(zhì)[4],這也導(dǎo)致靈芝孢子粉內(nèi)部生物活性物質(zhì)難以被人體直接吸收。將其內(nèi)活性物質(zhì)提取后再進(jìn)行利用則可避免直接服用導(dǎo)致的消化不良、便秘等癥狀,但提取后的殘?jiān)魲壷挥茫銜?huì)造成靈芝資源的浪費(fèi)。因此,本研究采用過(guò)程較為簡(jiǎn)單的化學(xué)法將靈芝孢子粉破壁后殘?jiān)械臍ぞ厶沁M(jìn)行分離純化,并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,以制備具有良好品質(zhì)的靈芝孢子殼聚糖,為殼聚糖的分離純化提供新的方向和理論基礎(chǔ)。
靈芝孢子粉殘?jiān)鼮殪`芝孢子粉(取自遼寧省林業(yè)科學(xué)院新賓縣靈芝栽培示范基地)用破壁機(jī)破壁后收集所得殘?jiān)?。?shí)驗(yàn)用試劑氫氧化鈉、鹽酸、冰乙酸、過(guò)氧化氫均為分析純。其中,氫氧化鈉購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠;鹽酸購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑有限公司;冰乙酸購(gòu)自天津博迪化工股份有限公司;過(guò)氧化氫購(gòu)自沈陽(yáng)市東興試劑廠。
1.2.1 殼聚糖的提取
1.2.1.1 幾丁質(zhì)的制備
將提取過(guò)生物活性物質(zhì)后的靈芝孢子殘?jiān)娓珊笱屑?xì),按照Liao等[5]的方法,準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的靈芝孢子粉殘?jiān)c2%NaOH以1∶20(g:mL)的比例置于85℃水浴中4 h。結(jié)束后,待混合液冷卻,在7 000 r·min-1、室溫條件下離心15 min,收集沉淀物并用超純水清洗至中性,置于65℃烘箱中干燥過(guò)夜,保存待用。
1.2.1.2 脫 色
按照Chen等的方法[6],將靈芝孢子幾丁質(zhì)與30%H2O2以1∶10(g:L)的比例置于70℃水浴中進(jìn)行漂白2 h。待混合物冷卻后,用NaOH溶液將混合物pH值調(diào)節(jié)至中性,在室溫條件下7 000 r·min-1離心10 min,收集沉淀即為靈芝孢子幾丁質(zhì),干燥備用。
1.2.1.3 幾丁質(zhì)脫乙?;苽錃ぞ厶?/p>
根據(jù)朱禮芳[7]所述方法,取靈芝孢子幾丁質(zhì)1 g,按照設(shè)定比例與一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaOH溶液充分混勻,然后置于熱水浴中保持預(yù)設(shè)時(shí)間。結(jié)束后冷卻,在室溫條件下7 000 r·min-1離心15 min,收集沉淀,用超純水洗滌至pH值7,靜置過(guò)夜,再次離心,將沉淀物烘干,即為粗靈芝孢子殼聚糖。
1.2.1.4 殼聚糖的純化
將粗靈芝孢子殼聚糖與質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的醋酸溶液混合,超聲輔助使其溶解,在7 000 r·min-1條件下離心10 min,棄去沉淀,取上清液再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值>9,此時(shí)出現(xiàn)大量白色沉淀。將所得混合液再次離心,收集沉淀并洗滌至pH值呈中性,于65℃烘箱烘干即為靈芝孢子殼聚糖。
1.2.2 單因素試驗(yàn)
分別以NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間3個(gè)因素作單因素試驗(yàn),考察各單因素對(duì)靈芝孢子殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響情況。
1.2.2.1 NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)
固定料液比1∶30,NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%,于90℃水浴5 h,研究不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaOH對(duì)殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響。
1.2.2.2 溫度
固定料液比1∶30,NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%,分別于60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴5 h,研究不同溫度對(duì)殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響。
1.2.2.3 時(shí)間
固定料液比1:30,NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%,于90℃水浴2 h、3 h、4 h、5 h、6 h,研究不同水洉時(shí)間對(duì)殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響。
1.2.3 正交試驗(yàn)
基于單因素試驗(yàn)結(jié)果確定范圍,以靈芝孢子幾丁質(zhì)為原料,以殼聚糖的脫乙酰度為因變量,以NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間為自變量,通過(guò)正交試驗(yàn)(表1)進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化,確定靈芝孢子殼聚糖的最佳提取工藝條件。
表1 正交試驗(yàn)各因素及水平
1.2.4 殼聚糖質(zhì)量指標(biāo)分析
本試驗(yàn)以水分、灰分、酸溶性、脫乙酰度、粘度等指標(biāo)對(duì)殼聚糖質(zhì)量進(jìn)行分析,參照GB 29941-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑脫乙酰甲殼素(殼聚糖)》。
1.2.5 數(shù)據(jù)處理
本試驗(yàn)平行組均為3組,結(jié)果取平均值。采用SPSS軟件(SPSS Statistics v18,IBM,UK)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù),采用Excel軟件作圖。
2.1.1 NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)
由圖1可知,靈芝孢子殼聚糖脫乙酰度總體趨勢(shì)隨著NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加,在10%~30%范圍內(nèi)脫乙酰度增加較快,達(dá)到30%以后趨于平緩;殼聚糖產(chǎn)率在質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于30%時(shí)下降較為明顯,可能是隨著NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,殼聚糖分解加劇而導(dǎo)致的[8]。因此,選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的NaOH較為合適。
圖1 NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率影響
2.1.2 溫 度
由圖2可知,靈芝孢子殼聚糖脫乙酰度隨反應(yīng)溫度逐漸增加,幾丁質(zhì)乙酰基在堿的作用下轉(zhuǎn)化為氨基的反應(yīng)更加劇烈,90℃后變化趨緩;正因如此,高溫加劇了殼聚糖分子的降解反應(yīng)[9],導(dǎo)致殼聚糖產(chǎn)率大幅下降。溫度在80℃時(shí)基本可以保證殼聚糖的脫乙酰過(guò)程進(jìn)行,同時(shí)對(duì)于產(chǎn)率影響較小,因此80℃為最適反應(yīng)溫度。
圖2 溫度對(duì)殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響
2.1.3 時(shí)間
由圖3可知,時(shí)間對(duì)殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率影響與NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度相似。脫乙酰度在反應(yīng)進(jìn)行4 h后趨于平穩(wěn),但產(chǎn)率也開(kāi)始快速下降,可能與殼聚糖分解反應(yīng)逐漸加劇有關(guān),因此反應(yīng)時(shí)間控制在4 h能達(dá)到較好的提取效果。
圖3 時(shí)間對(duì)殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響
根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的最適反應(yīng)范圍,以殼聚糖脫乙酰度為單一變量進(jìn)行正交試驗(yàn),結(jié)果如表2所示。其中,9號(hào)試驗(yàn)組的脫乙酰度最高(91.27%),能得到質(zhì)量相對(duì)較好的殼聚糖,可視作試驗(yàn)中最佳反應(yīng)條件。根據(jù)單因素分析法比較表3中F值可知[6],各因素對(duì)殼聚糖脫乙酰度影響程度為NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)>溫度>時(shí)間;由同一水平各因素極差K值大小關(guān)系可知最優(yōu)條件組合為40%NaOH、90℃、4 h,這與獲得最好效果的9號(hào)試驗(yàn)組結(jié)果一致。
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果
表3 正交試驗(yàn)方差分析
采用正交優(yōu)化后的工藝制備靈芝孢子殼聚糖,以殼聚糖產(chǎn)品國(guó)家GB29941-2013標(biāo)準(zhǔn)比較其產(chǎn)品指標(biāo)情況,結(jié)果見(jiàn)表4。所得到的靈芝孢子殼聚糖具有良好外觀品質(zhì),易溶于酸,脫乙酰度較高,且可重復(fù)性好,因此具有較高利用價(jià)值。
表4 靈芝殼聚糖質(zhì)量指標(biāo)
來(lái)源于真菌的殼聚糖產(chǎn)品不但具有殼聚糖良好的性能,同時(shí)也能避免海洋副產(chǎn)物帶來(lái)的不良問(wèn)題,為殼聚糖的應(yīng)用帶來(lái)新的方向,因此十分具有潛力。本試驗(yàn)利用靈芝孢子粉破壁后收集的殘?jiān)苽涞膸锥≠|(zhì)來(lái)提取殼聚糖,既實(shí)現(xiàn)了靈芝孢子粉的高效利用,又為探索一種新來(lái)源的殼聚糖提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
本實(shí)驗(yàn)對(duì)化學(xué)法提取靈芝孢子殼聚糖工藝進(jìn)行優(yōu)化,研究了NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間3個(gè)因素對(duì)于殼聚糖脫乙酰度及產(chǎn)率的影響,并對(duì)提取的靈芝孢子殼聚糖進(jìn)行質(zhì)量指標(biāo)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)靈芝孢子殼聚糖的脫乙酰反應(yīng)影響最為顯著,堿液含堿量越高幾丁質(zhì)脫乙酰過(guò)程越劇烈,殼聚糖脫乙酰度越高。其他兩因素也存在相同的影響趨勢(shì)。但隨著反應(yīng)條件的增強(qiáng),殼聚糖的分解也越強(qiáng)烈,將導(dǎo)致產(chǎn)率大幅下降,因此選擇足夠且較為適度的脫乙酰條件至關(guān)重要。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn),并得到了靈芝孢子殼聚糖提取的最佳工藝:NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%、溫度90℃、水浴時(shí)間4 h,得到的殼聚糖脫乙酰度為91.52%,水分、灰分、粘度等指標(biāo)均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于殼聚糖產(chǎn)品的質(zhì)量要求,這說(shuō)明經(jīng)本試驗(yàn)優(yōu)化后的靈芝孢子殼聚糖提取工藝能達(dá)到較為理想的水平。在后續(xù)試驗(yàn)中,還需對(duì)此殼聚糖理化性質(zhì)、生物活性等進(jìn)一步研究,以達(dá)到綜合分析的目的。