錢小麗

(江蘇旅游職業(yè)學院 烹飪科技學院，江蘇 揚州 225127)

1 概述

發(fā)酵產品的品質受眾多因素的影響，而其中接種量的多少、發(fā)酵溫度的高低、發(fā)酵時間的長短為影響其品質的重要因素。

響應面優(yōu)化設計法(response surface methodology，簡稱RSM),是在考慮各種因素水平的響應值的情況下，尋找預測的相應最優(yōu)值以及相對應的實驗條件，是一種尋找最優(yōu)實驗條件的方法。通過設計實驗、建立模型，以此檢驗模型是否合理，從而找到最佳組合條件，在對過程的回歸擬合、響應曲面和等高線的分析中快速求出各因素水平相應的響應值[1]。

本實驗以經過物理脫毒法符合食用安全的河鲀?yōu)樵?，通過控溫發(fā)酵技術發(fā)酵魚醬，以pH值、氨基酸態(tài)氮、總酸含量為指標，在單因素實驗基礎上，從影響河鲀發(fā)酵魚醬品質的接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度3個維度出發(fā)，分別設3個不同的水平，通過響應面法研究其發(fā)酵條件的優(yōu)化設置，以得出河鲀發(fā)酵魚醬的最佳發(fā)酵狀態(tài)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

菌株：乳酸菌L003、葡萄球菌C07、酵母菌Y04。

原料：河鲀魚肉、香辛料、食用鹽、植物油。

2.2 培養(yǎng)基

MSA、MRS及YPD液體培養(yǎng)基。

2.3 所需設備及儀器

HP250HS型智能恒溫恒濕箱 上海精盛科學儀器有限公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺 青島明博環(huán)?？萍加邢薰?；PHS-3C型數字酸度計 上海楚定分析儀器有限公司；HZ-2010K大型搖瓶柜 常州恒隆儀器有限公司；YXO.SGH280型高壓蒸汽滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠；JIDI-16R臺式多用途高速冷凍離心機 美瑞克儀器有限公司。

2.4 實驗方法

2.4.1 河鲀發(fā)酵魚醬的制備

在液體培養(yǎng)基中加入備選菌株，置于30 ℃的溫度下，經12 h培養(yǎng)后，通過10 min的離心方式(4 ℃，4000 r/min)，去除上清液后，再加入無菌生理鹽水進一步稀釋，并按要求添加。

基本配方：河鲀魚肉200 g、水100 g、食鹽16 g、植物油10 g、香辛料1 g。

處理過程：初步處理河鲀魚肉→絞碎→拌料接種→發(fā)酵→配制→蒸制→裝袋→成品。

2.4.2 不同添菌方法對河鲀發(fā)酵魚醬的影響

接種量：107CFU/g。

發(fā)酵條件：30 ℃溫控，95%相對濕度，時間48 h。

表1 添菌方法對魚醬品質影響的實驗設計Table 1 The experimental design for the effect of adding methods of strains on the quality of fish sauce

2.4.3 不同菌種配比對河鲀發(fā)酵魚醬的影響

接種量：1.0×107CFU/g。

發(fā)酵條件：30 ℃溫控，95%相對濕度，時間48 h。

表2 菌種配比對魚醬品質影響的實驗安排Table 2 The experimental arrangement for the effect of ratios of strains on the quality of fish sauce

2.4.4 擬定菌種發(fā)酵參數

根據前期配比情況，設定參數，具體見表3。

表3 響應面分析因素與水平設計Table 3 The design of factors and levels of response surface methodology

2.4.5 指標測試

2.4.5.1 總酸含量的測定

將5.0 mL的樣品置于100 mL容量瓶中，加水到指定容量，混合均勻后，取出20.0 mL，置于200 mL的燒杯中，加入60 mL的水，同時打開磁力攪拌器，用0.05 N標準NaOH溶液滴定，當酸度計顯示pH 8.2時，記錄下標準NaOH溶液的毫升數。另外取80 mL的水進行試劑空白實驗。

式中：X為樣品中總酸的含量(以乳酸計)，g/dL；V1為測定用樣品稀釋液所需標準NaOH溶液的體積，mL；V2為試劑空白所需標準NaOH溶液的體積，mL；V3為樣品稀釋液取用量，mL；C為NaOH標準溶液的當量濃度；0.09為1 mL 1 N NaOH標準溶液相當于乳酸的克數。

2.4.5.2 氨基酸態(tài)氮含量的測定

采用甲醛滴定法： 將5.0 mL的樣品放入100 mL容量瓶中，加水到指定容量，混合均勻后吸取20.0 mL，將其置于200 mL的燒杯中，加入60 mL的水，同時打開磁力攪拌器，用0.05 N標準NaOH溶液滴定，當酸度計顯示pH 8.2時，加入甲醛溶液10.0 mL，混合均勻。用0.05 N標準NaOH溶液滴定，當酸度計顯示pH 9.2時，記錄下標準NaOH溶液的毫升數。另外開展試劑空白實驗：在80 mL水中滴入0.05 N NaOH溶液，待pH值達到8.2時，再加入甲醛溶液10.0 mL，用0.05 N NaOH標準溶液滴定到pH為9.2即可。

式中：X為樣品中氨基酸態(tài)氮的含量，g/dL；V1為測定用樣品稀釋液加入甲醛后所需標準NaOH溶液的體積，mL；V2為試劑空白實驗加入甲醛后所需標準NaOH溶液的體積，mL；V3為樣品稀釋液取用量，mL；N1為NaOH標準溶液的當量濃度；0.014為1 mL 1 N NaOH標準溶液相當于氮的克數。

2.4.5.3 pH值的測定

準備10.00 g樣品，用90 mL蒸餾水稀釋，邊加入邊攪拌30 min后，使用PHS-3C型數顯酸度計測定其pH值。

2.4.6 數據處理

3次測定后得出平均數。借助SPSS 22.0和Excel 2017對測定結果進行分析，經過單因素方差(ANOVA)發(fā)現，P<0.05為顯著差異。

3 結果與分析

3.1 不同添菌方式對河鲀發(fā)酵魚醬的影響

由表4可知，與其他組對照，當同時添加乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌總酸達到0.106 g/dL時，氨基酸態(tài)氮為0.054 g/dL，此時效果最好。所以，河鲀發(fā)酵魚醬時選擇同時添菌的方式。

表4 不同添菌方式加工的魚醬品質

3.2 不同菌種配比對河鲀發(fā)酵魚醬的影響

由表5可知，相對于空白發(fā)酵，不同菌種配比的各處理組在pH、總酸、氨基酸態(tài)氮方面均有不同；從pH和總酸來看，11號的pH最低而總酸含量最高，其氨基酸態(tài)氮僅次于12號。

表5 不同菌種配比的魚醬性狀Table 5 The characteristics of fish sauce with different ratios of strains

綜上所述，11號(L∶C∶Y 為1∶4∶1)配比成效最優(yōu)。

4 菌種發(fā)酵參數的優(yōu)化

菌種發(fā)酵最佳工藝的響應面實驗情況見表6。

表6 菌種發(fā)酵最佳工藝的響應面實驗情況

選用析因實驗和中心實驗，將析因點作為自變量，將零點作為區(qū)域中心點，取接種量X1、放置溫度X2和放置時間X3三項最高點，進行5次實驗，考量其間誤差,并借助SPSS 22.0對所獲結果進行回歸分析，具體見表7～表9。

表7 河鲀發(fā)酵魚醬pH值回歸模型方差分析結果

續(xù) 表

由表7可知，基于河鲀發(fā)酵魚醬pH值形成的回歸模型尤其顯著(P<0.0001)，確定系數很好。從方差分析結果來看，X2項的P<0.05，說明發(fā)酵溫度影響河鲀發(fā)酵魚醬的pH凸顯。魚醬的pH值在X1、X2兩因素相互作用下變化大(P<0.01)，X2和X3彼此作用影響也極其顯著(P<0.01)。由此可見，此回歸模型可用于河鲀發(fā)酵魚醬pH響應值的預測。

圖1 接種量和發(fā)酵溫度對河鲀發(fā)酵魚醬pH值作用的響應面圖和等高線圖

由圖1可知，當發(fā)酵時間達到48 h時，接種量增加，pH值迅速下降；發(fā)酵溫度上升，pH值的降低速度更快，二者的交互作用明顯。

圖2 接種量和發(fā)酵時間對河鲀發(fā)酵魚醬pH值作用的響應面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation time on the pH value of fermented pufferfish sauce

由圖2可知，當發(fā)酵溫度為30 ℃，接種量較低時，隨著發(fā)酵時間的延長，pH值出現降低；當接種量增加時，pH值則出現下降。由此可見，pH值受接種量和發(fā)酵時間的交互作用影響明顯。

由圖3可知，當接種量為1.0×107CFU/g，發(fā)酵溫度較低時，pH值隨著發(fā)酵時間的增加呈現緩慢下降的趨勢。河鲀發(fā)酵魚醬的pH值與二者的交互作用明顯。

圖3 發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對河鲀發(fā)酵魚醬pH值作用的響應面圖和等高線圖

由以上三維響應面圖和等高線圖可以看出，當接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間發(fā)生變化時，河鲀魚醬氨基酸態(tài)氮的響應值顯現出先降后升的趨勢，其中間水平范圍內的最低點則為河鲀魚醬的最佳pH值。

由表8可知，方差分析結果中，該模型對河鲀發(fā)酵魚醬氨基酸態(tài)氮所構建的回歸模型顯著(P<0.01)。C.V.=21.81%，表明實驗較為可靠。由此可見，河鲀發(fā)酵魚醬氨基酸態(tài)氮的響應值預測可以使用該回歸模型。

表8 河鲀發(fā)酵魚醬氨基酸態(tài)氮回歸模型方差分析結果Table 8 The variance analysis of amino acid nitrogen regression model of fermented pufferfish sauce

由圖4可知，發(fā)酵時間為48 h，接種量不斷增多時，氨基酸態(tài)氮呈現先升后降的趨勢。當發(fā)酵溫度較低時，氨基酸態(tài)氮隨著接種量的增多呈現不斷上升的趨勢，并出現了最高點。

圖4 接種量和發(fā)酵溫度對河鲀發(fā)酵魚醬氨基酸態(tài)氮作用的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation temperature on the amino acid nitrogen of fermented pufferfish sauce

由圖5可知，將溫度控制在30 ℃時，隨著接種量增多，氨基酸態(tài)氮不斷減少。當接種量較少時，發(fā)酵時間不斷延長，氨基酸態(tài)氮先上升到最高點后立即出現減少，接種量和發(fā)酵時間的交互作用顯著。

圖5 接種量和發(fā)酵時間對河鲀發(fā)酵魚醬氨基酸態(tài)氮作用的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation time on the amino acid nitrogen of fermented pufferfish sauce

由圖6可知，在接種量為1.0×107CFU/g時，控制較低發(fā)酵溫度，氨基酸態(tài)氮隨著發(fā)酵時間的延長呈現增加趨勢，當發(fā)酵溫度提升時，感官分值進入峰值后開始減少。

圖6 發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對河鲀發(fā)酵魚醬氨基酸態(tài)氮作用的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of the effects of fermentation time and fermentation temperature on the amino acid nitrogen of fermented pufferfish sauce

由表9可知，方差分析結果中，該模型對河鲀發(fā)酵魚醬總酸所建立的回歸模型顯著(P<0.05)?；貧w診斷表明，模型失擬性檢驗不顯著(P=0.9686>0.05)，C.V.=27.51%，表明實驗較為可靠。由此可見，此回歸模型能作為河鲀發(fā)酵魚醬總酸響應值的模型進行預測。

表9 河鲀發(fā)酵魚醬總酸回歸模型方差分析結果Table 9 The variance analysis of total acid regression model of fermented pufferfish sauce

由圖7可知，當發(fā)酵時間達到48 h且接種量增加時，河鲀發(fā)酵魚醬的總酸平穩(wěn)減少，呈現正相關。當控制較低溫度，接種量提升時，總酸數量降低。當發(fā)酵溫度維持在一定范圍時，總酸變化不明顯。

圖7 接種量和發(fā)酵溫度對河鲀發(fā)酵魚醬總酸作用的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation temperature on the total acid of fermented pufferfish sauce

由圖8可知，當發(fā)酵溫度控制在30 ℃時，隨著接種量增多，總酸數量減少。當接種量較少時，增加發(fā)酵時間，總酸數量減少，發(fā)酵時間對總酸的影響突出。

圖8 接種量和發(fā)酵時間對河鲀發(fā)酵魚醬總酸作用的響應面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation time on the total acid of fermented pufferfish sauce

由圖9可知，接種量為1.0×107CFU/g時，控制較低發(fā)酵溫度，延長發(fā)酵時間，會降低河鲀發(fā)酵魚醬的總酸；當發(fā)酵溫度上升后，河鲀發(fā)酵魚醬的總酸下降速度呈現加快趨勢，河鲀發(fā)酵魚醬總酸受二者交互作用的影響明顯。

圖9 發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對河鲀發(fā)酵魚醬總酸作用的響應面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots of the effects of fermentation time and fermentation temperature on the total acid of fermented pufferfish sauce

表10 河鲀發(fā)酵魚醬回歸方程參數估計Table 10 The estimation of regression equation parameters of fermented pufferfish sauce

借助Design Expert軟件對回歸模型優(yōu)化進行規(guī)范性分析，根據回歸方程的三維響應面圖和等高線圖可知，優(yōu)化河鲀發(fā)酵魚醬的工藝條件具備穩(wěn)定點：X1(-0.02)、X2(-0.04)、X3(-0.04)，對應實際的工藝條件分別為：X1(1.0×107CFU/g)、X2(29.8 ℃)、X3(47.04 h)。

綜上所述，當接種量為1.0×107CFU/g、發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵時間為47 h時，pH值為5.18，氨基酸態(tài)氮為0.283 g/dL，總酸為0.167 g/dL，河鲀發(fā)酵魚醬的質量最好，理論值與實際值之間契合度較高，優(yōu)化模型有效。

5 結果與討論

5.1 不同添菌方式對河鲀發(fā)酵魚醬的影響

乳酸菌在香腸、酸肉等發(fā)酵肉制品中通過其快速產酸作用使產品的pH值降低，抑制腐敗菌的生長繁殖，確保產品的食用安全[2-3]。而隨著乳酸菌的發(fā)酵，pH值不斷降低，低pH值能促進酵母菌的大量繁殖[4]。而周慧敏等分別添加乳酸菌和葡萄球菌及其混合菌種發(fā)酵臘肉，自然發(fā)酵、單一發(fā)酵劑發(fā)酵的臘肉的氨基酸態(tài)氮以及非蛋白態(tài)氮都比接種混合發(fā)酵劑的低[5]。本實驗中對比空白發(fā)酵、單菌發(fā)酵及其他處理組的數據，乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌同時添加時數值更高。

5.2 不同菌種配比對河鲀發(fā)酵魚醬的影響

微生物生長過程中存在協同或者競爭等作用，復合發(fā)酵中菌種的不同組成比例能有效地使發(fā)酵劑發(fā)揮其產酶等特性，產品的品質以及風味的形成也會受到較大影響。譚汝成等接種復合乳酸菌發(fā)酵60 h的魚鲊的感官品質最高，產生大量游離氨基酸，提高必需氨基酸含量和比例；而當植物乳桿菌∶戊糖片球菌為1∶1時，魚鲊中的水溶性蛋白含量較低，這可能與兩種乳酸菌的競爭抑制有關[6]。而李先保等通過研究兔肉發(fā)酵香腸的菌種配比得出當3種發(fā)酵劑以一定的比例組合時，香腸質地柔軟，顏色瑰紅，酸味柔和，切片性好，有彈性，無兔肉腥味[7]。本文在菌種配比對比實驗中發(fā)現，各組的pH、總酸、氨基酸態(tài)氮方面有所不同；其中11號的pH最低，但總酸含量卻最高，其氨基酸態(tài)氮僅次于12號。綜合以上考慮，11號(L∶C∶Y 為1∶4∶1)復合比例效果最好，魚醬的pH、總酸、氨基酸態(tài)氮的水平最佳。

5.3 不同發(fā)酵條件對河鲀發(fā)酵魚醬品質的影響

魚醬品質與接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度的關聯度較高。本實驗選擇這3個因素作為研究對象，與王磊等以接種量、發(fā)酵溫度、菌種比例、發(fā)酵時間4個維度，將指標設定為發(fā)酵魚肉香腸的pH和感官評分，通過復合正交實驗尋求最適發(fā)酵條件相一致[8]。

接種量的多少影響產品的pH值。通常情況下，接種量增加，使所添加的發(fā)酵劑成為優(yōu)勢菌，加快對制品蛋白質和脂肪等物質的分解作用，使制品的pH值發(fā)生變化。康慎敏等研究接種量對發(fā)酵魚塊pH值的影響，隨著發(fā)酵劑添加量的加大，發(fā)酵液的pH值下降速度加快[9]。但接種量并不是越大越好，李璘佼等研究發(fā)現隨著接種量增加，當接種量達到10%時蛋白酶活力最高，但繼續(xù)增加接種量，蛋白酶活力降低[10]。而楊士章等采用響應面法優(yōu)化發(fā)酵鴨的工藝發(fā)現，隨著接種量的增加，復合發(fā)酵劑的產酸能力也不斷增加，而氨基酸態(tài)氮的含量因接種量增多而呈現先升后降的趨勢，同時說明微球菌和酵母菌的生長因pH 值的下降而變得遲緩，進而減弱了其分解鴨胚蛋白質和脂肪的能力[11]，本實驗研究結果與其相一致。

發(fā)酵溫度影響產品的品質。發(fā)酵溫度較低的發(fā)酵過程中乳酸菌等微生物生長更加旺盛。本實驗結果與孟鴛等[12]研究發(fā)酵溫度對甜面醬揮發(fā)性成分的形成及品質的影響是一致的。

發(fā)酵時間影響產品的品質。葉勁松等研究發(fā)酵時間對發(fā)酵豬耳西式火腿品質的影響發(fā)現發(fā)酵時間對產品的感官品質、pH值、火腿出品率都有影響[13]。而在本實驗中發(fā)酵劑對魚醬制品中蛋白質等物質的分解程度和魚醬的總酸和氨基酸態(tài)氮含量受發(fā)酵時間的影響是相一致的。

6 結論

綜合河鲀發(fā)酵魚醬總酸和氨基酸態(tài)氮因添菌方法不同而有所區(qū)別，當乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌同時添加時，其總酸和氨基酸態(tài)氮優(yōu)于其他處理組，所以選擇同時添菌的方式來發(fā)酵河鲀魚醬。相對于空白發(fā)酵來說，不同的菌種配比在pH值、總酸、氨基酸態(tài)氮方面均有不同；從pH值和總酸角度來看，11號的pH值最低，總酸含量最高，其氨基酸態(tài)氮僅次于12號。所以多方面考慮，11號(L∶C∶Y 為1∶4∶1)復合比例效果最好。

采用響應面法設計分析進行河鲀發(fā)酵魚醬實驗，當接種量1.0×107CFU/g、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間47 h時，可以賦予河鲀魚醬良好風味，此時腥味與其他實驗相比最低，呈鮮效果最佳，發(fā)酵品質最好。