陳笑迎，田桂芳，陳智慧，桑亞新，孫紀錄,

（1.河北農業(yè)大學食品科技學院，河北保定 071000；2.云南省曲靖農業(yè)學校生物技術學部，云南曲靖 655000）

水產蛋白在總蛋白資源中占有重要的地位，相較陸地蛋白資源其優(yōu)越性無法替代[1]。由于水產蛋白比其他種類的蛋白質有更良好的乳化性及凝膠特性，因此在食品工業(yè)中的應用更有優(yōu)勢[2]。雖然水產蛋白有著良好的功能特性，但受熱后發(fā)生變性的可能性更高，自然環(huán)境下容易發(fā)生腐敗變質和微生物污染，導致其穩(wěn)定性比大多數陸地蛋白資源要低，其功能特性也會因此受到影響，這對水產蛋白在食品工業(yè)中的應用和新產品的開發(fā)造成了阻礙[3]。

貝類（Shellfish），屬軟體動物，是一種高蛋白、低脂肪的水產資源，現存的種類有11.5萬種。貝類肉質鮮美，營養(yǎng)豐富，在生活中廣受各個年齡階段消費者的喜愛[4]。研究表明，貝類還含有多種活性成分，如?；撬?、蛋白質、多肽、多糖等化合物，因此具有較好的保健功能和藥用價值[5]。我國貝類產量巨大，近年來，由于人工養(yǎng)殖和水產增殖技術的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖貝類的產量逐年提高，到2019年，我國貝類海水養(yǎng)殖產量已達到1500萬噸[6]。我國目前已開展養(yǎng)殖生產或試驗性生產的主要經濟貝類有60多種，而已經能實現規(guī)?；B(yǎng)殖的貝類有20多種，包括牡蠣、貽貝、蛤、蚶、扇貝、鮑及蟶等[7]。研究表明，海洋貝類中含有大量的蛋白質，在水產蛋白中貝類蛋白占據著重要的地位，但是天然貝類蛋白的結構和功能性質并不適合于食品加工領域[7]，因此，對貝類蛋白進行改性有著十分重要的意義。

本文論述了應用物理改性法、化學改性法和酶解改性法三種貝類蛋白改性技術的研究進展，闡述了各種技術對貝類蛋白結構和功能特性的影響，為貝類蛋白在食品工業(yè)中的進一步開發(fā)利用提供了參考。

1 貝類蛋白的氨基酸組成

表1匯總了常見貝類的蛋白質氨基酸組成，可以看出不同貝類蛋白質的氨基酸組成存在著一定的差異[7]，因此，相同的蛋白改性技術作用于不同的貝類蛋白可能會產生不同的影響。用相應的蛋白改性技術處理貝類蛋白，不僅能改變貝類蛋白的構象，還能改善貝類蛋白的一些功能性質[8-9]。基于貝類蛋白所具有的良好營養(yǎng)和功能特性，為了使貝類蛋白資源得到更好的利用，需要將貝類蛋白進行改性以改善蛋白質的某些功能特性，緩解蛋白質資源短缺的現狀，滿足當前的市場需求，使貝類等水產品具有更廣闊的應用市場。

表1 5種常見貝類的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of five common shellfish

2 物理改性法

物理改性法主要是將機械力、振蕩、熱能等物理手段作用于食品原料，對蛋白質的二、三和四級結構造成破壞，從而引起蛋白質功能特性改變的改性手段[10]。物理改性法具有無污染，工藝簡便的特點，在食品原料的加工處理中占有重要的地位[11]。

2.1 熱處理

熱處理是生活中貝類產品最常見的烹飪方式，主要有水煮，清蒸，焙烤，微波加熱等。熱處理對貝類蛋白質的影響較大，且不同的加熱方式對貝類蛋白質會產生不同的影響[12-13]。XIN等[14]用微波處理了南美白對蝦，并檢測了微波處理后蛋白質的二級結構、體外消化率和致敏性。在75 ℃微波10 min下，β-折疊的含量達到最高，同溫度處理15 min后，α-螺旋含量最低。隨著微波溫度的上升，蛋白質體外消化率和總可溶性蛋白含量逐漸降低，總抗氧化能力顯著提高近2倍，致敏性也有所下降。研究表明，微波加熱處理對于水產品蛋白改性有著較為明顯的效果。

林玉鋒等[15]比較了四種不同的加熱方式（清蒸、微波、水煮、焙烤）對牡蠣蛋白的影響。牡蠣蛋白的體外消化率在清蒸、焙烤和微波處理下明顯提高，但水煮后牡蠣蛋白的體外消化率變化不大；另外，蛋白質氨基酸總量在熱處理下均呈現上升趨勢。郭子璇等[16]從牡蠣中提取蛋白質，在水浴鍋中對牡蠣蛋白進行熱處理。結果表明，熱處理后牡蠣蛋白的二級結構發(fā)生了較為顯著的變化，β-轉角減小，無規(guī)則卷曲增加，但三級結構無明顯的變化；同時適當的熱處理使牡蠣蛋白的疏水性增加，且起泡性、持油性和乳化性均有不同程度的改善；但是溫度過高時會使蛋白質重新聚集，其溶解度、持油性和乳化穩(wěn)定性都有所降低。這與ZHANG等[17-18]對熱處理后太平洋牡蠣水溶性、鹽溶性蛋白理化性質和體外消化率的研究結果一致。由此可見，熱處理在一定程度上可以優(yōu)化貝類蛋白的某些功能特性，但加熱時間過長會造成貝類蛋白中許多營養(yǎng)成分的流失，一些生物活性物質會受到破壞，還會對有著特殊風味的貝類產品的色、香、味產生許多負面的影響。

2.2 非熱加工

非熱加工是一類新興的食品加工技術，它可以減少熱加工對蛋白質的色、香、味的影響及營養(yǎng)成分的破壞，尤其是消費者對水產類食品的新鮮、營養(yǎng)和安全要求越來越高，這極大的推動了水產品非熱加工技術的發(fā)展。ZHANG等[19]比較了高壓與傳統(tǒng)的加熱方式對鱈魚蛋白質的影響。研究表明，與烘焙和蒸煮相比，高壓處理后樣品中總肽的含量相對更高，過敏性大幅度降低。高壓處理還能提高可溶性蛋白氮的含量并避免蛋白質發(fā)生氧化，提高了消化率，改善了熱加工帶來的負面性質指標，能更好的改善鱈魚蛋白的理化性質和提高鱈魚的營養(yǎng)價值。表2以牡蠣蛋白為例，比較了熱處理和三種非熱加工技術對蛋白質的影響及優(yōu)缺點，與熱處理相比，大部分非熱加工同樣可以對貝類蛋白的結構和功能性質產生較大的影響，而且非熱加工的缺點比熱處理更小，使貝類營養(yǎng)成分保留的更好，由此可以得出，非熱加工技術在蛋白改性方面有著更好的應用前景。

表2 4種物理改性方法對牡蠣蛋白的影響Table 2 Effects of four physical modification methods on oyster protein

2.2.1 高壓處理

2.2.1.1 超高壓處理 超高壓技術（Ultrahigh pressure processing，UHPP），通常也叫做靜水壓技術（High hydroststic pressure，HHP）。其操作是用液體作為媒介，在適當的溫度下對高壓容器中密封的物料施加靜高壓，一段時間后，高壓會造成物料中許多成分的非共價鍵受到破壞或是重新生成，進而引起酶、淀粉、蛋白質等生物大分子物質失活、糊化與變性，同時還能殺死細菌等微生物[23]。超高壓處理主要破壞貝類蛋白的三、四級結構中的非共價鍵，對共價鍵的改變并不明顯[24]。研究表明，超高壓處理對蛋白質凝膠性能的改變最為明顯，這是因為蛋白質的體積在靜高壓密封容器中會不斷縮小，使構成立體結構的化學鍵被破壞或重新形成，從而導致蛋白質的變性[25-26]。在超高壓改性時，蛋白質結構的變化與壓力的大小有關，低于150 MPa的壓力處理會促進低聚蛋白質的結構解離，高于150 MPa的壓力處理會使蛋白質分離與解鏈后產生的低聚體亞單位再次結合。高于200 MPa的超高壓處理會造成蛋白質的三級結構出現顯著的變化；但其二級結構在高于700 MPa的壓力下才發(fā)生改變，并且此變化是非可逆變性[27]。

趙偉等[20]采用超高壓技術作用于新鮮牡蠣樣品，當超高壓壓力由200 MPa升至600 MPa時，牡蠣肌動蛋白和肌球蛋白內部的自由水溶出，部分蛋白質水解酶的活性增強，致使蛋白質部分水解，游離氨基酸濃度明顯增加。超高壓使牡蠣組織中的部分鹽溶性蛋白質溶出，蛋白質結構之間相互結合的更加緊密，使牡蠣表面的肌纖維結構逐漸消失，牡蠣肉的凝膠性能有所改善。由此可見，在超高壓處理后，牡蠣蛋白質發(fā)生了一定程度的變性，肌纖維的溶解度有所提高，但對蛋白質功能性質的改善只有在壓力較大時（＞700 Mpa）才比較明顯。

2.2.1.2 高壓均質處理 高壓均質技術（High pressure homogenization，HPH）又稱動態(tài)高壓（Hynamichigh pressure，DHP），常用來處理流體[28]。其機制是液體樣品在高壓下通過直徑不大于2 μm的狹窄可變孔隙，之后壓力下降至大氣壓，液體流速在閥兩側壓力差的作用下急劇增加，使液體被均質并對蛋白質分子起到一定的修飾作用，從而改變蛋白質分子的構象和理化性質，改善并優(yōu)化蛋白質的功能性質，在貝類蛋白質的改性中被廣泛地應用[29-30]。

吳凡[21]將牡蠣蛋白懸濁液分別進行不同壓力的高壓均質處理。結果表明，當壓力為80 MPa時，高壓均質使牡蠣蛋白α-螺旋減小的同時生成為β-轉角和無規(guī)則卷曲，蛋白質表面疏水性和游離氨基酸濃度增加，蛋白質粒度明顯減小，Zeta電位絕對值上升。蛋白質分子內的氫鍵被破壞，牡蠣蛋白的溶解度最大，持水性降低，持油性增加，蛋白質乳化性和起泡性均得到改善。但壓力增大到100 MPa時，牡蠣蛋白重新聚集，致使力度增大，溶解度和表面疏水性均減小，對牡蠣蛋白反而會產生負面影響。這與查越[31]用高壓均質處理貽貝蛋白所得的結論相一致。由此可見，用高壓均質對貝類蛋白改性處理時，蛋白質功能性質因壓力逐漸上升會產生不同甚至相反的變化，因此要嚴格把控改性時的參數指標，盡量避免對貝類蛋白的功能性質產生不利影響。

2.2.2 超微粉碎技術 超微粉碎技術是將直徑3 mm以上的物料顆粒放入粉碎設備中，經過處理后可將直徑減小至10～25 μm，大大增加了物料的表面積和空隙率，得到的物料具有獨特的物理和化學性質[32]。貝類蛋白改性一般使用機械粉碎法[33]。機械粉碎是利用設備中的擠壓、摩擦、沖擊和剪切等機械力破碎物料，一般情況下，剪切摩擦力粉碎的物料粒度最細，沖擊粉碎的物料粒度分布最寬，擠壓粉碎的物料粒度最粗[34]。機械粉碎法又可以分為干法粉碎和濕法粉碎，干法粉碎有旋轉球磨式、高頻振動式、氣流式、捶擊式和自磨式等，濕法粉碎主要是膠體磨和均質機[35-36]。超微粉碎技術的應用拓寬了貝類蛋白質深加工的范圍，使貝類產品的溶解性、分散性、吸附性等均有良好的改善，提高了貝類產品的質量。

查越[31]將貽貝蛋白提取后脫脂干燥制成蛋白粉，在20 Hz下用球磨儀處理，對貽貝蛋白進行改性。結果表明，20 min的球磨貽貝蛋白的二、三、四級結構均發(fā)生了不同程度的改變，蛋白粉的亮度也有所增加，顏色更淺。經檢測證明，球磨后貽貝蛋白的α-螺旋減少，β-轉角和無規(guī)則卷曲增加。蛋白質分子的粒徑減小，溶解度減小，表面疏水系數增加，持水性減小，同時持油性增加；體外消化率與游離氨基酸濃度也有明顯的增加。

2.2.3 超聲波技術 超聲波（Ultrasound）是頻率高于20 kHz的機械振動波，是一種綠色環(huán)保的食品加工技術，被廣泛的應用于食品、藥品和農作物等物質的提取和改性[37]。圖1列出了超聲波改性的機制，超聲波機械效應產生的震動可以改善物料的乳化性能和凝膠性能。超聲波在傳播介質質點振動的加速度非常之大，當超聲波的強度在流體物料中上升到一定數值后，空化效應就隨之出現[38]。超聲波在介質中傳播時，會使介質產生壓縮和膨脹（壓縮會產生正壓，而膨脹會產生負壓），并且周期性循環(huán)，將氣泡壓縮回液體。當負壓大于水分子對氣體分子的作用力時，氣體就會從液體中脫離出去，產生的氣泡被稱作空穴氣泡[39-40]。氣泡在快速的周期性振蕩中會發(fā)生劇烈的崩潰，產生短暫的高能環(huán)境，在空穴區(qū)域制造出高剪切力和強湍流作用，同時部分聲波能量會被逐漸接收并轉化為熱量，產生熱效應。在空化過程中，局部的升溫和壓力的瞬時增強會產生聲化學效應，使液體物料中的懸浮顆粒發(fā)生變化。高強度的超聲波技術主要是通過聲場產生的空化效應，使食品物料之間的化學鍵被破壞，暴露出反應位點，大大加快反應的進行速率[41-42]。

圖1 超聲波蛋白改性機制[39]Fig.1 Mechanism of ultrasonic protein modification[39]

低強度的超聲波（＜1 W）常用于檢測食品的理化性質，在食品加工行業(yè)屬于非破壞性技術[43]。高強度的超聲波（＞10 W）則主要用于理化改性，如改善蛋白質理化性質、鈍化酶活性、提高化學反應速率等[44-45]。如TANG等[46]用高強度超聲處理低鹽條件下的羅非魚肌動球蛋白，結果顯示高強度的超聲波改變了肌動球蛋白的構象，蛋白質的溶解性與表面疏水系數均有變化。已有的研究證明，將蛋白質懸濁液進行超聲波處理，蛋白顆粒尺寸及流體動力學動量會因空穴效應而明顯減小[47]，蛋白質的二、三、四級結構會發(fā)生明顯變化，物理、化學性質和乳化、凝膠性質均可得到明顯的改善，同時還可在一定程度上降低水產蛋白的致敏性[48]。

YU 等[22]對不同超聲波處理（20 Hz；200、400、600 W）的牡蠣分離蛋白結構和功能變化進行了研究。研究表明，隨著超聲波功率和超聲時間的增加，α-螺旋含量逐漸降低，而β-折疊和無規(guī)卷曲不斷增加，β-轉角的變化并不顯著。超聲波處理導致蛋白質分子拉伸和折疊，二硫鍵斷裂，游離巰基含量增加，隱藏的疏水基團暴露，從而造成表面疏水系數升高。超聲波還能減小牡蠣蛋白的粒徑，增加Zeta電位絕對值。在600 W超聲波處理15 min時，蛋白質的溶解度達到最大，但同功率下處理時間增加到30 min時，由于蛋白質分子膨脹，疏水基團暴露，反而使蛋白質的溶解度下降。與此同時，超聲波處理后蛋白質的持水能力下降，持油能力增加。此外，起泡性與起泡穩(wěn)定性、乳化活性指數和乳化穩(wěn)定性指數在超聲波處理后均有所增加。這與吳凡[21]對牡蠣蛋白超聲波改性的結果一致。但查越[31]對紫貽貝進行超聲波蛋白改性時，二級結構的變化與上述不同，α-螺旋的百分含量上升，β-折疊和β-轉角的含量上升。表明蛋白質樣品的組成不同，超聲波改性后蛋白質結構與功能特性的變化也不盡相同。

3 化學改性法

化學改性主要是利用化學方法引入新的化學基團或改變蛋白質中某些氨基酸集團，化學改性法有很多種，如常見的糖基化、酰基化、磷酸化在蛋白質資源中應用較多；還有酯化、共價交聯及氧化作用等也可作用于蛋白改性[49]?；瘜W改性法操作簡單，產品穩(wěn)定性高，但由于大多數化學改性會破壞蛋白質的營養(yǎng)價值并且可能會產生有毒物質，有的方法還會對環(huán)境造成一定的污染，目前為止有關貝類蛋白的化學改性研究相對較少，已有的貝類蛋白化學改性方法主要是糖基化[50]。糖基化是還原糖末端與蛋白質分子的氨基或羧基相結合的化學反應[51]，其反應機理如圖2所示，主要分為三個階段，第一階段蛋白質氨基酸殘基末端的氨基與還原糖的羧基結合，進行Amadori分子重排；第二階段受pH的影響生成不同的中間產物；第三階段氨基化合物與醛縮合，生成黑色素和中間產物，最后中間產物也會進一步縮合或聚合生成黑色素。該反應條件溫和安全且只有糖和蛋白質作為反應物，是一種理想的貝類蛋白改性方法[52]。

圖2 蛋白質糖基化改性過程的反應機理[50]Fig.2 Reaction mechanism of protein glycosylation[50]

姜夢云等[53]將3種還原糖與櫛孔扇貝閉殼肌的分離蛋白進行糖基化反應。結果表明，糖基化使扇貝閉殼肌蛋白發(fā)生了一些變化。如賴氨酸的含量顯示出不同程度的降低，果糖胺的含量也出現不同程度的升高。并且在糖基化過程中，溫度和pH的波動也會使蛋白改性的結果產生一些偏差。該研究表明不同的還原糖對糖基化的結果有不同的影響，溫度可以促進反應的進行，且糖的濃度對結果影響不大，但未對改性后蛋白質功能性質的改善及堿溶蛋白糖基化探究。牛改改等[54]用還原糖（葡萄糖、乳糖和半乳糖）對牡蠣蛋白多肽進行了干法糖基化改性，并檢測了產物的功能特性與抗氧化性?？傮w來看，單糖對牡蠣蛋白多肽的改性效果比多糖要好，其中，還原糖與牡蠣蛋白肽組合的料液比不同，對產品的功能特性和抗氧化能力的改善也不相同。綜上所述，糖基化作為常見的化學改性方法，可以改變貝類蛋白的一些功能性質，并且改性結果受還原糖和貝類蛋白的種類影響較大，但對貝類蛋白糖基化后其結構和具體功能性質的變化還需更深入的探究。

4 酶解改性法

酶解改性技術一般是指用蛋白酶對蛋白質溶液進行不同程度的水解，即在蛋白酶的作用下，引起氨基酸殘基的變化，同時多肽鏈也會發(fā)生改變，蛋白質的理化性質受到影響，從而能獲得較好功能特性蛋白質的過程[55]。酶解改性時的影響因素有很多，常見的有溫度、時間、pH、底物濃度、加酶量等，在貝類蛋白酶解改性中，pH、溫度和時間影響最大[56]。貝類蛋白酶解改性常用于收集貝類短肽和生物活性物質以及生產有特殊風味的貝類酶解產品等[57]。酶改性的條件較為溫和，有著高品質、高效率和反應的高度專一化的優(yōu)點，且不會減弱食品原料中蛋白質的營養(yǎng)價值，因此酶改性將具有更大的市場潛力[58]。

對貝類蛋白進行酶解能降低其分子量，得到短肽鏈多肽等具有生物活性的產物，還能提高可電離組分的含量、使更多的疏水基團暴露出來，改變蛋白質與周圍環(huán)境的物理、化學相互作用，增加人體對蛋白質的消化吸收率[59]。貝類根據種類的不同酶解時所使用的酶也不同。貝類酶解使用的酶主要有中性蛋白酶，風味蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶，胃蛋白酶，枯草桿菌酶等[60]，其來源、最適pH和酶切位點見表3。

表3 常用蛋白酶的性質及酶切位點Table 3 Properties and restriction sites of common proteases

高雅鑫等[61]研發(fā)了Box-Benhnke法優(yōu)化中性蛋白酶和風味蛋白酶協同酶解牡蠣蛋白，得到了最佳的工藝條件為：中性蛋白酶:風味蛋白酶=1:1，料水比1:6，加酶量4.7%；改性條件為51.7 ℃、pH7.4下反應3 h。得到的酶解液氨基氮含量為8.197 mg/g，絲氨酸、組氨酸、精氨酸的含量有所升高，由此可見酶解能促進一些呈味氨基酸游離出來，并平衡人體必需氨基酸和非必需氨基酸的比例，改善貝類蛋白的感官指標，此外改性后的產物還含有對視覺、神經發(fā)育及心血管功能有重要作用的生物活性物質—?；撬醄62]。因此酶解不僅能改善貝類蛋白的風味，還有利于增加貝類的營養(yǎng)價值和生物活性物質的含量，并且得到的酶解產物能進一步用于精深加工。柏昌旺[63]研究了牡蠣短肽的酶解工藝，確定了酶解改性牡蠣的最佳工藝條件為：料液比為1:3.9，改性溫度為47 ℃，動物蛋白酶添加量3300 U/g，反應時間為3 h。經工藝優(yōu)化后，酶解改性的加酶量更少，反應時間更短，反應產物的得率更高，且異味更小色澤更好，更適用于后續(xù)的食品加工，該工藝在貝類蛋白精深加工方面有著較好的前景。

貝類蛋白在酶解過程中會產生生物活性肽，目前研究最多的是通過控制貝類蛋白的酶解程度，來獲得具有抗氧化能力的酶解產物。李姣等[64]用海洋芽孢桿菌產的蛋白酶對扇貝蛋白質進行酶解，得到的產物均能顯示一定的自由基清除能力。龐忠莉等[65]優(yōu)化了動物蛋白酶和風味蛋白酶協同酶解牡蠣干酶解液工藝，使水解度可達33.7%，并對其酶解產物進行了體外抗氧化活性評價，結果表明酶解后蛋白質回收率為78.75%，牡蠣干酶解產物具備一定的抗氧化能力，但最終產物的腥味較重，可能不適合直接應用于食品工業(yè)中。張澤等[66]優(yōu)化了中性蛋白酶和胰蛋白酶協同水解牡蠣蛋白工藝，該工藝水解度為27.09%，最終酶解產物的還原能力和較強的DPPH自由基清除能力。綜上可見，貝類蛋白在水解過程中受蛋白酶種類的影響較大，酶解工藝的差異也可能會影響其水解度和生物活性肽的種類，且不同種類的貝類蛋白水解后酶解產物的抗氧化能力和感官指標也不相同。因此，酶解改性的具體機制還需進一步深入挖掘，酶解工藝的優(yōu)化在減少加酶量以降低成本和減少腥味以改良感官品質等方面應進一步改進，使最終酶解產物能更好地適用于食品加工領域。

5 總結與展望

貝類蛋白是極為優(yōu)質的蛋白質資源，物理改性法、化學改性法和酶解改性法均能使貝類蛋白的結構和功能特性有不同程度的改善。物理改性法涉及的蛋白質功能特性改變較多，其中的非熱加工技術基本不影響貝類蛋白的營養(yǎng)價值且產生的負面影響小，在貝類蛋白改性的領域占有重要的地位，但未來可能要考慮降低成本和能耗的問題；化學改性法操作簡單，產品穩(wěn)定，成本較低，但會破壞貝類蛋白的營養(yǎng)價值和一些感官指標，包括糖基化也會產生不利的褐變反應，因此化學改性并非貝類蛋白改性的理想方法；酶解改性法具有較強的專一性，且效率和安全性較高；但酶源及其作用機制需要繼續(xù)探究以便降低酶的應用成本，酶解改性工藝條件的優(yōu)化也需要更深入的研究開發(fā)。因此，在滿足降低成本、提高效率、延長貝類產品的貨架期和保證安全性的同時，想要獲得具有良好功能性質和加工適性的穩(wěn)定貝類蛋白，可以考慮聯合多種改性方法作用于貝類蛋白，尤其是非熱加工技術輔助酶解改性可能在將來成為貝類蛋白改性技術研究的熱點，如超聲波輔助酶解改性等。研發(fā)合適的貝類蛋白改性技術不僅可以很好地解決目前蛋白質資源短缺的問題，還是擴寬貝類蛋白在食品工業(yè)中應用范圍的重要途經。