史劍權(quán) 高 珊 王 雋

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，北京 101149；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科，北京 101149

中國(guó)是世界上22 個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，2019 年中國(guó)新發(fā)結(jié)核病83.3 萬(wàn)例，排名世界第二[1]。這其中，耐藥結(jié)核病又是結(jié)核病防治的難點(diǎn)之一。因此，早期診治耐藥結(jié)核病就顯得尤為重要；這對(duì)藥物敏感性試驗(yàn)（drug susceptibility testing，DST）提出了較高要求。目前，DST 可分為分子（基因）DST 技術(shù)和表型DST 技術(shù)兩種。傳統(tǒng)的表型DST 是診斷耐藥結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)[2]，但是表型DST 操作復(fù)雜，且實(shí)驗(yàn)周期可長(zhǎng)達(dá)1～2 個(gè)月，不能及時(shí)為臨床醫(yī)師提供有效信息，這可能造成治療的延遲[3-4]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的不斷完善，包括PCR 熔解曲線法在內(nèi)的分子DST 不斷顯示出其在診治耐藥結(jié)核病中的優(yōu)勢(shì)[5-6]。美國(guó)胸科協(xié)會(huì)在2019 年有關(guān)耐藥結(jié)核病治療的指南中，也進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了對(duì)結(jié)核病患者及時(shí)獲得表型DST/分子DST 的重要性[7]。然而，表型DST 和分子DST 與實(shí)際抗結(jié)核藥的耐藥情況存在一定差異，部分抗結(jié)核藥DST 的可靠性和臨床應(yīng)用價(jià)值尚未完全確定[8]，仍有不少問(wèn)題值得探討。本研究以傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)DST（表型DST 中的一種）為金標(biāo)準(zhǔn)[3]，進(jìn)一步探討熒光PCR 熔解曲線法（是一種逐漸推廣的分子DST）對(duì)常用抗結(jié)核藥異煙肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星耐藥性的診斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性選取2018 年1 月至2019 年12 月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）住院治療的肺結(jié)核患者，合計(jì)170 例，其中男125 例，女45 例；平均年齡（45.3±18.2）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)三級(jí)醫(yī)師查房，得到臨床確診；均同時(shí)進(jìn)行了異煙肼、乙胺丁醇、喹諾酮藥物的熒光PCR 熔解曲線檢測(cè)，且具有同期的羅氏培養(yǎng)DST 結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并非結(jié)核分枝桿菌肺病的患者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

表型DST（傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)DST）和分子型DST（熒光PCR 熔解曲線法）的結(jié)核菌耐藥性檢測(cè)均在北京結(jié)核病研究所參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。結(jié)核菌羅氏培養(yǎng)DST 由改良的羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)。熒光PCR 熔解曲線法的檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廈門致善生物科技公司。其中，INH 的耐藥基因檢測(cè)位點(diǎn)包括katG315 密碼子、inhA啟動(dòng)子區(qū)（-17～-8 位點(diǎn)）、inhA94 密碼子、ahpC 啟動(dòng)子（-44～-30 及-15～3 位點(diǎn)）。EMB 的耐藥基因檢測(cè)位點(diǎn)包括embB 基因306 位密碼子、406 及497 位密碼子。喹諾酮類藥物耐藥基因的檢測(cè)位點(diǎn)為gyrA 基因88～94 位密碼子。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中診斷試驗(yàn)的評(píng)價(jià)，通過(guò)應(yīng)用MedCalc v19.5.1 軟件，計(jì)算診斷試驗(yàn)中敏感性、特異性、符合率及其95%CI 等基本指標(biāo)。采用Kappa 值反映診斷實(shí)驗(yàn)的一致性水平，采用受試者操作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）下面積（area under the curve，AUC）定量反映診斷實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的大小。其中，Kappa 的判斷標(biāo)準(zhǔn)[9]：Kappa≥0.75，兩者一致性較好；0.4≤Kappa＜0.75，一致性中等；Kappa＜0.4，一致性較差。AUC 的判斷標(biāo)準(zhǔn)[10]：0.5＜AUC≤0.7，說(shuō)明診斷價(jià)值較低；0.7＜AUC≤0.9，診斷價(jià)值中等；AUC＞0.9，診斷價(jià)值較高。

2 結(jié)果

2.1 熒光PCR 熔解曲線法DST 與表型DST 對(duì)抗結(jié)核藥物的藥敏結(jié)果比較

在170 例患者中，熒光PCR 熔解曲線法DST 敏感而表型DST 耐藥的例數(shù)，在異煙肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星分別為5、5、3 例，合計(jì)13 例。熒光PCR熔解曲線法DST 耐藥而表型DST 敏感的例數(shù)，在異煙肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星分別為9、16、24 例，合計(jì)49 例。見表1。

表1 熒光PCR 熔解曲線法DST 與表型DST 對(duì)抗結(jié)核藥物的藥敏結(jié)果比較（例）

2.2 熒光PCR 熔解曲線DST 對(duì)抗結(jié)核藥物異煙肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星耐藥性的診斷效能

以表型DST 為金標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR 熔解曲線DST對(duì)抗結(jié)核藥物耐藥性的診斷效能見表2。兩種方法的總體不一致率，在異煙肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星分別為8.24%、12.35%、15.88%[總體不一致率（%）=（假陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)）/（真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%=1-總符合率（%）]。

表2 熒光PCR 熔解曲線DST 對(duì)抗結(jié)核藥異煙肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星耐藥性的診斷效能

2.3 左氧氟沙星和莫西沙星的耐藥性在表型DST 中比較

根據(jù)表型藥物敏感性試驗(yàn)，170 例結(jié)核菌株，有29 例對(duì)左氧氟沙星耐藥，耐藥率為17.06%。5 例對(duì)莫西沙星耐藥耐藥，耐藥率為2.94%。莫西沙星對(duì)結(jié)核桿菌的耐藥率明顯低于左氧氟沙星（χ2=18.823，P ＜0.01）。見表3。

表3 左氧氟沙星和莫西沙星的耐藥性在表型DST 中比較（例）

3 討論

近年來(lái)，分子DST 因其操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短等特點(diǎn)，日益受到臨床醫(yī)師的認(rèn)可[11]。作為分子DST 中的代表，熒光PCR 熔解曲線法在抗結(jié)核藥物的耐藥性檢測(cè)中，應(yīng)用逐漸增多；但熒光PCR 熔解曲線法的診斷效能，仍需進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)ROC 曲線的AUC 及Kappa 一致性分析及計(jì)算敏感性、特異性、符合率等指標(biāo)，對(duì)我院同時(shí)具有表型DST 和熒光PCR 熔解曲線法DST 檢測(cè)結(jié)果的170 例患者進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以表型DST 為金標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR 熔解曲線法DST 對(duì)異煙肼的Kappa 值為0.821，AUC 為0.917，熒光PCR 熔解曲線法DST 對(duì)異煙肼耐藥性的診斷具有良好的一致性，診斷價(jià)值較高，這與劉艷等[12]、曹志華等[13]、劉春平等[14]的研究結(jié)果類似。熒光PCR 熔解曲線法DST 對(duì)乙胺丁醇耐藥性的診斷效能不如異煙肼，具有中等的診斷價(jià)值，中等的一致性，這與國(guó)內(nèi)曹志華等[13]、李愛芳等[15]的研究結(jié)果類似。乙胺丁醇的耐藥基因型（熒光PCR 熔解曲線法）和耐藥表型之間的一致性偏低[16]，提示仍要加強(qiáng)對(duì)乙胺丁醇耐藥機(jī)制的研究，對(duì)試劑盒增加更多的耐藥基因檢測(cè)位點(diǎn)。

喹諾酮類藥物，包括左氧氟沙星、莫西沙星等，在結(jié)核病特別是耐藥結(jié)核病的治療中，應(yīng)用非常廣泛。由于喹諾酮類藥物熔解曲線試劑盒無(wú)法區(qū)分左氧氟沙星及莫西沙星耐藥，這對(duì)本研究結(jié)果的評(píng)價(jià)，不可避免地造成影響。為了研究熒光PCR 熔解曲線DST對(duì)左氧氟沙星耐藥性的診斷效能，本研究選取左氧氟沙星的表型DST 結(jié)果與喹諾酮的熒光PCR 熔解曲線法DST 結(jié)果作比較（詳見表2 的左氧氟沙星部分），發(fā)現(xiàn)熒光PCR熔解曲線法DST 對(duì)左氧氟沙星的診斷具有中等的一致性（Kappa 值為0.564），診斷價(jià)值中等（AUC 為0.863）。但同時(shí)看兩種DST 的總體符合率，僅為84.12%。并且，本研究中，表型DST 中，莫西沙星的耐藥率（2.94%）明顯低于左氧氟沙星（17.06%）（P ＜0.01）。29 例對(duì)左氧氟沙星耐藥的菌株中，僅有3 例同時(shí)對(duì)莫西沙星耐藥，其余26 例對(duì)莫西沙星敏感。所以，在救治疑難重癥結(jié)核患者的早期，即使當(dāng)喹諾酮類藥物熔解曲線判定結(jié)果為耐藥時(shí)，在臨床上仍可考慮合理使用莫西沙星。在未來(lái)的研究中，需要加強(qiáng)對(duì)喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制的研究，進(jìn)一步區(qū)分左氧氟沙星及莫西沙星的耐藥基因位點(diǎn)，為臨床診治提供更多依據(jù)。

針對(duì)熒光PCR 熔解曲線法DST 和表型DST 檢驗(yàn)結(jié)果存在不一致的問(wèn)題，需要分析結(jié)果不一致的原因。這需要將結(jié)果不一致的情況分以下兩類來(lái)解讀。

（一）熒光PCR 熔解曲線法DST 敏感而表型DST耐藥。這種情況在本研究中合計(jì)13 例。這其中可能的原因是：①本實(shí)驗(yàn)熒光PCR 熔解曲線試劑盒未包括所有已知的耐藥基因突變位點(diǎn)，比如，基因embC 突變也可導(dǎo)致治結(jié)核藥耐藥[16]，但此種試劑盒的檢測(cè)位點(diǎn)并不包括基因embC 基因。②仍有未知的耐藥基因位點(diǎn)。③其他耐藥機(jī)制引起的耐藥，如：結(jié)核菌細(xì)胞壁滲透性障礙；結(jié)核菌表達(dá)藥物外排泵以排出抗結(jié)核藥物等；結(jié)核菌中的雙組分系統(tǒng)[17]。

（二）熒光PCR 熔解曲線法DST 耐藥而表型DST敏感。這種情況在本研究中合計(jì)49 例。這其中可能的原因是：①結(jié)核菌基因發(fā)生了同義突變[18-19]，即基因片段中某個(gè)堿基對(duì)的突變并沒(méi)有引起相應(yīng)氨基酸的改變，從而不會(huì)影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。基因發(fā)生同義突變的結(jié)核菌，其對(duì)抗結(jié)核藥的敏感性并不會(huì)改變，從而導(dǎo)致兩種DST 檢測(cè)結(jié)果的不一致。②異質(zhì)性耐藥，就是同一檢測(cè)樣本（如痰）中，同時(shí)存在基因型敏感和基因型耐藥的菌株。結(jié)核桿菌的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，在國(guó)內(nèi)外的研究中均有報(bào)道[20-22]。因?yàn)楫愘|(zhì)性耐藥也可能是結(jié)核菌群從部分耐藥向完全耐藥轉(zhuǎn)變的一個(gè)過(guò)程[23]，所以，當(dāng)熔解曲線出現(xiàn)“假陰性”、兩種耐藥性檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，需要警惕異質(zhì)性耐藥的可能性，定期復(fù)查熒光PCR 熔解曲線法DST和表型DST，及時(shí)調(diào)整抗結(jié)核方案。

熒光PCR 熔解曲線法DST 能夠?qū)ΤＲ姷目菇Y(jié)核藥物都做出檢測(cè)，具有高通量、檢測(cè)時(shí)間短（2～3 h）、實(shí)驗(yàn)室污染風(fēng)險(xiǎn)小的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，熔解曲線法DST 與傳統(tǒng)的表型DST 比較，還更具成本-效益[24]。在實(shí)際工作中，應(yīng)用熒光PCR 熔解曲線法可以及時(shí)為臨床制訂抗結(jié)核方案提供依據(jù)[25-26]，這有助于改善結(jié)核病的治療延遲，減少耐藥結(jié)核病的傳播。同時(shí)，還需應(yīng)用表型DST 等傳統(tǒng)方法，對(duì)熒光PCR 熔解曲線法DST 的結(jié)果進(jìn)行修正。

總之，熒光PCR 溶解曲線法對(duì)異煙肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星的耐藥性有較好的輔助診斷價(jià)值，值得進(jìn)一步推廣。熒光PCR 溶解曲線法與傳統(tǒng)的表型DST應(yīng)結(jié)合應(yīng)用，互為補(bǔ)充，共同助力耐藥結(jié)核病的診療。