陳若洋 李大偉 吳佳晉 瞿俊文 孫 楠 張 明 袁曉東

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿科，上海 200120

腎移植是目前終末期腎臟病最有效的治療手段[1]。腎臟缺血再灌注損傷是腎移植臨床上一個相對突出的問題，輕則造成移植后早期腎功能不全，重則導(dǎo)致術(shù)后移植物無功能[2]。有研究表明腎臟缺血再灌注損傷還是腎移植后遠(yuǎn)期腎功能減退、腎纖維化及慢性排斥的重要誘因[3-7]。移植腎穿刺病理是判定移植腎缺血再灌注損傷程度的金標(biāo)準(zhǔn)[8]，但是因其為有創(chuàng)性操作且不易反復(fù)進(jìn)行，在移植術(shù)后早期的應(yīng)用受到限制。因此，需一種無創(chuàng)性的方法，早期、安全、準(zhǔn)確地評價移植腎的缺血再灌注損傷程度。

供體來源的細(xì)胞游離DNA（donor-derived cell-free DNA，dd-cfDNA）可以用于監(jiān)測移植物的狀態(tài)[9-10]，能夠特異性地反映移植腎發(fā)生的細(xì)胞損傷，并且其增加的幅度與損傷的嚴(yán)重程度成正比，目前多用于檢測腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生[11]。

本研究將dd-cfDNA%應(yīng)用在腎移植術(shù)后移植腎缺血再灌注方面，擬分析dd-cfDNA%在移植腎缺血再灌注后不同時間段的表達(dá)并進(jìn)一步分析臨床使用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究納入2020 年3 月1 日至5 月31 日于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腎移植中心接受同種異體腎移植術(shù)的患者，其中男28 例，女12 例；年齡32～68 歲，平均（41.5±11.8）歲。

在移植手術(shù)前，所有患者均被告知并同意接受在手術(shù)后按照研究方案進(jìn)行采血并檢測dd-cfDNA%，并得到了倫理學(xué)支持和批準(zhǔn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①供受者＞18 歲；②公民逝世后器官捐獻(xiàn)的單腎移植；③初次移植；④簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期婦女；②接受多器官或多次移植（包括器官、組織、細(xì)胞、輸血等）；③惡性腫瘤；④感染（包括供體來源性及自身感染）；⑤移植腎功能延遲恢復(fù)及發(fā)生排斥反應(yīng)。

1.3 治療方案

所有患者均采用以下免疫抑制方案：抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白或巴利昔單抗聯(lián)合甲強(qiáng)龍進(jìn)行免疫誘導(dǎo)，隨后口服鈣調(diào)磷酸酶抑制劑和嗎替麥考酚酯類及潑尼松進(jìn)行免疫維持治療。

1.4 細(xì)胞游離DNA 的采集和檢測

用dd-cfDNA%采血管（Streck，美國，218962）收集腎移植患者的外周血樣本，用離心機(jī)以1600 g 離心10 min，從上清液中提取dd-cfDNA%，用循環(huán)核酸試劑盒進(jìn)行檢測（Qiagen，德國，OSR-M105），之后采用Bayes 方法對dd-cfDNA%水平進(jìn)行了定量[12]。

1.5 腎功能的判定

用受試者血清肌酐來衡量腎功能。一次性普通血清管（貝登，南京，20192410083）收集患者血清，利用肌酐測定試劑盒（ECRE-2，美國，YZB/USA1823-2012），采用肌氨酸氧化酶終點(diǎn)法對受試者肌酐進(jìn)行檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用R 3.5.3 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）和四分位數(shù)間距（IQR）表示，采用單因素重復(fù)測量方差分析比較受試者術(shù)后不同時間點(diǎn)的dd-cfDNA%含量和肌酐，使用Shapiro-Wilk 檢驗正態(tài)分布，若因變量的方差協(xié)方差矩陣不滿足Mauchly’s 球形假設(shè)，則采用經(jīng)Greenhouse-Geisser 方法校正后的單因素重復(fù)測量方差分析結(jié)果。如果整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義，再通過Bonferroni Post Hoc 檢驗進(jìn)行時間因素的兩兩比較。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納入分析人群的移植腎功能恢復(fù)情況

納入分析的40 例腎移植術(shù)后患者，術(shù)后腎功能恢復(fù)順利（圖1），無移植腎功能延遲恢復(fù)及排斥反應(yīng)的發(fā)生。通過單因素重復(fù)測量方差分析方法，分析肌酐測量值在腎移植術(shù)后不同時間點(diǎn)的變化情況。經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗，各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布（P ＞0.05），由于數(shù)據(jù)不滿足Mauchly’s 球形假設(shè)檢驗（P ＜0.01），采用Greenhouse-Geisser 方法校正結(jié)果。整體分析發(fā)現(xiàn)：肌酐測量值在3 個時間點(diǎn)的整體比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（F=149.32，P ＜0.01）。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)任意2 個時間點(diǎn)的肌酐測量值比較，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。術(shù)后第3 天的肌酐測量值比術(shù)后第1 天降低245.65 μmol/L（95%置信區(qū)間：172.70～318.60 μmol/L）；術(shù)后第7 天的肌酐測量值較術(shù)后第3 天進(jìn)一步降低195.95 μmol/L（95%置信區(qū)間：153.02～238.88 μmol/L）。見圖1。

2.2 dd-cfDNA%在移植腎缺血再灌注后不同時間段的表達(dá)情況

通過單因素重復(fù)測量方差分析方法，分析ddcfDNA%在移植腎缺血再灌注后不同時間點(diǎn)的表達(dá)情況。經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗，各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布（P ＞0.05），由于數(shù)據(jù)不滿足Mauchly’s 球形假設(shè)檢驗（P ＜0.01），采用Greenhouse-Geisser 方法校正結(jié)果。整體分析發(fā)現(xiàn)：dd-cfDNA%在3 個時間點(diǎn)測量值的整體比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（F=320.38，P ＜0.01）。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)任意2 個時間點(diǎn)的dd-cfDNA%濃度比較，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。術(shù)后第3 天的dd-cfDNA%濃度比術(shù)后第1 天降低8.97%（95%置信區(qū)間：7.71%～10.24%）；術(shù)后第7 天的ddcfDNA%濃度較術(shù)后第3 天進(jìn)一步降低1.63%（95%置信區(qū)間：1.32%～1.94%）。見圖2。

3 討論

根據(jù)文獻(xiàn)報道，腎臟的缺血再灌注損傷會造成移植腎生理功能的損傷。例如，短期內(nèi)表現(xiàn)為移植物功能延遲恢復(fù)、急性排斥反應(yīng)的增加[13]，長期的影響則會造成移植腎纖維化，從而降低移植腎的存活率[3-4]。目前，對于腎臟缺血再灌注損傷的評估多集中于移植前，主要從以下幾個方面考慮：供體臨床資料的評估，供者年齡，供者獲取前低血壓、低血氧過程，有無心肺復(fù)蘇史，冷熱缺血時間，零點(diǎn)穿刺病理[14]。移植術(shù)前腎臟的生理病理學(xué)變化固然重要，但是，對于腎移植手術(shù)血流開放后再灌注造成的損傷也具有討論意義[15]。移植腎在受者體內(nèi)再灌注時，因為缺血再灌注本身是最強(qiáng)有力的固有免疫激活因素之一[16]，同時由于供受者基因背景的差異，往往會引起炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的合成釋放介導(dǎo)腎臟缺血再灌注損傷后免疫反應(yīng)，這樣一個過程會使得移植腎缺血再灌注損傷的影響更大。但是，對于這樣一個過程，目前仍沒有合適的評價指標(biāo)來進(jìn)行評估。

細(xì)胞游離DNA 在器官移植領(lǐng)域通常應(yīng)用于移植術(shù)后排斥反應(yīng)的無創(chuàng)性診斷，在既往研究中，發(fā)現(xiàn)dd-cfDNA%濃度分?jǐn)?shù)＜1%提示無急性排斥反應(yīng)，＞1%提示可能發(fā)生急性排斥反應(yīng)[11]。dd-cfDNA%也用于評估受者的免疫抑制狀態(tài)，并根據(jù)此調(diào)整患者的免疫抑制劑的用法和用量，制訂個體化的治療方案[17-18]。

在本研究中，本課題組分析了dd-cfDNA%在腎移植術(shù)后移植腎缺血再灌注后不同時間點(diǎn)的表達(dá)，提出了dd-cfDNA%可以作為一個簡單快速的指標(biāo)來檢測腎移植術(shù)后腎臟缺血再灌注損傷程度。在不同時間點(diǎn)，受者外周血中dd-cfDNA%含量的表達(dá)不同，而且隨著時間的推移，dd-cfDNA%含量逐步下降，最終維持在穩(wěn)定區(qū)間。

腎臟缺血再灌注損傷和移植腎植入后的免疫反應(yīng)是腎移植術(shù)后1 周內(nèi)造成移植腎損傷的最主要的病理生理過程。由于供受者雙方基因差異，腎移植術(shù)后長期存在移植腎的免疫反應(yīng)。本課題組觀察到dd-cfDNA%在腎移植術(shù)后早期明顯升高，可達(dá)到20%左右，而對于移植后功能穩(wěn)定期的患者，dd-cfDNA%保持在較低水平，往往＜1%[19-20]。當(dāng)移植腎發(fā)生急性排斥反應(yīng)時，dd-cfDNA%會明顯升高，但即使是嚴(yán)重的排斥反應(yīng)，dd-cfDNA%升高幅度有限，在1%～3%之間[21-24]，遠(yuǎn)低于腎移植術(shù)后早期的dd-cfDNA%。同時，在動物實驗中，通過腎臟缺血再灌注后的腎臟病理切片可以證明腎臟缺血再灌注損傷程度在復(fù)灌24 h 達(dá)到高峰，之后腎小管啟動自我修復(fù)機(jī)制[6，25]。在1 周后急性腎小管損傷的特征消失，這與本課題組臨床觀察的dd-cfDNA%的變化趨勢是類似的。

因此，本課題組認(rèn)為腎臟缺血再灌注損傷是造成腎移植術(shù)后早期dd-cfDNA%明顯升高的主要原因，且腎移植術(shù)后早期受者體內(nèi)dd-cfDNA%與腎臟缺血再灌注損傷及修復(fù)之間存在關(guān)聯(lián)性，值得深入研究。

綜上所述，本研究納入40 例腎移植術(shù)后早期的患者，通過分析受者外周血中dd-cfDNA%含量，得出在腎移植術(shù)后早期，dd-cfDNA%含量較高，并隨著時間的推移逐步降低，在術(shù)后第7 天下降至基線水平。由此得出結(jié)論，dd-cfDNA%在腎移植術(shù)后移植腎缺血再灌注的不同時間段有差異性表達(dá)，對移植腎缺血再灌注損傷程度的評估具有一定價值。

本研究的局限與不足：本研究納入的樣本量較少，未納入親屬供腎受者及術(shù)后發(fā)生移植腎功能延遲恢復(fù)和其他并發(fā)癥的患者。后續(xù)會開展進(jìn)一步的研究，來檢測不同受者人群在術(shù)后不同階段的dd-cfDNA%的表達(dá)。