朱雨菲 郭宇鑫 王利瑩 李 矜 張濤靜

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100078

國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)統(tǒng)計(jì)2019 年中國(guó)20～79 歲糖尿病患病人數(shù)約1.16 億，位居世界榜首[1]。病程進(jìn)展中60%～70%的患者會(huì)患上神經(jīng)病變，以糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）最多見(jiàn)[2]，DPN 以肢體末端麻木疼痛、腱反射減弱消失為主要癥狀[3]，給患者健康及生活造成負(fù)擔(dān)[4]。DPN 是多因素共同作用的結(jié)果，晚期糖基化終產(chǎn)物途徑、氧化應(yīng)激、炎癥作用、RNA 非編碼調(diào)節(jié)等因素均發(fā)揮了直接或間接的作用[5-7]。高糖環(huán)境提高背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（dorsal root ganglion neuron，DRGn）細(xì)胞凋亡水平是導(dǎo)致DPN 及其進(jìn)展的重要機(jī)制[8-9]。本研究旨在觀察糖絡(luò)寧對(duì)高糖下DRGn 細(xì)胞凋亡水平及絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，以探索糖絡(luò)寧治療DPN 的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及環(huán)境

臨產(chǎn)期SPF 級(jí)和60 只（215±15）g 清潔級(jí)6～8 周SD 雄性大鼠，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）20160006，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于大鼠SPF 級(jí)屏障環(huán)境中[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2019-0013]，溫度（20±2）℃，濕度45%～65%，12 h 明暗交替。實(shí)驗(yàn)流程由北京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)論證通過(guò)（編號(hào)：BUCM201738）。

1.2 主要藥物及試劑

由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑室提供約為生藥0.5 g/ml 糖絡(luò)寧制劑（黃芪15 g、生地黃12 g、當(dāng)歸15 g、狗脊15 g、牛膝12 g、木瓜15 g、丹參15 g、川續(xù)斷10 g）。兔抗p-JNK1（貨號(hào)：ab110724）、JNK1（貨號(hào)：ab47337）、p-c-Jun（貨號(hào)：ab32137）、c-Jun（貨號(hào)：ab30620）、p-Map3k8（貨號(hào)：ab217684）、Map3k8（貨號(hào)：ab51214）購(gòu)自Abcam 公司。葡萄糖（貨號(hào)：15023021），Neurobasal 培養(yǎng)基（貨號(hào)：21103049）購(gòu)自Gibco。Annexin V-FITC/PI Kit/凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：FXP018）購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司。BCA 蛋白定量試劑盒（貨號(hào)：MD913053）購(gòu)自MDL。

1.3 主要儀器

倒置顯微鏡（DS126281）購(gòu)自日本Canon 公司，電泳儀（BG-subMIDI）購(gòu)自北京百晶生物技術(shù)有限公司，低溫離心機(jī)（3-30K）購(gòu)自德國(guó)Sigma 公司，體視顯微鏡（XTL-165）購(gòu)自江西鳳凰光學(xué)科技有限公司，凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc-It310）購(gòu)自美國(guó)UVP 公司。

1.4 研究方法

1.4.1 制備含藥血清 制備含藥血清參照前期研究[10-11]。60 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組和高、中、低濃度糖絡(luò)寧組，每組15 只。糖絡(luò)寧組分別予組方生藥5、2.5、1.25 g/（kg·d）灌胃，正常組予等量蒸餾水灌胃，2 次/d，連續(xù)10 d，期間自由飲食。末次灌胃后2 h 內(nèi)自大鼠腹主動(dòng)脈取血，以3000 r/min離心10 min（離心半徑95 mm），分離血清，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌，-80℃存用。

1.4.2 DRGn 細(xì)胞取材、培養(yǎng) 細(xì)胞取材培養(yǎng)參照既往研究[12-13]及前期實(shí)驗(yàn)[10-11]。將培養(yǎng)好的細(xì)胞隨機(jī)分為正常組，高糖組，低、中、高濃度糖絡(luò)寧組。正常組用含10%正常大鼠血清和Neurobasal 培養(yǎng)基（含25%葡萄糖），高糖組按前期結(jié)果[11]在正常組基礎(chǔ)上加50 mmol/L葡萄糖，糖絡(luò)寧組在高糖組基礎(chǔ)上加10%低、中、高濃度糖絡(luò)寧含藥血清。各組均設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24 h。

1.4.3 流式法檢測(cè)DRG 細(xì)胞凋亡水平 將培養(yǎng)24 h 的細(xì)胞消化收集，制備細(xì)胞懸液（1×105/ml～5×105/ml）。按Annexin V-FITC/PI Kit/凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，室溫避光將5 μl Annexin V/FITC 和100 μl 細(xì)胞懸液混勻，孵育5 min 后加入400 μl PBS 和10 μl PI，1 h內(nèi)檢測(cè)凋亡情況。采用CellQuest 軟件繪制雙色散點(diǎn)圖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.4 Western blot 法檢測(cè)DRG 中MAPKs 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 冰浴條件下裂解細(xì)胞，提取總蛋白。制備SDS-PAGE 電泳，據(jù)BCA 蛋白定量結(jié)果，將樣品加入SDS-PAGE 凝膠加樣孔中，電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫下于5%脫脂奶粉中搖床上封閉1 h，分別孵育一抗p-JNK1（1∶1000）、JNK1（1∶1000）、p-c-Jun（1∶500）、c-Jun（1∶1000）、p-Map3k8（1∶1000）、Map3k8（1∶100），4℃過(guò)夜，TBST 洗滌10 min，重復(fù)3 次，同樣條件下孵育二抗（1∶4000）1 h，TBST 洗膜，電化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑顯色、成像。Image-Pro Plus6.0 軟件分析所得蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組DRGn 細(xì)胞凋亡率比較

高糖組細(xì)胞凋亡率顯著高于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；糖絡(luò)寧各組細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），中濃度糖絡(luò)寧組細(xì)胞凋亡率低于高、低濃度糖絡(luò)寧組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組細(xì)胞凋亡率比較（%，，n=3）

表1 各組細(xì)胞凋亡率比較（%，，n=3）

注 與正常組比較，aaP ＜0.01；與高糖組比較，bbP ＜0.01；與低濃度糖絡(luò)寧組比較，ccP ＜0.01；與高濃度糖絡(luò)寧組比較，ddP ＜0.01

2.2 各組MAPKs 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

高糖組p-JNK1、p-c-Jun、Map3k8、p-Map3k8 表達(dá)及p-JNK1/JNK1、p-c-Jun/c-Jun、p-Map3k8/Map3k8比值明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05或P ＜0.01），高糖組與正常組JNK1、c-Jun 表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；糖絡(luò)寧各濃度組p-JNK1、p-c-Jun、p-Map3k8 表達(dá)及p-JNK1/JNK1、p-c-Jun/c-Jun、p-Map3k8/Map3k8 比值明顯低于高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01 或P ＜0.05）；中濃度糖絡(luò)寧組p-JNK1、p-c-Jun、p-Map3k8 表達(dá)及p-JNK1/JNK1、p-c-Jun/c-Jun、p-Map3k8/Map3k8 比 值明顯低于高、低濃度糖絡(luò)寧組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；中、低濃度糖絡(luò)寧組c-Jun 表達(dá)低于高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），糖絡(luò)寧各濃度組JNK1、Map3k8 及c-Jun 表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組MAPKs 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（，n=3）

表2 各組MAPKs 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（，n=3）

注 與正常組比較，aP ＜0.05，aaP ＜0.01；與高糖組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01；與低濃度糖絡(luò)寧組比較，ccP ＜0.01；與高濃度糖絡(luò)寧組比較，ddP ＜0.01

3 討論

臨床研究[14-15]證實(shí)糖絡(luò)寧療效顯著，但其機(jī)制仍有待研究。既往實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖絡(luò)寧通過(guò)促進(jìn)PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制PERK 通路[16]，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中IRE1α等蛋白表達(dá)[17]，降低Bax/Bcl-2 比值[18]等，抑制細(xì)胞凋亡。

研究表明MAPKs 信號(hào)通路的激活與神經(jīng)細(xì)胞凋亡有密切聯(lián)系[19-20]。MAPKs 通路主要包括ERK1/2、JNK、p38MAPK[21-23]，可通過(guò)連續(xù)酶促反應(yīng)，將胞外信號(hào)通過(guò)磷酸化傳至胞內(nèi)，參與增殖、分化、凋亡等過(guò)程。JNK1、Map3k8 為該通路中參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性激酶。Map3k8 磷酸化后激活MAPK 激酶1/2[24]，進(jìn)而激活并磷酸化ERK1/2。實(shí)驗(yàn)[25-27]顯示高糖環(huán)境可激活JNK、ERK1/2 途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。c-Jun 為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，能被JNK1 磷酸化，調(diào)節(jié)下游凋亡靶基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)FasL、TNF 等死亡配體表達(dá)，與死亡受體Fas、TNFR 合成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物，最終使caspase酶活化，通過(guò)死亡受體途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]。

本研究結(jié)果顯示，高糖刺激可提高DRGn 細(xì)胞凋亡水平和p-JNK1、p-c-Jun、p-Map3k8 蛋白表達(dá)，提示高糖可使MAPKs 通路激活，上調(diào)細(xì)胞凋亡水平。經(jīng)糖絡(luò)寧含藥血清作用后，糖絡(luò)寧各濃度組細(xì)胞凋亡水平及p-JNK1、p-c-Jun、p-Map3k8 蛋白表達(dá)明顯低于高糖組，糖絡(luò)寧含藥血清對(duì)細(xì)胞凋亡及MAPKs 通路的作用與高糖刺激下相反，即糖絡(luò)寧對(duì)該通路有抑制作用，同時(shí)可抑制DRGn 細(xì)胞凋亡。MAPKs 通路在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，結(jié)合本研究結(jié)果顯示高糖刺激可激活該通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而糖絡(luò)寧可通過(guò)抑制MAPKs 信號(hào)通路來(lái)降低DRGn 細(xì)胞凋亡水平，從而延緩DPN 進(jìn)展。這可能是糖絡(luò)寧治療DPN的機(jī)制之一，但其具體作用成分尚未明確，仍有待研究。