姚根宏，李曉靜，黃賽賽，潘卿蕓，王世穎，趙成

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，南京210008；2.南京大學(xué)金陵學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，南京 210089)

原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren′s syndrome, pSS)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫病，主要侵犯淚腺、唾液腺等外分泌腺，典型癥狀表現(xiàn)為口、眼干燥[1]。pSS腺體外并發(fā)癥可累及肺臟、甲狀腺、腎臟等多器官和系統(tǒng)。pSS相關(guān)肺疾病常常表現(xiàn)為間質(zhì)病變，引發(fā)間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease, ILD)[2]。SS相關(guān)ILD(SS-ILD)是患者致殘和致死的主要原因。因此，深入研究 SS-ILD 發(fā)病機(jī)制，探索有效治療方法，具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。

干擾素(interferon，IFN)信號(hào)在機(jī)體免疫防御和免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，I型干擾素(IFN-I)在免疫失調(diào)導(dǎo)致的自身免疫病發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[3]。IFN-β是IFN-I主要成員之一，近年來(lái)的研究表明IFN-β在SS發(fā)病中也發(fā)揮重要作用[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，IFN-β等活化導(dǎo)致SS模型小鼠唾液腺功能受損，而阻斷干擾素受體能改善癥狀[5]。但是，IFN-β參與SS-ILD的具體機(jī)制不明。本研究旨在探討IFN-β在SS-ILD患者中的表達(dá)，分析其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，并研究IFN-β調(diào)控巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的機(jī)制，以期為揭示SS-ILD的發(fā)病機(jī)制和治療提供新依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 收集2018年1月至2020年12月于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院風(fēng)濕免疫科診治的SS患者。共40例SS患者入組，男性5例，女性35例，年齡22～73歲，其中SS-ILD和不并發(fā)ILD的SS患者各20例。所有患者的診斷符合2016年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism, ACR/EULAR)pSS分類標(biāo)準(zhǔn)[6]。通過胸部高分辨CT證實(shí)ILD存在。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他結(jié)締組織病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、多發(fā)性肌炎/皮肌炎和混合型結(jié)締組織??；其他疾病導(dǎo)致的ILD、慢性阻塞性肺疾病、急性肺部感染、呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤、肺栓塞等。采用EULAR干燥綜合征疾病活動(dòng)性指數(shù)(EULAR Sj?gren′s syndrome disease activity index, ESSDAI)對(duì)SS患者活動(dòng)度進(jìn)行評(píng)分[7]。30名來(lái)自南京鼓樓醫(yī)院體檢中心的健康志愿者作為對(duì)照組，性別和年齡與SS組匹配。其中,女性26名,男性4名，年齡23～68歲。本研究經(jīng)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20190413)，各研究對(duì)象均知情同意。

1.2主要試劑與儀器 人IFN-β和IL-6 ELISA試劑(美國(guó)R&D公司)，人THP-1細(xì)胞系(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR Green PCR Master Mix(諾唯贊公司)，培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)，胎牛血清(美國(guó)Sciencecell公司)，牛血清清蛋白(BSA,美國(guó)Sigma-adlrich公司)，佛波酯(南京福麥斯公司)，重組人IFN-β(R&D systems公司)；Onedrop超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)，普通PCR儀(日本TaKaRa公司)，StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)，Synergy HT酶聯(lián)儀(美國(guó)BioTek公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)。

1.3血漿中IFN-β和IL-6檢測(cè) 留取健康人對(duì)照者和SS患者2 mL外周抗凝血，400×g離心10 min，分離血漿，并于-80℃冰箱冷凍保存。用ELISA法檢測(cè)血漿IFN-β和IL-6水平，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4人THP-1細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 人THP-1細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將傳代培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，在含有0.3% BSA的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液中加入100 ng/mL佛波酯，培養(yǎng)72 h誘導(dǎo)分化。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，鑒定細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。

1.5重組人IFN-β對(duì)巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-6的影響 用40 pg/mL重組人IFN-β處理THP-1細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞24 h，收集培養(yǎng)上清，-80 ℃冰箱冷凍保存，用于ELISA法檢測(cè)IL-6水平。按照Trizol試劑說(shuō)明書提取培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞總RNA；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；然后取cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，擴(kuò)增人IL-6和內(nèi)參基因GAPDH。引物由金斯瑞生物科技公司設(shè)計(jì)和合成，引物序列如下。人IL-6上游引物：5′-TGCGCAGCTTTAAGGAGTTC-3′，下游引物：5′-CCCATGCTACATTTGCCGAA-3′；人GAPDH上游引物：5′-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′，下游引物：5′-CAATGCCAGGGTACATGGTG-3′。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，包含AceQ qPCR SYBR Green Mix (2×) 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，DNA模板1 μL，滅菌水8.2 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。在60 ℃時(shí)收集每個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，進(jìn)行熔解曲線分析。用實(shí)時(shí)定量PCR儀自帶軟件分析擴(kuò)增曲線和熔解曲線中的熒光信號(hào)，并計(jì)算平均循環(huán)閾值(Ct)數(shù)，以GAPDH作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法計(jì)算待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad 7.0軟件進(jìn)行。正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布定量數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù))表示，兩組之間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SS患者IFN-β增加且與疾病活動(dòng)度相關(guān) 與健康人對(duì)照者血漿IFN-β水平[(4.94±0.73) pg/mL]相比，SS患者血漿中IFN-β[(8.98±0.79)pg/mL]明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.753,P=0.004)。分析SS患者血漿IFN-β與疾病活動(dòng)度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)血漿IFN-β水平與ESSDAI呈顯著正相關(guān)(r=0.456,P=0.011 3)，見圖1。

圖1 血漿IFN-β與SS患者疾病活動(dòng)度評(píng)分(ESSDAI)相關(guān)性分析

2.2SS-ILD患者IFN-β增高 根據(jù)患者是否存在ILD，將SS患者分為SS和SS-ILD患者。結(jié)果顯示，SS患者血漿IFN-β水平為(6.68±3.64)pg/mL，SS-ILD患者IFN-β水平為(9.71±3.76)pg/mL，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.586,P=0.013 7)。

2.3IFN-β促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-6 人THP-1細(xì)胞經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)后分化為巨噬細(xì)胞，圖2A和B可見THP-1細(xì)胞從圓形的懸浮細(xì)胞分化為貼壁的巨噬細(xì)胞。采用40 pg/mL IFN-β處理THP-1細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞24 h后，定量PCR結(jié)果顯示細(xì)胞中IL-6 mRNA水平明顯增加(圖2C)，ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清中IL-6也顯著增加(圖2D)。

2.4SS-ILD患者IL-6增加 SS-ILD患者血漿IL-6水平顯著高于無(wú)ILD的SS患者[(5.64±5.03) pg/mL vs(2.13±1.23) pg/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.623，P=0.014)。進(jìn)一步分析SS-ILD患者血漿IL-6與IFN-β的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(r=0.587 7，P=0.006 4)。

注：A，THP-1細(xì)胞形態(tài)(×100)；B，THP-1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞形態(tài)(×100)；C，IFN-β處理巨噬細(xì)胞后IL-6 mRNA表達(dá)，**,P<0.01；D，IFN-β處理巨噬細(xì)胞后上清中IL-6水平，*,P<0.05。

3 討論

SS是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫病，肺臟由于具有豐富血管和結(jié)締組織，因而是SS常累及的靶器官，SS-ILD等并發(fā)癥決定了患者的預(yù)后[8]。因此，探索SS-ILD具體發(fā)病機(jī)制具有為臨床提供診斷標(biāo)志物和治療新思路的實(shí)際意義。

IFN-β一直被認(rèn)為是機(jī)體抵抗外來(lái)病毒的固有免疫防御的重要分子[9]。近年研究表明，IFN-β在系統(tǒng)性紅斑狼瘡和SS等多種自身免疫病中發(fā)揮重要作用[10]。本研究結(jié)果證實(shí)SS患者的IFN-β增多，并且與患者的SS疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)。研究表明，SS患者唾液腺局部和外周血單個(gè)核細(xì)胞、單核細(xì)胞和B細(xì)胞中IFN-β相關(guān)的干擾素刺激基因表達(dá)增加，且與疾病活動(dòng)度和自身抗體相關(guān)[11]，與本研究結(jié)果一致。另外，臨床上應(yīng)用IFN-β治療病毒性肝炎時(shí)，部分患者出現(xiàn)SS樣癥狀[12]。這些結(jié)果提示IFN-β參與SS的發(fā)生和進(jìn)展。但I(xiàn)FN-β在SS-ILD的作用不明。本研究發(fā)現(xiàn)SS-ILD患者較未伴有ILD的SS患者血漿IFN-β增高，提示IFN-β參與SS-ILD。臨床上，并發(fā)ILD的自身免疫病很多，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者。本文沒有設(shè)置類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者對(duì)照，因此，IFN-β在其他并發(fā)ILD的自身免疫病中的作用和具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

肺部定居和浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞在包括SS-ILD等多種肺部疾病中發(fā)揮重要作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，IFN-β作用于巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6。促炎因子IL-6不僅可以激活多種免疫細(xì)胞，而且與ILD的關(guān)系密切，并且ILD患者的體內(nèi)IL-6水平可以作為預(yù)后判斷的指標(biāo)[14]。因此，本研究結(jié)果提示IFN-β誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞生成IL-6，可能是SS-ILD發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。要明確IFN-β通過IL-6參與SS-ILD的作用，需要特異性敲除SS-ILD小鼠肺部上皮細(xì)胞IL-6基因等，這是今后的研究方向之一。本研究為闡明SS-ILD發(fā)生新機(jī)制和提出SS-ILD患者治療新思路提供了理論依據(jù)。