郭晉祥，呂會茹，李姣鋒，廖成水，張琳琳，?？≥x

(1.洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，洛陽 471934；2.洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，洛陽 471934；3.洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與藥品學(xué)院，洛陽 471934；4.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，洛陽 471023)

銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，是一種廣泛存在于自然界中的重要條件致病菌，能引發(fā)畜禽、毛皮動物和寵物等的嚴重感染[1]。銅綠假單胞菌引發(fā)的水貂出血性肺炎發(fā)病急、死亡率高，造成的危害或經(jīng)濟損失逐年增加[2]。治療銅綠假單胞菌感染的有效策略依然是廣譜抗菌藥物，但大量濫用抗生素使得貂源銅綠假單胞菌耐藥株逐漸增加[3]。創(chuàng)傷傷口形成和愈合過程中局部微生物感染后發(fā)生壞死、液化，容易形成局限性膿液積聚。創(chuàng)面環(huán)境慢性傷口感染造成創(chuàng)面持續(xù)炎癥狀態(tài)，影響傷口愈合[4]。根據(jù)全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)分析數(shù)據(jù)顯示，銅綠假單胞菌是臨床中傷口感染最常見病原菌之一[5]。銅綠假單胞菌在感染處形成生物被膜可增強其適應(yīng)環(huán)境的能力，從而降低對絕大多數(shù)臨床抗菌藥物的敏感性，同時黏附于病灶，能夠抵抗吞噬細胞的作用，逃避宿主免疫防御機制，從而增強對宿主的致病能力，給臨床治療銅綠假單胞菌感染帶來嚴峻挑戰(zhàn)[6]。

新型抗菌藥物研發(fā)是解決水貂銅綠假單胞菌耐藥性問題的重要策略[7]。甘草具有“國老”“甜草”等別名，屬于豆科、甘草屬多年生草本，是中國中醫(yī)藥界中一種用途較廣泛的中藥，常作為一種重要的復(fù)方制劑應(yīng)用于各種疾病的治療[8]。研究發(fā)現(xiàn)，甘草乙醇提取物對小鼠肺部感染銅綠假單胞菌具有抑制作用[9]，但甘草乙醇提取物具有多種成分，具體是哪種物質(zhì)發(fā)揮抗菌活性仍不清楚。甘草查耳酮是甘草中一類含量較高的黃酮類化合物，目前發(fā)現(xiàn)A、B、C、D、E和F 6種甘草查耳酮。其中，甘草查耳酮A具有抗腫瘤、抗炎以及抵抗原蟲、白色念珠菌和部分細菌的藥理作用[10]。本研究擬從體內(nèi)外探究甘草查耳酮A對貂源銅綠假單胞菌的抗菌作用，以期為臨床合理使用甘草查耳酮A治療毛皮動物銅綠假單胞菌感染奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和試驗動物 銅綠假單胞菌臨床株分離自河南某養(yǎng)殖場患病水貂。 6～8周齡雌性昆明小鼠(18.0 g±2.0 g)購自鄭州中原動物實驗中心。

1.1.2 主要試劑 甘草查耳酮A購自北京酷來搏科技有限公司；胰蛋白大豆瓊脂(tryptic soy agar,TSA)和胰蛋白大豆肉湯(tryptic soy broth,TSB)均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫、乙醇等其他試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 銅綠假單胞菌的培養(yǎng)及特性檢測

1.2.1 銅綠假單胞菌的培養(yǎng) 取出凍存的銅綠假單胞菌，用接菌環(huán)劃線接種于TSA固體平板上，37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。挑取單個菌落接種于5 mL TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，然后后按1∶100的比例接種于5 mL的新鮮TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h備用。

1.2.2 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測定 根據(jù)美國臨床實驗室標準化研究所(clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦的微量稀釋法測定甘草查耳酮A對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)[11]。 向96孔板中接種1×105CFU/mL的銅綠假單胞菌。20 mg甘草查耳酮A溶解于1 mL DMSO配制成20 mg/mL儲存濃度，用肉湯將甘草查耳酮A倍比稀釋，不含甘草查耳酮A的孔作為作為陽性對照組，不接種銅綠假單胞菌的肉湯培養(yǎng)基的孔作為陰性對照組，同時設(shè)置1‰ DMSO對照組，每組3個重復(fù)，置37 ℃溫箱培養(yǎng)20 h。與陰性對照組保持一致的澄清孔所對應(yīng)的最小濃度判定為甘草查耳酮A抑制細菌的MIC。取上述MIC試驗過程中未見細菌生長的甘草查耳酮A組以及陽性對照組、陰性對照組和1‰ DMSO對照組的培養(yǎng)液涂布于TSA固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)20 h后觀察細菌，肉眼未見細菌生長的最低甘草查耳酮A濃度即為最小殺菌濃度(MBC)。每組設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.3 殺菌曲線繪制 用肉湯將銅綠假單胞菌濃度調(diào)整至1×105CFU/mL，同時加入甘草查耳酮A，使其終濃度分別為1MIC、2MIC、4MIC和8MIC，同時設(shè)不作任何處理的對照組(Con)及1‰ DMSO組，每組3個重復(fù)，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)。每1 h取培養(yǎng)液涂布于TSA固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜后計數(shù)活菌數(shù)，繪制時間-殺菌曲線。

1.2.4 生長曲線繪制 根據(jù)廖成水等[12]報道的方法用肉湯將銅綠假單胞菌濃度調(diào)整至1×105CFU/mL，同時加入甘草查耳酮A，使其終濃度分別為1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC和1/2MIC，同時設(shè)不作任何處理的對照組及1‰ DMSO組，每組3個重復(fù)，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)。每1 h取培養(yǎng)液測定D590 nm值，繪制銅綠假單胞菌的生長曲線。

1.2.5 生物被膜抑制活性的測定 按照Samad等[13]推薦的96孔微孔板結(jié)晶紫染色法檢測銅綠假單胞菌生物被膜形成情況。向96孔板中接種1×108CFU/mL的銅綠假單胞菌，加入甘草查耳酮A，使其終濃度分別為1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和1MIC，同時設(shè)不作任何處理的對照組及1‰ DMSO組，每組3個重復(fù)，置37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。用無菌PBS輕洗3次后加入1%結(jié)晶紫染色液室溫染色15 min，無菌PBS輕洗3次除去浮色，室溫放置30 min。每孔加入125 μL乙醇孵育15 min，溶解結(jié)晶紫后測定D590 nm值。

1.2.6 生物被膜清除活性的測定 向96孔板中接種1×108CFU/mL的銅綠假單胞菌，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。 培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，用無菌PBS輕洗3次，加入甘草查耳酮A，使其終濃度分別為1/4MIC、1/2MIC、1MIC和1MBC，同時設(shè)不作任何處理的對照組及1‰ DMSO組，每組3個重復(fù)，37 ℃孵育24 h。無菌PBS輕洗3次，按1.2.5結(jié)晶紫染色后測定D590 nm值。

1.3 甘草查耳酮A對銅綠假單胞菌感染的治療效果

1.3.1 皮膚刀傷的治療效果 根據(jù)Hong等[14]報道的方法分析甘草查耳酮A對銅綠假單胞菌感染小鼠皮膚刀傷的治療效果。將30只小鼠隨機平均分為空白組、對照組、DMSO組、甘草查耳酮A組和氨芐西林組。對所有小鼠背部進行剃毛處理，空白組不作任何處理，其他組小鼠經(jīng)75%乙醇消毒、麻醉后用手術(shù)刀切開皮膚，形成直徑和深度分別約為1.5和0.6 mm的創(chuàng)口，在創(chuàng)口接種50 μL銅綠假單胞菌(1×108CFU/mL)。用無菌紗布覆蓋傷口，以防止交叉感染。24 h后，對照組不作任何治療，DMSO組給予1‰ DMSO治療， 甘草查耳酮A組和氨芐西林組分別用甘草查耳酮A(10 μL，25 μg/mL)和氨芐西林(20 μL，1 μg/mL)對創(chuàng)口部位進行多點注射治療。24 h治療1次，連續(xù)給藥治療7 d。觀察背部皮膚刀傷創(chuàng)口的狀態(tài)并拍照。

1.3.2 皮下膿腫的治療效果 根據(jù)Alford等[15]描述的方法分析甘草查耳酮A對銅綠假單胞菌感染小鼠皮下膿腫的治療效果。將30只小鼠隨機均分為空白組、對照組、DMSO組、甘草查耳酮A組和氨芐西林組。對所有小鼠背部進行剃毛處理，空白組不作任何處理，而其他組小鼠在背部皮下接種50 μL銅綠假單胞菌(1×108CFU/mL)。 24 h后，對照組不作任何治療，DMSO組給予1‰ DMSO治療，甘草查耳酮A組和氨芐西林組分別使用甘草查耳酮A(20 μL，25 μg/mL)和氨芐西林(20 μL，1 μg/mL)對膿腫部位進行多點注射治療。24 h治療1次，連續(xù)給藥治療3 d。觀察背部皮膚膿腫的狀態(tài)并拍照。于超菌工作臺采集膿腫組織，勻漿，勻漿液經(jīng)PBS稀釋后培養(yǎng)液涂布于TSA固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜后統(tǒng)計活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計

采用Microsoft Excel 2013進行數(shù)據(jù)整理，結(jié)果用平均值±標準差表示，用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 甘草查耳酮A對銅綠假單胞菌的MIC和MBC

微量稀釋法測定結(jié)果顯示，甘草查耳酮A對銅綠假單胞菌的MIC和MBC分別為3.125和12.5 μg/mL。

2.2 甘草查耳酮A對銅綠假單胞菌的殺菌曲線

由圖1可知，不作任何處理的對照組銅綠假單胞菌菌落數(shù)量呈增加趨勢，DMSO組的細菌生長趨勢與對照組一致，2MIC和1MIC組在6 h內(nèi)細菌數(shù)量逐漸減少，而8 h后細菌數(shù)量表現(xiàn)出增多趨勢，但12～20 h細菌數(shù)量變化不明顯，基本維持在1×105CFU/mL左右。8MIC和4MIC組銅綠假單胞菌的數(shù)量一直處于下降趨勢，并且分別在14和16 h后均無菌落形成。

2.3 甘草查耳酮A對銅綠假單胞菌生長曲線的影響

由圖2可知，1‰ DMSO對銅綠假單胞菌的生長曲線無影響。1/16MIC甘草查耳酮A在12 h內(nèi)對銅綠假單胞菌的生長影響不大，但12 h以后銅綠假單胞菌的生長速度與對照組相比有所下降。1/8MIC甘草查耳酮A組銅綠假單胞菌的生長速度在各個時間點均慢于對照組和1/16MIC甘草查耳酮A組，1/4MIC甘草查耳酮A組細菌雖然能生長， 但生長速度明顯降低， 即使在20 h時D590 nm值約為0.6，而1/2MIC甘草查耳酮A作用下細菌4 h內(nèi)生長緩慢，D590 nm值約為0.1，之后細菌幾乎不生長。

圖1 銅綠假單胞菌的時間-殺菌曲線Fig.1 The time-killing effect curve of Pseudomonas aeruginosa

圖2 銅綠假單胞菌的生長曲線Fig.2 The growth curve of Pseudomonas aeruginosa

2.4 甘草查耳酮A對銅綠假單胞菌生物被膜的抑制活性

由圖3可知，DMSO雖然對銅綠假單胞菌生物被膜形成有抑制作用，但與對照組相比差異均不顯著(P>0.05)。1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和1MIC均能極顯著抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成(P<0.01)，呈現(xiàn)劑量依賴性。與對照組相比，1MIC顯示出更強的抑制生物被膜形成能力，抑制率約為70%。

2.5 甘草查耳酮A對銅綠假單胞菌生物被膜清除活性

由圖4所可知，1/2MIC、1MIC和1MBC甘草查耳酮A對銅綠假單胞菌生物被膜清除效果顯著，生物被膜量與對照組相比極顯著減少(P<0.01)，特別是1MBC甘草查耳酮A可清除約50%的生物被膜；1/4MIC甘草查耳酮A對生物被膜并無明顯的清除作用。

①1～6，分別為對照組、DMSO組、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和1MIC甘草查耳酮A組。②與對照組相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。圖4同①1-6,Control group,DMSO group,1/8MIC,1/4MIC,1/2MIC,and 1MIC of licochalcone A groups,respectively.②Compared with control group,*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01).The same as fig.4圖3 各組生物被膜形成率Fig.3 Formation rate of biofilm formation of each group

1～6，分別為對照組、DMSO組、1/4MIC、1/2MIC、1MIC和1MBC甘草查耳酮A組1-6, Control group, DMSO group, 1/4MIC, 1/2MIC, 1MIC, and 1MBC of licochalcone A groups, respectively圖4 各組生物被膜的清除活性Fig.4 Biofilm eradication activity of each group

2.6 甘草查耳酮A對銅綠假單胞菌感染小鼠刀傷創(chuàng)口的治療效果

由圖5可知，DMSO對銅綠假單胞菌感染后小鼠刀傷創(chuàng)口愈合并無效果(圖5B和5C)，而甘草查耳酮A治療7 d后刀傷創(chuàng)口與銅綠假單胞菌感染組相比明顯變小(圖5D)，愈合效果與氨芐西林組相當(圖5E)。

A～E，分別為空白組、對照組、DMSO組、甘草查耳酮A組和氨芐西林組。圖6同A-E,Blank group,control group,DMSO group,licochalcone A group and ampicillin group,respectively.The same as fig.6圖5 各組小鼠刀傷創(chuàng)口的治療效果Fig.5 Therapeutic effect of mice in each group

2.7 甘草查耳酮A對銅綠假單胞菌感染小鼠皮膚膿腫的治療效果

與空白組(圖6A)相比，小鼠皮膚接種銅綠假單胞菌后形成明顯的膿腫變化(圖6B),銅綠假單胞菌感染小鼠給予DMSO后膿腫并無明顯變化(圖6C),經(jīng)草查耳酮A和氨芐西林治療后小鼠皮膚膿腫小于對照組，且兩者治療效果相當(圖6D、6E)。各處理組膿腫組織細菌計數(shù)結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌感染小鼠給予甘草查耳酮A和氨芐西林后膿腫中的細菌數(shù)量均極顯著低于對照組(P<0.01)(圖7)。

圖6 各組小鼠皮膚膿腫的治療效果Fig.6 Therapeutic effect of mice in each group

1～5，分別為空白組、對照組、DMSO組、甘草查耳酮A組和氨芐西林組1-5,Blank group,control group,DMSO group,licochalcone A group and ampicillin group,respectively圖7 各組小鼠皮膚膿腫組織的細菌數(shù)量Fig.7 The number of bacteria in skin abscess tissue of mice in each group

3 討 論

甘草中的黃酮類成分具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗病毒和抗菌等多種藥理活性。甘草查耳酮A對甲氧西林敏感或不敏感的金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌和雙歧桿菌表現(xiàn)出較強的抑菌活性[16]，其MIC值為0.3～8 μg/mL[17]，其中，對腸系膜串珠菌和結(jié)核分枝桿菌也有一定的的抗菌活性，MIC值分別為15和29.16 μg/mL[17]。此外，含有甘草甜素、豆甾醇、麥角甾醇、甘草查耳酮和光甘草定的甘草乙醇提取混合物對小鼠體內(nèi)感染銅綠假單胞菌具有治療作用[9]。本研究結(jié)果顯示，甘草查耳酮A對貂源銅綠假單胞菌臨床分離菌株具有良好的抗菌活性，MIC值為3.125 μg/mL。時間-殺菌曲線結(jié)果顯示，甘草查耳酮A對貂源銅綠假單胞菌呈現(xiàn)濃度依賴性殺菌作用，低濃度甘草查耳酮A(1MIC和2MIC)只表現(xiàn)出對細菌生長速度的抑制作用， 并無殺菌能力， 但4MIC和8MIC甘草查耳酮A可完全殺滅銅綠假單胞菌，這與甘草查耳酮A對貂源銅綠假單胞菌臨床分離菌株MBC值為12.5 μg/mL的結(jié)果相符。

既能抑制生物被膜形成又能清除生物被膜的抗菌藥物是當前抗菌藥物開發(fā)的主要方向[11]。磷霉素聯(lián)合美羅培南、ε-聚賴氨酸、龍血竭等均可抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成[18]。本研究結(jié)晶紫染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘草查耳酮A對貂源銅綠假單胞菌臨床分離菌株生物被膜形成具有抑制作用，1MIC甘草查耳酮A的抑制率約為70%，這與申鳳鴿[17]報道8～64 μg/mL甘草查耳酮A對金黃色葡萄球菌生物被膜形成具有抑制作用的結(jié)果相似。生物被膜形成可造成抗生素?zé)o法進入細菌內(nèi)部而導(dǎo)致抗感染治療失敗[18]。甘草查耳酮A對生物被膜具有清除能力，1MBC甘草查耳酮A可清除約50%的生物被膜，這說明甘草查耳酮A可聯(lián)合抗生素用于銅綠假單胞菌臨床感染的預(yù)防和治療。

研發(fā)能抑制創(chuàng)面銅綠假單胞菌生長的抗菌藥物對創(chuàng)面愈合具有重大意義。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予銅綠假單胞菌感染小鼠刀傷模型8MIC(25 μg/mL)甘草查耳酮A治療，創(chuàng)口愈合很好，同時8MIC甘草查耳酮A也能減少銅綠假單胞菌感染小鼠皮膚膿腫的形成，且膿腫部位細菌數(shù)量極顯著降低，這說明甘草查耳酮A能夠在創(chuàng)傷感染部位抑制和殺滅銅綠假單胞菌，從而有利于創(chuàng)面愈合，可應(yīng)用于治療銅綠假單胞菌所致的傷口感染。甘草查耳酮A是否具有調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)等其他作用機制促進傷口愈合有待進一步探究。

4 結(jié) 論

甘草查耳酮A對貂源銅綠假單胞菌臨床分離菌株具有良好的抗菌活性，MIC和MBC分別為3.125和12.5 μg/mL。1/4MIC和1/2MIC甘草查耳酮A可抑制細菌生長，4MIC和8MIC甘草查耳酮A可完全殺滅銅綠假單胞菌。甘草查耳酮A對銅綠假單胞菌生物被膜形成具有抑制和清除作用，有助于銅綠假單胞菌感染小鼠刀傷創(chuàng)口愈合并抑制膿腫形成。結(jié)果可為將其用于銅綠假單胞菌臨床感染的預(yù)防和治療提供參考。