趙曉冬，傅 蓉，王全一，李彥博

β-內(nèi)酰胺類抗生素過敏反應的發(fā)生率與其高分子雜質(zhì)的含量有關，在臨床上最常見的不良反應是速發(fā)型過敏反應。引發(fā)β-內(nèi)酰胺類抗生素速發(fā)型過敏反應的過敏原并不是β-內(nèi)酰胺類抗生素本身，而是其中存在的高分子聚合物［1］。因此，對高分子聚合物的分析是當前β-內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)控研究的關鍵。注射用氨芐西林鈉舒巴坦鈉為《中國藥典》2005年版(二部)收載品種［2］，該品種為含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復方抗生素。其主要活性成分氨芐西林的穩(wěn)定性較差，有關物質(zhì)中高聚物雜質(zhì)所占比重較大，易形成氨芐西林的二聚、三聚、四聚和五聚物等高分子雜質(zhì)，在動物實驗中都顯示出強烈的引發(fā)過敏反應性，但該品種項下卻未規(guī)定高分子聚合物的檢查項。采用《中國藥典》2005年版中所載的葡聚糖凝膠Sephadex G10色譜系統(tǒng)［2］測定其中的高分子聚合物時，不能將氨芐西林聚合物與舒巴坦雜質(zhì)有效分離，舒巴坦鈉的出峰位置與β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物相同，因此，無法測定該藥物中的氨芐西林聚合物。筆者通過對其復方制劑中氨芐西林二聚物這一指示性高分子聚合物的分析，建立了簡便、準確、靈敏和專屬的HPLC法，以測定注射用氨芐西林鈉舒巴坦鈉中的高分子聚合物。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜分析儀(安捷倫公司);AS5150超聲波發(fā)生器(AUTO Research.Inc);CP225D電子天平(Sartorius公司);葡聚糖凝膠G10填充柱(上海藥檢所東方公司)。

1.2 試藥與試劑 注射用氨芐西林鈉舒巴坦鈉(規(guī)格:1.5 g，批號:20090801，?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰?;氨芐西林對照品(批號:130410-200706，85.7%)、舒巴坦對照品(批號:130430-200906，89.7%)、頭孢拉定對照品(批號:130427-200306，91.8%)、葡聚糖2000均由中國藥品生物制品檢定所提供;磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉均為分析純(國藥集團化學試藥有限公司);冰醋酸:分析純(汕頭市西隴化工廠);十二烷基硫酸鈉:化學純(遼寧省醫(yī)藥經(jīng)貿(mào)公司試劑廠);乙腈:色譜純(Concord Technology Co.Ltd)。

2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

利用Sephadex G10凝膠色譜法和HPLC法［3］對注射用氨芐西林鈉舒巴坦鈉中高分子雜質(zhì)的分離情況進行了比較。從圖1-A可見，采用Sephadex G10凝膠色譜系統(tǒng)，舒巴坦雜質(zhì)峰與氨芐西林聚合物峰在由葡聚糖2000定位的Kav=0的洗脫區(qū)間內(nèi)重疊，使氨芐西林聚合物無法定量測定。但采用HPLC法，其中明確指出與主峰相對保留時間為2.8的為氨芐西林二聚物峰，見圖1-B。因此，可以通過控制氨芐西林二聚物這一指示性雜質(zhì)的含量，控制該藥物中的高分子聚合物。最后確定色譜條件:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為12%醋酸溶液∶0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液∶乙腈∶水(0.5∶50∶50∶900);流動相 B 為12%醋酸溶液∶0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液∶乙腈∶水(0.5∶50∶400∶550)，檢測波長:254 nm。先以流動相A-流動相B(85∶15)等梯度洗脫，待氨芐西林峰洗脫完畢后，立即按表1進行線性梯度洗脫。檢測波長為254 nm。系統(tǒng)適用性試驗①:取本品0.2 g，加水1.0 mL使其溶解，于60℃水浴中加熱1 h，量取0.5 mL，置50 mL量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，氨芐西林主峰保留時間約2.8倍處的較大雜質(zhì)峰為氨芐西林二聚物峰;系統(tǒng)適用性試驗②:另取舒巴坦對照品、氨芐西林對照品、頭孢拉定對照品適量，加流動相A溶解并制成每1 mL中約含舒巴坦0.15 mg、氨芐西林0.3 mg、頭孢拉定0.02 mg的混合溶液，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，舒巴坦、氨芐西林、頭孢拉定峰的分離度應大于3.0。

表1 梯度洗脫時間程序表

3 溶液的制備

取本品適量，精密稱定，加流動相A溶解定量稀釋，制成每1 mL約含氨芐西林鈉2.7 mg的溶液，作為供試品溶液;另取氨芐西林對照品適量，精密稱定，流動相A溶解定量稀釋，制成每1 mL約含氨芐西林27 μg的溶液，作為對照溶液。

4 方法與結果

4.1 供試品中氨芐西林二聚物線性關系試驗取本品加流動相，制成含氨芐西林13.50 mg/mL的溶液。再用流動相A稀釋，制成含氨芐西林分別為 0.675、1.350、2.700、4.050、5.400 mg/mL 的系列溶液。各進樣20 μL。以氨芐西林二聚物峰面積為縱坐標(Y)、氨芐西林鈉進樣濃度為橫坐標(X)，得線性回歸方程:Y=3.844 ×10 X-0.324 4，r=1.000 0。結果表明，氨芐西林在0.675～5.4 mg/mL范圍內(nèi)，與氨芐西林二聚物峰面積呈良好的線性關系。

圖1 Sephadex G10凝膠色譜系統(tǒng)(A)、HPLC法系統(tǒng)適用性試驗①(B)、HPLC法系統(tǒng)適用性試驗②(C)注:1.氨芐西林高聚物;2.氨芐西林;3.舒巴坦雜質(zhì);4.舒巴坦;5.氨芐西林二聚物;6.頭孢拉定

4.2 氨芐西林對照品線性關系試驗 取氨芐西林對照品19.60 mg，加流動相A溶解并稀釋至25 mL，搖勻，再加流動相 A稀釋，制成含氨芐西林6.72、13.44、26.88、40.31、53.75 μg/mL 的系列溶液，各進樣20 μL。以氨芐西林峰面積為縱坐標(Y)、氨芐西林進樣濃度為橫坐標(X)，得線性回歸方程:Y=1.116 X －0.244 9，r=1.000 0。結果表明，氨芐西林在6.719～53.75 μg/mL范圍內(nèi)與氨芐西林峰面積呈良好線性關系。

4.3 氨芐西林二聚物峰的精密度試驗 取本品加流動相A，制成含氨芐西林2.7 mg/mL的溶液。連續(xù)進樣 5次，各進樣 20 μL。結果 RSD為0.7%，說明本法精密度良好。

4.4 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 取本品加流動相，制成含氨芐西林2.7 mg/mL的溶液，分別于放置0、1、2、4 h 時，進樣 20 μL。結果表明，在 4 h 內(nèi)，氨芐西林二聚物無明顯變化，RSD為0.5%，表明供試品溶液中氨芐西林二聚物的穩(wěn)定性良好。

4.5 供試品中氨芐西林二聚物的專屬性試驗進行如下破壞試驗。①堿破壞試驗:取本品45.46 mg，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液 1 mL，放置 10 min，加0.1 mol/L HCl溶液1 mL，加流動相 A稀釋至10 mL;②酸破壞試驗:取本品45.55 mg，加1 mol/L HCl溶液1 mL，放置1 h，加1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，加流動相A稀釋至10 mL;③熱破壞試驗:取本品45.33 mg，置稱量瓶中，100℃烘箱中加熱1 h，加流動相A溶解并稀釋至10 mL;④氧化破壞試驗:取本品45.39 mg，加過氧化氫溶液1.5 mL放置10 min，加流動相A溶解并稀釋至10 mL;⑤光破壞試驗:取供試品45.33 mg，置稱量瓶中，攤平，254、365 nm紫外燈下照射24 h，加流動相A溶解并稀釋至10 mL。各進樣20 μL。結果表明，此色譜系統(tǒng)在各破壞試驗中使其降解產(chǎn)物與氨芐西林、氨芐西林二聚物、舒巴坦均得到了較好的分離，除個別峰之外，絕大部分峰間的分離度大于1.5，認為此方法基本可行。

4.6 樣品中氨芐西林二聚物檢查 取本品適量，照“3”項下制成供試品溶液和對照溶液;取本品0.2 g，照“2”項下制成系統(tǒng)適用性試驗溶液①;取舒巴坦對照品、氨芐西林對照品、頭孢拉定對照品適量，照“2”項下制成系統(tǒng)適用性試驗溶液②。照“2”項下色譜條件，各進樣20 μL。由結果知，樣品氨芐西林二聚物含量符合規(guī)定。色譜圖見圖2。

圖2 氨芐西林二聚物檢查供試品色譜圖注:1.舒巴坦;2.氨芐西林;3.氨芐西林二聚物

5 討論

5.1 由梯度洗脫方法分析復方制劑樣品熱降解溶液的色譜圖(圖1-B)可知，制劑中的主成分和各雜質(zhì)均能得到較好的分離，且二聚物在此條件下為諸雜質(zhì)中最大的雜質(zhì)，有利于對氨芐西林二聚物峰位的確定。因此，熱降解溶液可作為系統(tǒng)適用性溶液，以考量實際應用中方法的有效性。同時，可以與結構相似物頭孢拉定之間的分離度作為系統(tǒng)適用性考察的另一指標(圖1-C)。

5.2 采用主成分自身對照法時，在目前無法獲得氨芐西林二聚物對照品的情況下，參考《英國藥典》2008年版氨芐西林有關物質(zhì)中對氨芐西林二聚物的相關限度，制定為“氨芐西林二聚物峰面積不得大于對照溶液主峰面積的4.5倍(4.5%)”。

［1］ 趙曉冬，傅蓉，畢開順.分子排阻色譜法測定注射用頭孢呋辛鈉舒巴坦鈉中的高分子雜質(zhì)［J］.藥物分析雜志，2010，30(1):95-98.

［2］ 中國藥典［S］.二部.2005:786-787，(附錄)35-36.

［3］ British PharmacopoeiaCommission.British Pharmacopoeia 2008［S］.London:The Stationery Office，2008:155-158.