李世念，劉婉寧，陳亞萍，王金濤

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319)

豬急性腹瀉綜合征(swine acute diarrhea syndrome，SADS)由豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)引起，可經(jīng)糞-口傳播，引起動物的亞臨床、輕度或致死性呼吸道和胃腸道疾病[1]。臨床突出表現(xiàn)為被感染的母豬輕度腹瀉，大多數(shù)在2 d內(nèi)恢復(fù)，被感染的5日齡內(nèi)新生仔豬急性腹瀉、急性嘔吐，體重迅速下降，導(dǎo)致急性死亡，死亡率高達(dá)90%以上[2]。2017年，中國廣東省清遠(yuǎn)地區(qū)在世界范圍內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)該病，導(dǎo)致該地區(qū)4個豬場24 693頭仔豬死亡，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。鑒于SADS-CoV是國內(nèi)在豬身上新出現(xiàn)的冠狀病毒，目前對SADS-CoV的認(rèn)識及研究尚淺，又尚無商業(yè)化疫苗可用[4]，一旦全國性暴發(fā)將極有可能給養(yǎng)豬業(yè)帶來致命的威脅，因此，為了科學(xué)有效地防控SADS，其疫苗開發(fā)就顯得尤為重要。

現(xiàn)有研究表明，SADS-CoV基因組全長約27.17 kb，包括5′-UTR、3′-UTR，5個非結(jié)構(gòu)蛋白ORF1a、ORF1b、NS3a、NS7a和NS7b，以及4個結(jié)構(gòu)蛋白刺突蛋白(S)、膜糖蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和包膜蛋白(E)[5]。其中S蛋白作為結(jié)合和進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白，其功能發(fā)揮分別依賴于受體結(jié)合域S1亞基和融合域S2亞基，其在細(xì)胞附著、受體結(jié)合、種間傳播、介導(dǎo)病毒入侵和感染，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體中發(fā)揮重要作用，而且是疫苗研發(fā)中的重要蛋白[6]。M蛋白作為一種跨膜蛋白，其在機(jī)體內(nèi)數(shù)量多，在膜融合、病毒復(fù)制方面發(fā)揮重要作用，還能介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素-α(IFN-α)及刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)，同時該蛋白高度保守，又能誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒中和抗體，在開發(fā)基因工程疫苗領(lǐng)域具有廣闊前景[7]。E蛋白在冠狀病毒表面含量最少，親水性較強，其不僅在病毒包膜與粒子及冠狀病毒的病毒樣顆粒形成中發(fā)揮重要作用，在病毒感染和組裝期間也具有重要功能。除此之外，還具有離子通道活性，可與宿主蛋白相互作用[8]。正是基于S、M和E蛋白的重要性，且位于病毒粒子表面，S、M及E蛋白被認(rèn)為是疫苗開發(fā)最有吸引力的目標(biāo)蛋白[9]?；诖?，本研究利用免疫信息學(xué)方法預(yù)測并設(shè)計S、M和E蛋白潛在的優(yōu)勢表位并構(gòu)建多表位疫苗，旨在為SADS-CoV多表位疫苗的設(shè)計提供一種新的方法，為SADS-CoV多表位疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 SADS-CoV S、M及E蛋白序列檢索及T、B淋巴細(xì)胞表位預(yù)測

以SADS-CoV的主要結(jié)構(gòu)蛋白S蛋白(GenBank登錄號： QBP43300.1)、 M蛋白(GenBank登錄號：AVM80442.1)、E蛋白(GenBank登錄號：QEH62671.1)為靶點用于表位篩選和設(shè)計針對SADS-CoV的多表位疫苗。運用Immunomedicine Group(http:∥imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)、IEDB(http:∥tools.iedb.org/bcell/)對其B淋巴細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測；運用IEDB(http:∥tools.iedb.org/mhci/)預(yù)測蛋白T淋巴細(xì)胞MHCⅠ類分子結(jié)合表位；運用NetMHCIIpan 4.0 Serve(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCIIpan-4.0)預(yù)測蛋白T淋巴細(xì)胞MHCⅡ類分子結(jié)合表位[10]。

1.2 表位的保守性及致敏性預(yù)測

運用IEDB(http:∥tools.iedb.org/conservancy/)對MHCⅠ、MHCⅡ類分子及B淋巴細(xì)胞表位進(jìn)行保守性分析，具有高保守性的表位被列入候選名單以供進(jìn)一步分析。 此外，多表位疫苗設(shè)計還應(yīng)關(guān)注其致敏性，運用AllerTOP v 2.0(http:∥www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP)對其致敏性進(jìn)行分析。

1.3 多表位疫苗的構(gòu)建

使用選定的MHCⅠ、MHCⅡ類分子和B淋巴細(xì)胞優(yōu)勢表位構(gòu)建疫苗氨基酸序列。不同的優(yōu)勢表位使用柔性linker串聯(lián)在一起，MHCⅠ類分子使用AAY，MHCⅡ類分子使用GPGPG，B淋巴細(xì)胞使用KK，為了提高疫苗的免疫原性，將β-防御素Ⅰ作為免疫增強劑通過構(gòu)建體N-端的EAAAK加入[11]。

1.4 多表位疫苗抗原性及理化性質(zhì)預(yù)測

運用ANTIGENpro(http:∥scratch.proteomics.ics.uci.edu/)和VaxiJen v 2.0(http:∥www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)對最終構(gòu)建的多表位疫苗進(jìn)行抗原性分析；運用Expasy ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)預(yù)測多表位疫苗的理化性質(zhì)。

1.5 多表位疫苗糖基化及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

運用NetNGlyc(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)預(yù)測多表位疫苗的N-糖基化位點;運用SOPMA(http:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析多表位疫苗的二級結(jié)構(gòu)。

1.6 多表位疫苗三級結(jié)構(gòu)建模、優(yōu)化

運用ANTIGENpro(http:∥scratch.proteomics.ics.uci.edu/)對多表位疫苗進(jìn)行同源建模，運用3D StructureViewer(https:∥srv.mbi.ucla.edu/Viewer/?)可視化模型結(jié)構(gòu)，用3Drefine(http:∥sysbio.rnet.missouri.edu/3Drefine/)改進(jìn)模型質(zhì)量，此過程同時將模型中的粗結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，為此運用SWISS-MODE(https:∥swissmodel.expasy.org/assess)生成Ramachandran圖用于評估模型優(yōu)化前后的質(zhì)量。

1.7 多表位疫苗三級結(jié)構(gòu)突出表位預(yù)測

為驗證多表位疫苗是否具有強體液免疫和細(xì)胞免疫的能力，運用ElliPro(http:∥tools.iedb.org/ellipro/)分析多表位疫苗三級結(jié)構(gòu)中連續(xù)和不連續(xù)表位。

1.8 多表位疫苗與免疫受體的分子對接

運用ClusPro 2.0(https:∥cluspro.org)進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接，檢測設(shè)計的多表位疫苗與研究較徹底的Toll樣受體3[12](TLR3)(PDB ID：2A0Z)的親和力。

1.9 多表位疫苗密碼子優(yōu)化、反向翻譯及基因克隆

運用JCat(http:∥www.jcat.de/)進(jìn)行密碼子優(yōu)化和反向翻譯，生成多表位疫苗的cDNA序列，結(jié)果由GC含量和密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)分?jǐn)?shù)組成，可用于評估蛋白質(zhì)表達(dá)水平。此外，通過SnapGene計算機(jī)軟件將優(yōu)化后的多表位疫苗cDNA序列插入到pET-32a(+)載體中，以確保其在大腸桿菌K-12中穩(wěn)定表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 SADS-CoV S、M及E蛋白序列檢索及T、B淋巴細(xì)胞表位分析

從GenBank獲得的S蛋白核苷酸序列全長3 393 bp，共編碼1 130個氨基酸，M蛋白核苷酸序列全長687 bp，共編碼228個氨基酸，E蛋白核苷酸序列全長228 bp，共編碼75個氨基酸。IEDB預(yù)測MHCⅠ類分子結(jié)合表位時，等位基因距離趨近于0，被認(rèn)為是優(yōu)良的等位基因，選擇等位基因距離越趨近于0的SLA-1*0401和SLA-20401。NetMHCIIpan 4.0 Serve預(yù)測MHCⅡ類分子結(jié)合表位時，DRB等位基因被認(rèn)為是MHCⅡ類分子經(jīng)典的基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物，等位基因選擇DRB1*0801和DRB1*0301。結(jié)果顯示，當(dāng)選擇不同等位基因時預(yù)測結(jié)果不盡相同，但仍有重疊部分，選擇評分較高且兩兩重疊的表位區(qū)域作為優(yōu)勢表位。篩選出的S、M、E蛋白T淋巴細(xì)胞MHCⅠ、MHCⅡ類分子優(yōu)勢表位見表1。

B淋巴細(xì)胞表位結(jié)果顯示，Immunomedicine Group預(yù)測出的S、M、E蛋白B淋巴細(xì)胞表位分別為43、7和2個；IEDB預(yù)測出的S、M、E蛋白B淋巴細(xì)胞表位分別為34、7和2個。因此，需選擇重疊部分，同時因較短的肽不易形成抗原表位，故重疊區(qū)域還應(yīng)排除掉5個氨基酸以下的短肽，使預(yù)測結(jié)果具有較高的可信度，篩選出的S、M、E蛋白B淋巴細(xì)胞優(yōu)勢表位見表2。

表1 SADS-CoV S、M及E蛋白MHCⅠ、MHCⅡ類分子優(yōu)勢表位篩選結(jié)果

表2 SADS-CoV S、M及E蛋白B淋巴細(xì)胞優(yōu)勢表位篩選結(jié)果

2.2 表位保守性及致敏性分析

運用IEDB篩選保守性100%的優(yōu)勢表位以供下一步分析。通過篩選非致敏性優(yōu)勢表位，得到SADS-CoV S蛋白MHCⅠ類分子優(yōu)勢表位位置為136-149、363-369和956-960位氨基酸，MHCⅡ類分子優(yōu)勢表位位置為90-94和618-627位氨基酸，B淋巴細(xì)胞優(yōu)勢表位位置為283-296和553-551位氨基酸；SADS-CoV M蛋白MHCⅠ類分子優(yōu)勢表位位置為63-77、131-144和187-197位氨基酸，MHCⅡ類分子優(yōu)勢表位位置為118-122和14-227位氨基酸，B淋巴細(xì)胞優(yōu)勢表位位置為6-12、24-36、159-167和214-219位氨基酸；SADS-CoV E蛋白MHCⅠ類分子優(yōu)勢表位位置為7-17位氨基酸，MHCⅡ類分子優(yōu)勢表位位置為23-35、39-44和58-62位氨基酸，B淋巴細(xì)胞優(yōu)勢表位位置為60-71位氨基酸。

2.3 多表位疫苗的構(gòu)建

選擇上述優(yōu)勢表位進(jìn)行多表位疫苗構(gòu)建，構(gòu)建的多表位疫苗氨基酸序列為：GIINTLQKYYCRV-RGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKKE-AAAKSTSHAADAGPTNAFAAYTPYLKPYAAY-ANLSYAAYALSIFNAYADFGVNWAAYYSIPMP-

VAPTGITLAAYRSLNASTNTGWAAYEDDGLFIN-

TVLGPGPGAGGYTGPGPGEADIRGAGILGPGPG-

ALSIFNAYADFGGPGPGTDAIAGPGPGSSDNL-TENDRLLHLGPGPGILVLLVASTVIKLGPGPG-CFSCHRGPGPGYLVYKKKPDSYCGSNSCPFKRK-KLGNVAVRDTTYVAPKKNTVPVTEKKWNII-

LTVFIAVLQKKATGVQPAHLKKVYKSYMEV-

EPCP，多表位疫苗盒如圖1所示，其中GIINTL-QKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRG-RKCCRRKK為β-防御素Ⅰ，EAAAK為N-端接頭，AAY為MHCⅠ類分子linker，GPGPG為MHCⅡ類分子linker，KK為B淋巴細(xì)胞linker。

2.4 多表位疫苗抗原性及理化性質(zhì)分析

ANTIGENpro和VaxiJen 2.0預(yù)測構(gòu)建的多表位疫苗抗原性分別為0.897和0.654，表明構(gòu)建的多表位疫苗具有良好的抗原性。ExPASy ProtParam預(yù)測結(jié)果顯示，多表位疫苗由336個氨基酸組成，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為35.30 ku，理論等電點為9.36，分子式為C1590H2475N429O455S13。哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞體外半衰期30 h，酵母體內(nèi)半衰期>20 h，大腸桿菌體內(nèi)半衰期>10 h；不穩(wěn)定系數(shù)為47.70，脂肪指數(shù)為28.20，親水性平均值為-0.147，預(yù)測結(jié)果將其歸為穩(wěn)定親水蛋白。

2.5 多表位疫苗糖基化及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

NetNGlyc結(jié)果顯示，多表位疫苗具有1個潛在的N-糖基化位點(圖2)。SOMPA預(yù)測多表位疫苗二級結(jié)構(gòu)顯示， α-螺旋、 β-折疊、 無規(guī)則卷曲和β轉(zhuǎn)角分別占22.11%、20.35%、50.88%和6.67%(圖3)。

2.6 多表位疫苗三級結(jié)構(gòu)建模、優(yōu)化

ANTIGENpro基于同源建模構(gòu)建多表位疫苗的三級結(jié)構(gòu)，所得模型運用3D StructureViewer服務(wù)器查看結(jié)果如圖4A所示。Swissmode服務(wù)器生成Ramachandran圖，模型得分3.81，沖突得分113.75，Ramachandran圖優(yōu)勢區(qū)域90.00%，異常區(qū)域5.00%(圖4B)。3Drefine服務(wù)器優(yōu)化蛋白質(zhì)模型(圖4C)。優(yōu)化后的模型得分3.62，沖突得分74.54，Ramachandran圖優(yōu)勢區(qū)域91.92%，異常區(qū)域3.89%(圖4D)。 與優(yōu)化前相比，優(yōu)化后Ramachandran圖得到了更好的結(jié)果。

圖1 SADS-CoV多表位疫苗盒Fig.1 SADS-CoV multi-epitope vaccine kit

h，α-螺旋；e，β-折疊；t，β-轉(zhuǎn)角；c，無規(guī)則卷曲h,Alpha helix;e,Beta sheet;t,Beta turn;c,Random coil圖3 多表位疫苗二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of secondary structure of multiepitope vaccine

A,多表位疫苗的三級結(jié)構(gòu)；B,Ramachandran作圖驗證三級結(jié)構(gòu)；C,多表位疫苗優(yōu)化后的三級結(jié)構(gòu)；D,Ramachandran作圖驗證優(yōu)化后的三級結(jié)構(gòu)A,Tertiary structure of multiepitope vaccine;B,Ramachandran plots to validate the tertiary structure;C,Tertiary structure optimized by the multi-epitope vaccine;D,Ramachandran plots validates the optimized tertiary structure圖4 多表位疫苗三級結(jié)構(gòu)的建模、優(yōu)化Fig.4 Modeling and optimization of tertiary structure of multiepitope vaccine

2.7 多表位疫苗三級結(jié)構(gòu)突出表位預(yù)測

從優(yōu)化后的多表位疫苗的三級結(jié)構(gòu)模型中預(yù)測得到10個線性表位和9個不連續(xù)表位，線性表位結(jié)合位置的最高得分為0.81(圖5A，箭頭所示)，不連續(xù)表位結(jié)合位置的最高得分0.78(圖5B，箭頭所示)，得分遠(yuǎn)高于0.5的設(shè)定閾值，證實設(shè)計的多表位疫苗具有較好的免疫原性。

A,評分最高的線性表位結(jié)合位置；B,評分最高的不連續(xù)表位結(jié)合位置A,The linear epitope binding position with the highest score;B,The binding position of discontinuous epitope with the highest score圖5 B細(xì)胞優(yōu)勢表位圖Fig.5 Map of dominant epitopes of B cells

2.8 多表位疫苗構(gòu)建體與免疫受體的分子對接

使用ClusPro 2.0進(jìn)行多表位疫苗和TLR3分子對接，共產(chǎn)生10個模型，其中0號模型所得能量分?jǐn)?shù)為-1 064.2，在預(yù)測的所有模型中能量分?jǐn)?shù)最少，為最佳對接復(fù)合體，具有最高的親和力(圖6)。

A,TLR3；B,多表位疫苗A,TLR3;B,Multiepitope vaccine圖6 疫苗蛋白和TLR3的對接Fig.6 Docking of vaccine protein and TLR3

2.9 多表位疫苗密碼子優(yōu)化、反向翻譯及基因克隆

密碼子優(yōu)化序列的CAI改進(jìn)值為0.96，多表位疫苗GC含量為54.07%。總體而言，多表位疫苗屬于適合在大腸桿菌中表達(dá)的類別。將多表位疫苗嵌入到原核表達(dá)載體pET-32a(+)限制性酶切位點BamH Ⅰ和XhoⅠ中，最終生成一個完整的克隆構(gòu)建體，其序列長度為1 008 bp。

3 討 論

SADS-CoV作為新近發(fā)現(xiàn)的第4種豬腸道冠狀病毒[13]，自2017-2019年在中國廣東、福建兩省暴發(fā)以來，相繼使多個豬場遭受了嚴(yán)重的打擊，并給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失[14-15]。陳仲德等[16]將前期收集的發(fā)病豬病變組織進(jìn)行滅活處理后作為滅活苗對妊娠母豬進(jìn)行口服，新生仔豬獲得母源抗體，使疫情得到了一定的控制。但2019年，SADS-CoV在廣東省某豬場再次暴發(fā)，宏基因組測序結(jié)果表明其已發(fā)生突變，致使毒力變強[17]，這提示對該疫病早期控制和預(yù)防已變得十分必要。然而現(xiàn)有的研究結(jié)果雖然在病毒的起源、致病性、診斷方法和檢測技術(shù)等方面有了一定進(jìn)展，但依舊存在許多尚未解決的問題，疫苗接種一直是預(yù)防和控制傳染病的有效措施[18]，因此，為防止SADS-CoV的持續(xù)傳播，迫切需要有效的疫苗。

傳統(tǒng)疫苗的抗原表位篩選耗時耗力，而隨著免疫信息學(xué)的發(fā)展，計算機(jī)可依據(jù)不同運算法則對基因序列進(jìn)行深層次信息的篩選，從基因序列源頭對抗原表位進(jìn)行預(yù)測，即為“反向疫苗學(xué)”，因具有更高的準(zhǔn)確性故被廣泛使用[19]。多表位疫苗正是伴隨著反向疫苗學(xué)應(yīng)運而生，相對于傳統(tǒng)弱毒疫苗，其安全性更高，其將病毒蛋白上的多個B淋巴細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞表位整合到特定載體上，構(gòu)建的多表位疫苗可能有效刺激機(jī)體引發(fā)體液和細(xì)胞免疫，增強宿主保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而有利于控制病毒的感染[20]。多表位疫苗在抑制病毒復(fù)制和對抗免疫逃逸株等方面都具有獨特優(yōu)勢，是目前疫苗研究的一個熱點。 設(shè)計開發(fā)的多表位嵌合抗原用于候選疫苗和診斷劑，不僅成本較低，且刺激強烈的免疫應(yīng)答[21]。

本試驗正是基于反向疫苗篩選策略，通過免疫信息學(xué)方法篩選出SADS-CoV S、M及E蛋白優(yōu)勢表位，優(yōu)勢表位經(jīng)柔性linker連接以延長蛋白在體內(nèi)的作用時間，有效避免新結(jié)合表位的產(chǎn)生而被引入[22]。EAAAK接頭連接到構(gòu)建體的N-端以促進(jìn)持久的免疫反應(yīng)，通過有效分離減少與其他蛋白質(zhì)區(qū)域的連接并提高穩(wěn)定性，AAY和GPGPG接頭連接可提高溶解度并使相鄰的結(jié)構(gòu)域易于接近和自由發(fā)揮作用，并促進(jìn)抗原的免疫加工，KK接頭以增強蛋白質(zhì)折疊、穩(wěn)定和表達(dá)[23]。本研究預(yù)測分析結(jié)果顯示，構(gòu)建的SADS-CoV多表位疫苗具有較高的保守性和非致敏性，且為穩(wěn)定親水蛋白，可為蛋白表達(dá)純化提供理論依據(jù)。同時抗原性決定了抗原與B細(xì)胞和T細(xì)胞受體結(jié)合能力，促進(jìn)免疫應(yīng)答和記憶細(xì)胞形成[24]，運用ANTIGENpro、VaxiJen v 2.0預(yù)測多表位疫苗的抗原性確保其與免疫受體相互作用，結(jié)果顯示構(gòu)建的多表位疫苗高出設(shè)定閾值0.3，證明多表位疫苗具有較好的抗原性。而對疫苗N-糖基化位點預(yù)測尤為重要，其在蛋白質(zhì)穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要作用[25]，本試驗結(jié)果顯示，多表位疫苗存在N-糖基化位點。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)規(guī)則不易形變，較難嵌合抗體，一般不作為抗原表位[26]。本試驗預(yù)測中N-端α-螺旋出現(xiàn)頻率較少，預(yù)測結(jié)果顯示，α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角分別占22.11%、20.35%、50.88%和6.67%，但預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)較為分散。而β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)較易發(fā)生扭轉(zhuǎn)，結(jié)構(gòu)向外凸出，多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面，利于與抗體嵌合，因此其形成優(yōu)勢表位的可能性較大[27]。預(yù)測結(jié)果顯示無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角約占比60%，顯示出多表位疫苗較好的抗原性。除此之外，多表位疫苗的生物學(xué)功能發(fā)揮還依賴其三級結(jié)構(gòu)，通過預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)上的連續(xù)與不連續(xù)表位，判斷多表位疫苗的免疫原性[28]，多表位疫苗的三級結(jié)構(gòu)由ANTIGENpro服務(wù)器建模，之后用3Drefine模型進(jìn)行優(yōu)化。最終優(yōu)化后的多表位疫苗三級結(jié)構(gòu)在B淋巴細(xì)胞引起的體液免疫中共產(chǎn)生10個線性表位，9個不連續(xù)表位，預(yù)測得分均在0.8左右，證實了設(shè)計的多表位疫苗具有良好免疫原性。同時多表位疫苗和免疫受體分子之間的相互作用對于觸發(fā)免疫反應(yīng)十分重要，將優(yōu)化后的多表位疫苗模型與TLR3分子對接，以檢查免疫反應(yīng)時的結(jié)合能力[29]。在分子對接分析中觀察到多表位疫苗和TLR3之間能穩(wěn)定相互作用，并且結(jié)合所得的能量分?jǐn)?shù)較少，為-1 064.2，具有較高的親和力。最后將多表位疫苗進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使用SnapGene克隆到大腸桿菌載體，確保多表位疫苗在原核表達(dá)載體pET-32a(+)內(nèi)能夠準(zhǔn)確翻譯并且穩(wěn)定表達(dá)[30]。本研究應(yīng)用一系列免疫信息學(xué)工具，構(gòu)建了可對抗SADS-CoV的有效疫苗，但仍需試驗驗證來評估設(shè)計構(gòu)建的多表位疫苗免疫原性和安全性。后續(xù)試驗將對構(gòu)建的多表位疫苗進(jìn)行高通量克隆、表達(dá)純化重組蛋白、免疫動物，并進(jìn)行免疫學(xué)評價，以確定所構(gòu)建多表位疫苗的實際應(yīng)用價值。

4 結(jié) 論

本研究運用免疫信息學(xué)方法成功預(yù)測并篩選出了SADS-CoV S、M及E蛋白的優(yōu)勢表位，通過對優(yōu)勢表位的保守性、致敏性進(jìn)一步評估，構(gòu)建了SADS-CoV的多表位疫苗。通過對多表位疫苗理化性質(zhì)、抗原性、N-糖基化位點、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)建模及優(yōu)化、分子對接、密碼子優(yōu)化、反向翻譯和計算機(jī)克隆等進(jìn)行綜合分析，成功構(gòu)建了SADS-CoV多表位疫苗，為SADS-CoV多表位疫苗的研發(fā)提供了理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。