石雨竹，羅儒唐，陳 超，吳 旭，李 昂

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350000)

番鴨(Cairinamoschata)是一種優(yōu)質(zhì)的瘦肉型肉鴨品種[1]，與其他家禽相比，具有易于飼養(yǎng)[2]，耐熱性好[3-4]，脂肪含量較低，對(duì)環(huán)境和疾病有較強(qiáng)的抵抗力等優(yōu)點(diǎn)。但其就巢性強(qiáng)、產(chǎn)蛋率低等特點(diǎn)嚴(yán)重影響了其養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，闡明就巢性狀的分子遺傳機(jī)制成為改善就巢性高、產(chǎn)蛋性能低的關(guān)鍵問(wèn)題。影響產(chǎn)蛋性能有較多因素，卵泡發(fā)育直接影響產(chǎn)蛋性能。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族由TGF-β、抗繆勒氏管激素(anti-mullerian hormone,AMH)、激活素(activin)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)和生長(zhǎng)分化因子(growth differentiation factor,GDF)組成；其家族成員被認(rèn)為通過(guò)旁分泌、自分泌的方式在調(diào)控卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用[5]。 其中，生長(zhǎng)分化因子9(growth differentiation factor 9，GDF9)是卵母細(xì)胞分泌的一個(gè)重要生長(zhǎng)因子，是McPherron等[6]以已知的TGF-β超家族的保守序列為模板，通過(guò)消減PCR技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)的。GDF9基因位于常染色體上，基因結(jié)構(gòu)比較保守，通常是由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成[7]。GDF9在多個(gè)物種的卵巢上高度表達(dá)，被廣泛認(rèn)為在卵泡的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8]。作為卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間雙向通訊的一個(gè)重要影響因子，通過(guò)自分泌和旁分泌的方式參與調(diào)控顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞的增殖分化、相關(guān)功能蛋白和因子產(chǎn)生、生殖系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)以及卵巢細(xì)胞的代謝、凋亡等生物學(xué)過(guò)程，從而在卵巢卵泡的生長(zhǎng)以及卵母細(xì)胞成熟、排卵和黃體化等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。GDF9基因突變后，綿羊和小鼠都表現(xiàn)為卵母細(xì)胞在初級(jí)卵泡階段死亡，卵泡發(fā)育停滯[10-11]。此外，GDF9基因在哺乳動(dòng)物中高度保守，與BMP15基因結(jié)構(gòu)相似，被歸為BMP亞族成員[12]。研究發(fā)現(xiàn)，GDF9和BMP15以協(xié)同作用形成了GDF9/BMP15二聚體，在調(diào)控卵泡顆粒細(xì)胞增殖、分化與促進(jìn)卵泡與卵丘發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[13-14]。

此外，GDF9與動(dòng)物的繁殖性能也密切相關(guān)，被作為綿羊[15]和山羊[10]高繁殖力的候選基因。位于GDF9基因上的多個(gè)SNPs與中國(guó)多個(gè)地方雞品種繁殖性能高度顯著相關(guān)，如Lou等[16]在京海黃雞GDF9基因發(fā)現(xiàn)存在2個(gè)位點(diǎn)(A2053G和C2420T)與其300日齡蛋重顯著相關(guān)，Qin等[17]在大骨雞GDF9基因發(fā)現(xiàn)存在1個(gè)位點(diǎn)，與其產(chǎn)蛋量和蛋種重顯著相關(guān)，說(shuō)明該基因在提高雞產(chǎn)蛋率中發(fā)揮著重要作用。研究證實(shí)，GDF9還能和其他因子共同調(diào)控孕酮的合成。在雞的研究中，GDF9通過(guò)增強(qiáng)促卵泡素受體(FSHR)的表達(dá)調(diào)控孕酮的合成[18]，GDF9也可以刺激體外培養(yǎng)的牛顆粒細(xì)胞中孕酮的合成[19]。但GDF9抑制了人的孕酮合成[20]，這說(shuō)明GDF9基因在不同物種卵巢發(fā)育中的作用有著物種特異性。GDF9在番鴨卵巢中的調(diào)控作用鮮見(jiàn)報(bào)道。前期轉(zhuǎn)錄組研究證明，GDF9基因在番鴨產(chǎn)蛋期和就巢期存在顯著差異，預(yù)測(cè)其可能作為卵泡發(fā)育時(shí)期的重要候選基因(結(jié)果未發(fā)表)。

快速分離cDNA末端(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)是依據(jù)PCR技術(shù)，基于一段已知cDNA序列，克隆未知的cDNA末端的技術(shù)[21]，現(xiàn)在RACE克隆技術(shù)被廣泛用于克隆未知序列。本試驗(yàn)以番鴨為研究對(duì)象，利用RACE方法克隆GDF9基因CDS區(qū)序列并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，闡明該基因的生物學(xué)功能。同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法來(lái)檢測(cè)該基因在不同發(fā)育時(shí)期及不同組織中的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究番鴨GDF9基因的功能提供理論基礎(chǔ)，也為該基因在調(diào)控其他物種繁殖分子機(jī)制提供關(guān)鍵依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 試驗(yàn)動(dòng)物為廣東溫氏家禽有限公司(莆田秀嶼種鴨場(chǎng))提供的小型白羽母番鴨(MB品系)，飼養(yǎng)方式為籠養(yǎng)，按常規(guī)方法飼養(yǎng)管理，隨機(jī)選擇飼養(yǎng)條件相同的產(chǎn)蛋高峰期(21周齡，產(chǎn)蛋率為90%以上)、就巢期(42周齡)的母番鴨各9只。頸部放血后迅速取出其下丘腦、垂體、脾臟、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、十二指腸、卵巢和子宮組織，用錫紙包裹，迅速放入液氮冷凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ粫r(shí)期每3只番鴨的相同組織混成1個(gè)樣品，做成3個(gè)重復(fù)。

1.1.2 主要試劑和儀器 TRIzol Reagent(15596026)購(gòu)自Invitrogen公司；氯仿(10006818)、異丙醇(40064360)和無(wú)水乙醇(10009218)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑(上海)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase(6106)、SMARTer?RACE 5′/3′Kit(634860)、Tks Gflex DNA Polymerase(R060A)、克隆載體pMDTM19-T Vector Cloning Kit(6013)、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞(9052)、膠回收試劑盒Mini BEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0(9761)、In-Fusion?HD Cloning Kit(639648)均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑(KR118)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；GoTaq?Real-time PCR Systems(A6002)購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。

1730R微量高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)：1730R)、酶標(biāo)儀(型號(hào)：EPOLH)均購(gòu)自基因有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)：ECO)購(gòu)自Illumina公司；熱循環(huán)儀(型號(hào)：SimpliAmp)購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；電泳儀(型號(hào)：DYY-8C)購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法提取番鴨各組織的總RNA，將提取的總RNA用酶標(biāo)儀和電泳確定其純度和濃度，選擇D260 nm/D280 nm在1.8～2.0、28S和18S條帶的亮度和寬度比例為2∶1的RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)綠頭鴨(Anasplatyrhynchos，登錄號(hào)為XM_013104015)、鳳頭潛鴨(Aythyafuligula，登錄號(hào)：XM_032196611.1)、疣鼻天鵝(Cygnusolor，登錄號(hào)：XM_040573681.1)和棕硬尾鴨(Oxyurajamaicensis，登錄號(hào)：XM_035338369.1)GDF9基因的mRNA序列，在序列保守性比較高的位置，設(shè)計(jì)3對(duì)引物用于番鴨GDF9基因CDS區(qū)的PCR擴(kuò)增；根據(jù)獲得的番鴨GDF9基因CDS區(qū)片段，分別設(shè)計(jì)5′-RACE和3′-RACE巢式PCR引物；根據(jù)獲得的5′-RACE和3′-RACE以及CDS區(qū)序列分別設(shè)計(jì)引物F0和R0(GDF9-4)，用于線(xiàn)性關(guān)系驗(yàn)證；利用獲得的番鴨GDF9基因完整序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，其中GAPDH為內(nèi)參基因，引物信息見(jiàn)表1。引物均由北京睿博興科生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.3GDF9基因CDS區(qū)的克隆 根據(jù)設(shè)計(jì)的3對(duì)引物(GDF9-1、GDF9-2和GDF9-3)，使用Tks Gflex DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增番鴨GDF9基因CDS區(qū)。PCR反應(yīng)總體系為50 μL：cDNA模板1 μL,2×Gflex PCR Buffer 25 μL,上、下游引物各1 μL,Tks Gflex DNA Polymerase 1 μL,ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段回收純化，并將回收純化的目的片段連接到pMDTM19-T克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，在平板上培養(yǎng)后挑出陽(yáng)性菌落并接種于液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫?fù)u床中搖菌8 h后可見(jiàn)液體培養(yǎng)基渾濁，然后進(jìn)行PCR鑒定，挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆送往北京睿博興科生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.4GDF9基因的RACE克隆 巢式PCR擴(kuò)增番鴨GDF9基因5′-端和3′-端完整序列。5′-RACE PCR反應(yīng)體系50 μL：cDNA模板1 μL,2×Gflex PCR Buffer 25 μL,Tks Gflex DNA Polymerase 1 μL,UPM Primer(試劑盒通用引物) 5 μL,5RACE-GSP1引物1 μL,ddH2O 17 μL。由于番鴨GDF9基因3′-端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，則采用巢式PCR擴(kuò)增，3′-RACE第一次PCR反應(yīng)體系50 μL：cDNA模板1 μL,2×Gflex PCR Buffer 25 μL,Tks Gflex DNA Polymerase 1 μL,Outer primer(試劑盒通用引物)1 μL,3RACE-GSP1引物 1 μL,ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。以第一次PCR產(chǎn)物為模板，3RACE-GSP2和試劑盒Inner為引物做巢式PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件與第一次一致。

5′-RACE 和3′-RACE最終的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收目的產(chǎn)物，進(jìn)行無(wú)縫克隆(infusion cloning)，無(wú)縫克隆的步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。挑選陽(yáng)性克隆菌液，提取質(zhì)粒并測(cè)序。

1.2.5 序列線(xiàn)性關(guān)系驗(yàn)證 使用驗(yàn)證引物F0和R0(GDF9-4)進(jìn)行線(xiàn)性驗(yàn)證，其中F0位于5′-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的中間位置，R0位于3′-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的中間位置，若引物組合可以擴(kuò)增到目的長(zhǎng)度片段，則證明試驗(yàn)獲得的5′-RACE和3′-RACE與目的條帶在一條直線(xiàn)上。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與3′-RACE PCR擴(kuò)增一致。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收目的產(chǎn)物，按說(shuō)明書(shū)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行無(wú)縫克隆，提取質(zhì)粒并測(cè)序，上述測(cè)序質(zhì)粒均送往北京睿博興科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 利用DNAStar v.7.1.0軟件對(duì)番鴨GDF9基因各段測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行拼接；利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中ORF finder在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)番鴨GDF9基因的CDS區(qū)；利用DNAMAN 8.0軟件將番鴨GDF9基因核苷酸序列翻譯為氨基酸序列；利用NCBI中的BLAST程序?qū)Σ煌锓N的GDF9基因的編碼序列進(jìn)行相似性比對(duì)；利用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用ProtParam程序(http:∥web.expasy.org/protparam/)分析番鴨GDF9蛋白的理化性質(zhì)，包括相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸組成、理論等電點(diǎn)和不穩(wěn)定系數(shù)等；利用ProtScale 在線(xiàn)軟件(http:∥web.expasy.org/protscale/)分析番鴨GDF9蛋白的親疏水性；利用NetPhos 3.1 Server程序(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)分析番鴨GDF9蛋白的磷酸化位點(diǎn)；利用NetOGlyc 4.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)和 NetNGlyc 1.0 Server程序(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNlyc/)預(yù)測(cè)番鴨GDF9蛋白的O-糖基化位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)；利用SMART v 8程序(http:∥smart.embl-heidelber.de/)預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域；用TMHMM Server v.2.0程序(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析番鴨GDF9蛋白跨膜區(qū)域；利用SignalP 3.0 Server程序(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號(hào)肽；利用PSORT Ⅱ Prediction程序(https:∥www.genscript.com/psort.html)分析番鴨GDF9蛋白的亞細(xì)胞定位；利用PSIPRED v.4.02程序(http:∥bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL在線(xiàn)軟件(http:∥www．swissmodel．expasy．org/)對(duì)GDF9蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模；利用STRING交互式數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www．string-db．org/)對(duì)蛋白相互作用進(jìn)行分析。

1.2.7 熒光定量PCR檢測(cè)GDF9基因mRNA相對(duì)表達(dá)量 以番鴨下丘腦、垂體、脾臟、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、十二指腸、卵巢和子宮組織cDNA序列為模板，以GAPDH為內(nèi)參基因，參照GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)番鴨GDF9基因的相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板1 μL，GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，Supplemental CXR Reference Dye 0.2 μL,ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ UDG孵育2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。然后分析熔解曲線(xiàn)，用2-△△Ct法計(jì)算GDF9基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)處理為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)學(xué)重復(fù)。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 利用Graphpad Prism 8.2.1軟件分析番鴨GDF9基因不同時(shí)期不同組織的相對(duì)表達(dá)量，同一時(shí)期不同組織間采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，同一組織不同時(shí)期采用獨(dú)立性t檢驗(yàn)，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著；P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 番鴨GDF9基因克隆及其序列分析

以番鴨卵巢cDNA為模板，以GDF9-1、GDF9-2、GDF9-3引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了3個(gè)目的條帶(圖1A、1B和1C)，經(jīng)過(guò)切膠回收目的產(chǎn)物并測(cè)序，分別獲得563、1 230、516 bp長(zhǎng)度的片段。5′-RACE和3′-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，分別獲得2個(gè)目的條帶(圖1D和1E)，切膠回收目的產(chǎn)物并測(cè)序，分別獲得408和363 bp長(zhǎng)度的片段，與預(yù)期結(jié)果一致。序列驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，得到1個(gè)目的條帶(圖1F)，切膠回收目的產(chǎn)物并測(cè)序，獲得1 786 bp長(zhǎng)度的片段，與預(yù)期結(jié)果一致。測(cè)序結(jié)果去除載體序列后用DNAStar v.7.1.0拼接得到番鴨GDF9基因完整序列，共2 024 bp，其中ATG是起始密碼子，TAG是終止密碼子。利用ORF finder在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)番鴨GDF9基因CDS區(qū)位于第55-1 434 bp處，共1 380 bp,編碼459個(gè)氨基酸；5′-UTR長(zhǎng)度為54 bp，3′-UTR長(zhǎng)度為590 bp。序列提交至GenBank，登錄號(hào)為：OL606748。

A～C，分別為GDF9-1、GDF9-2、GDF9-3引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；D，5′-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物；E，3′-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物；F，線(xiàn)性驗(yàn)證結(jié)果A-C,The PCR amplification results of GDF9-1,GDF9-2 and GDF9-3 primers;D,Amplification of 5′-RACE;E,Amplification of 3′-RACE;F,Linearity verification results圖1 番鴨GDF9基因PCR擴(kuò)增及序列驗(yàn)證Fig.1 PCR amplification and sequence verification of GDF9 gene in Muscovy duck

2.2 GDF9基因相似性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

番鴨GDF9基因序列與GenBank已公布的鳳頭潛鴨(XM_032196611.1)、綠頭鴨(XM_013104015.4)、天鵝(XM_035560815.1)、棕硬尾鴨(XM_035338369.1)、浙東白鵝(XM_013175813.1)、企鵝(XM_009285943.1)、雞(NM_206988.2)、牛(NM_174681.2)、綿羊(NM_001142888.2)、豬(NM_001001909.1)和小鼠(XM_006532220.5)對(duì)應(yīng)序列的相似性依次為98.8%、97.5%、96.4%、95.8%、94.4%、90.2%、87.5%、64.5%、64.2%、63.9%和60.6%(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，番鴨與鳳頭潛鴨的親緣關(guān)系最近，與綠頭鴨的親緣關(guān)系較近，與小鼠的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)，進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果與分類(lèi)學(xué)保持了較高的一致性。

2.3 番鴨GDF9蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性、蛋白翻譯后位點(diǎn)修飾和結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)預(yù)測(cè)

預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，番鴨GDF9蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量為 52.81 ku，分子式為C2337H3663N671O676S26，等電點(diǎn)為8.96，失穩(wěn)指數(shù)為61.67，屬不穩(wěn)定蛋白。共編碼459個(gè)氨基酸，GDF9蛋白由20種氨基酸組成，氨基酸組成見(jiàn)表2。其中，亮氨酸(Leu)所占比例最高，為10.9%，色氨酸(Trp)所占比例最低，僅為1.5%。帶負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)共48個(gè)，帶正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)共60個(gè)，說(shuō)明番鴨GDF9蛋白可能為堿性蛋白；脂肪族氨基酸指數(shù)為79.22；利用ProtScale在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白(圖4)。NetPhos 3.1 Server在線(xiàn)分析軟件預(yù)測(cè)GDF9蛋白可能存在45個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)31個(gè)，蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)9個(gè)，酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)5個(gè)(圖5)；NetOGlyc 4.0 Server在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)GDF9蛋白O-糖基化位點(diǎn)有8個(gè)，分別位于氨基酸序列的第20、28、34、176、180、204、226和457位(圖6)；NetNGlyc 1.0 Server在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)GDF9蛋白存在3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別位于氨基酸序列的第245、277和343位(圖7)。SMART程序預(yù)測(cè)在第358-459位氨基酸處存在1個(gè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta(TGF-β)結(jié)構(gòu)域(圖8)。

圖2 不同物種間GDF9基因核苷酸相似性比對(duì)Fig.2 Similarity alignment of nucleotide sequences of GDF9 gene in different species

圖3 GDF9基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of GDF9 gene sequence

表2 番鴨GDF9蛋白的氨基酸組成

續(xù)表

圖4 番鴨GDF9蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of hydrophilicity of GDF9 protein in Muscovy duck

圖5 番鴨GDF9蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of phosphorylation sites of GDF9 protein in Muscovy duck

圖6 番鴨GDF9蛋白的O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of O-glycosylation sites of GDF9 protein in Muscovy duck

圖7 番鴨GDF9蛋白的N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of N-glycosylation sites of GDF9 protein in Muscovy duck

圖8 番鴨GDF9蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.8 Prediction of structural domain of GDF9 protein in Muscovy duck

2.4 番鴨GDF9蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位

利用TMHMM Server v.2.0 在線(xiàn)軟件進(jìn)行跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明該蛋白均位于膜外區(qū)域，是膜外蛋白(圖9)。SingalP 3.0 Server在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDF9蛋白存在1個(gè)信號(hào)肽區(qū)，位于第1—24位氨基酸處，信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)位于第24—25位氨基酸之間(圖10)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，番鴨GDF9蛋白有65.2%的可能性存在于細(xì)胞核上，而位于線(xiàn)粒體上的概率是26.1%，位于細(xì)胞質(zhì)上的概率為4.3%，位于細(xì)胞骨架上的概率為4.3%。

2.5 番鴨GDF9蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用PSIPRED v.4.02在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，番鴨GDF9蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、T-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲分別為22.22%、2.61%、16.56%和58.61%(圖11)。利用SWISS-MODEL在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)GDF9蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其無(wú)規(guī)則卷曲占比最多(圖12)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖9 番鴨GDF9蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 Prediction of transmembrane structure of GDF9 protein in Muscovy duck

圖10 番鴨GDF9蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.10 Prediction of signal peptide of GDF9 protein in Muscovy duck

2.6 番鴨GDF9蛋白相互作用分析

利用STRING交互式數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)GDF9蛋白相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GDF9蛋白可能與BMP15、BMPR1B、BMPR2、TGFBR1、ACVR1B、POF1B、ZP2、ZAR1、MOS等蛋白存在相互作用(圖13)。

2.7 GDF9基因在就巢期和產(chǎn)蛋期番鴨的組織表達(dá)圖譜

由圖14知，所檢測(cè)的就巢期和產(chǎn)蛋期番鴨各組織中均有GDF9基因的表達(dá)，其中兩個(gè)時(shí)期卵巢中的表達(dá)量均最高，且極顯著高于同一時(shí)期其他組織基因表達(dá)量(P<0.01)。同一組織不同時(shí)期相比，就巢期番鴨GDF9基因在脾臟、心臟和腎臟的表達(dá)量顯著或極顯著低于產(chǎn)蛋期(P<0.05；P<0.01)，在卵巢中的表達(dá)量極顯著高于產(chǎn)蛋期(P<0.01)，其他組織中的表達(dá)量在兩個(gè)時(shí)期間差異均不顯著(P>0.05)。

GDF9，生長(zhǎng)分化因子9；BMP15，骨形態(tài)發(fā)生蛋白15；ZP2，透明帶糖蛋白2；ZAR1，合子阻滯因子；POF1B，卵巢功能早衰1B；BMPR1B，骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B；BMPR2，骨形態(tài)發(fā)生蛋白Ⅱ型受體；TGFBR1，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體1；ACVR1B，激活素受體1B；MOS，莫洛氏鼠類(lèi)肉瘤病毒癌基因的同源蛋白產(chǎn)物GDF9，Growth differentiation factor 9；BMP15，Bone morphogenetic protein 15；ZP2，Zona pellucida glycoprotein 2；ZAR1，Zygote arrest 1；POF1B，POF1B actin binding protein；BMPR1B，Bone morphogenetic protein receptor type 1B；BMPR2，Bone morphogenetic protein receptor type 2；TGFBR1，Transforming growth factor beta receptor 1；ACVR1B，Activin A receptor type 1B；MOS，MOS proto-oncogene,serine/threonine kinase圖13 番鴨GDF9蛋白與其他蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.13 Interaction network of GDF9 protein in Muscovy ducks with other proteins

①1，下丘腦；2，垂體；3，脾臟；4，心臟；5，腎臟；6，肝臟；7，肺臟；8，十二指腸；9，卵巢；10，子宮。②同一時(shí)期不同組織進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。③同一組織不同時(shí)期相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無(wú)*，差異不顯著(P>0.05)①1,Hypothalamus;2,Pituitary;3,Spleen;4,Heart;5,Kidney;6,Liver;7,Lung;8,Duodenum;9,Ovary;10,Uterus.②Compared different organizations in the same period,values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).③Compared with different periods of the same organization,*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01);No *,No significant difference (P>0.05)圖14 番鴨GDF9基因的組織表達(dá)分析Fig.14 Tissue expression analysis of GDF9 gene in Muscovy ducks

3 討 論

GDF9基因作為T(mén)GF-β超家族的重要成員之一。通過(guò)激活細(xì)胞膜上的絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)激酶的受體(ALK5和BMPRⅡ)來(lái)調(diào)控動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育[22]。目前，GDF9在番鴨上的研究鮮有報(bào)道，本試驗(yàn)通過(guò)RACE技術(shù)成功克隆了番鴨GDF9基因的完整序列。其中CDS區(qū)共1 380 bp,編碼459個(gè)氨基酸。對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)GDF9基因與鳳頭潛鴨、綠頭鴨、天鵝、棕硬尾鴨等物種相似性在95%以上，表明GDF9基因在禽類(lèi)具有高度保守性。 GDF9蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為61.67，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)達(dá)到40以上被認(rèn)為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。無(wú)規(guī)則卷曲是影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要因素，GDF9蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，無(wú)規(guī)則卷曲占比為58.61%，這與預(yù)測(cè)結(jié)果中其為不穩(wěn)定蛋白結(jié)果相一致[23]。GDF9蛋白可能與POF1B[24]、ZP2[25]、ZAR1[26]等在卵巢發(fā)育中發(fā)揮重要功能的蛋白有關(guān)，GDF9可能與這些基因共同在卵巢中發(fā)揮交互作用。

蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后最主要的修飾方法之一[27],參與調(diào)控細(xì)胞增殖、化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[28]、細(xì)胞凋亡[29]等重要生理過(guò)程。經(jīng)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)番鴨GDF9蛋白PTM磷酸化位點(diǎn)豐富，說(shuō)明GDF9基因可能參與復(fù)雜的生理學(xué)過(guò)程。當(dāng)絲氨酸或蘇氨酸的激酶受體(ALK5和BMPRⅡ)與GDF9結(jié)合后，受體間會(huì)形成異源二聚體復(fù)合物，Ⅱ型受體(BMPRⅡ)激活Ⅰ型受體(ALK5和ALK6)。當(dāng)Ⅰ型受體被激活后，受特異性受體調(diào)控的SMAD蛋白(RSMAD)發(fā)生磷酸化反應(yīng)，與普通SMAD(SMAD4或Co-SMAD)蛋白相互作用傳導(dǎo)信號(hào)入核，引發(fā)轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程從而完成信號(hào)傳導(dǎo)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，GDF9基因被認(rèn)為促進(jìn)鼠體內(nèi)的顆粒細(xì)胞增殖和DNA合成[30]，促進(jìn)雞的顆粒細(xì)胞周期進(jìn)程，加強(qiáng)DNA復(fù)制過(guò)程并且抑制細(xì)胞凋亡[18]。說(shuō)明本研究中預(yù)測(cè)到的這些位點(diǎn)可能在番鴨卵泡顆粒細(xì)胞的細(xì)胞增殖和分化，細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等重要生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

本研究中檢測(cè)了就巢期和產(chǎn)蛋期兩個(gè)時(shí)期番鴨各組織表達(dá)量中GDF9的mRNA表達(dá)圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GDF9在番鴨的下丘腦、垂體、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸、卵巢和子宮中均有表達(dá)，在產(chǎn)蛋期和就巢期的卵巢組織中高度表達(dá)，在其他組織中微量表達(dá)。結(jié)果說(shuō)明GDF9在番鴨的生殖器官中發(fā)揮著重要作用，可能對(duì)其他組織器官也具有一定的作用。這種在卵巢組織中高表達(dá)模式的結(jié)果與羊[31]、牛[32]等物種的GDF9基因表達(dá)量一致。胡冬利等[33]在湖羊的研究發(fā)現(xiàn)，GDF9基因是湖羊卵巢中的差異表達(dá)基因，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。在本試驗(yàn)中，就巢期番鴨卵巢GDF9基因表達(dá)量極顯著高于產(chǎn)蛋期番鴨卵巢GDF9基因表達(dá)量，說(shuō)明GDF9基因?yàn)榉喡殉舶l(fā)育中的差異表達(dá)基因，參與番鴨的卵泡發(fā)育過(guò)程。而何遠(yuǎn)清[34]利用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)山羊不同GDF9基因型卵巢組織中GDF9基因的表達(dá)量進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同基因型山羊GDF9基因在同一時(shí)期卵巢GDF9基因表達(dá)量存在顯著差異且突變型個(gè)體表達(dá)量最高，可能是GDF9基因的高表達(dá)量水平維持卵泡生長(zhǎng)發(fā)育，但這與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，猜測(cè)其原因?yàn)榉喤c山羊存在不同的卵泡發(fā)育機(jī)制。

GDF9基因在調(diào)控卵泡顆粒細(xì)胞增殖中存在物種差異性。Hickey[35]發(fā)現(xiàn)，GDF9可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細(xì)胞增殖；Vitt等[30]在大鼠中研究發(fā)現(xiàn)，GDF9也可以促進(jìn)大鼠排卵前卵泡顆粒細(xì)胞增殖；但李金秋[7]在雞中的報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在一定濃度的外源GDF9蛋白范圍內(nèi)，GDF9都抑制了顆粒細(xì)胞的活性，并且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。而本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，就巢期番鴨的GDF9基因表達(dá)量極顯著高于產(chǎn)蛋期，猜測(cè)這一現(xiàn)象可能是因?yàn)镚DF9基因表達(dá)量過(guò)高抑制番鴨卵泡顆粒細(xì)胞增殖，且大鼠、豬和家禽的卵泡發(fā)育機(jī)制不同。后續(xù)研究將以番鴨卵巢的顆粒細(xì)胞為試驗(yàn)材料，研究其抑制顆粒細(xì)胞增殖的遺傳機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了番鴨GDF9基因的CDS區(qū)，全長(zhǎng)1 380 bp,編碼459 個(gè)氨基酸。相似性比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，番鴨GDF9基因與鳳頭潛鴨和綠頭鴨的親緣關(guān)系較近，與小鼠的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；GDF9蛋白是一種不穩(wěn)定的堿性親水膜外蛋白，磷酸化位點(diǎn)、O-糖基化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)豐富，存在1個(gè)TGF-β結(jié)構(gòu)域，主要二級(jí)結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)則卷曲。GDF9基因在番鴨各組織中均有表達(dá)，但在卵巢組織極顯著表達(dá)。GDF9基因?yàn)楫a(chǎn)蛋期和就巢期在卵巢、心臟、腎臟、脾臟的差異表達(dá)基因。該研究為進(jìn)一步探索番鴨中GDF9基因的功能提供了理論依據(jù)，也為研究GDF9基因在卵巢發(fā)育中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。