吳 艷，皮勁松，張 昊，梁振華，杜金平，潘愛(ài)鑾，申 杰，蒲躍進(jìn)

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064；2.動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064)

卵泡發(fā)育與蛋鴨的產(chǎn)蛋性能密切相關(guān)，直接影響蛋鴨的產(chǎn)蛋量。顆粒細(xì)胞是卵泡中主要的功能細(xì)胞，其增殖分化或凋亡對(duì)卵泡發(fā)育具有重要的調(diào)控作用[1-2]。顆粒細(xì)胞可以調(diào)節(jié)垂體釋放促卵泡素(FSH)來(lái)影響卵泡發(fā)育，也可作為局部調(diào)節(jié)因子調(diào)控類固醇激素生成和細(xì)胞增殖，由此可見(jiàn)，顆粒細(xì)胞是卵泡生長(zhǎng)發(fā)育所必需的。禽類的卵泡在發(fā)育過(guò)程中大量發(fā)生閉鎖，Johnson等[3]發(fā)現(xiàn)，雞卵泡閉鎖起始于顆粒層并受顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程的調(diào)節(jié)。

microRNA(miRNA)作為一類小的單鏈內(nèi)源性非編碼RNA[4]，根據(jù)與靶mRNA的互補(bǔ)程度，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶mRNA的降解或翻譯抑制[5]。miRNA參與卵泡發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，包括卵泡生長(zhǎng)、排卵及閉鎖過(guò)程[6]，并且在卵泡發(fā)育的調(diào)控方面也發(fā)揮著重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，許多miRNA參與調(diào)控畜禽卵泡顆粒細(xì)胞的增殖分化[7-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-145-4可以靶向DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子3(DDIT3)調(diào)控蛋鴨卵泡發(fā)育[12]。目前關(guān)于miR-145-4在蛋鴨卵泡顆粒細(xì)胞中的功能及作用機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以蛋鴨卵泡顆粒細(xì)胞為細(xì)胞模型，探究miR-145-4對(duì)蛋鴨卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用和機(jī)制，以期為進(jìn)一步完善miR-145-4在蛋鴨卵泡顆粒細(xì)胞中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所家禽育種場(chǎng)。選取在相同條件下飼養(yǎng)的健康、處于產(chǎn)蛋高峰期(300日齡左右)的母鴨5～10只，用于顆粒細(xì)胞分離，并采集翅靜脈血樣0.5 mL，提取基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、含EDTA的胰酶稀釋液、PBS緩沖液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素均購(gòu)自HyClone公司；Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑盒、Opti-MEM?試劑均購(gòu)自Invitrogen；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司；SYBR Green qPCR Mix、PmeⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購(gòu)自Thermo公司；KOD-FX酶購(gòu)自TOYOBO公司；凝膠DNA小量回收試劑盒和無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；熒光定量PCR酶購(gòu)自Bio-Rad公司；pmirGLO載體為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所家禽育種實(shí)驗(yàn)室保存；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 蛋鴨卵泡顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng) 選擇產(chǎn)蛋期蛋鴨，頸靜脈放血后取整個(gè)卵巢組織，置于裝有預(yù)冷PBS的無(wú)菌培養(yǎng)皿中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，用加有雙抗的PBS清洗數(shù)次。將漂洗干凈的卵泡移入裝有預(yù)冷PBS的平皿中，剝凈卵泡外膜、結(jié)締組織及血管網(wǎng)，劃破卵泡后釋放卵黃，將漂洗干凈的卵泡膜盡量剪碎，置于15 mL離心管中，加4 mL培養(yǎng)基反復(fù)吹打1 min，4 ℃、1 000 r/min離心后棄上清；加入4 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶，重懸沉淀，置于37 ℃恒溫?fù)u床80 r/min消化30 min，加入4 mL M199完全培養(yǎng)基(含10%血清)終止消化[13]；用200目不銹鋼篩過(guò)濾，收集濾液，4 ℃、1 000 r/min離心10 min后收集細(xì)胞，加入M199完全培養(yǎng)基(含10% FBS及1%雙抗)重懸，測(cè)定細(xì)胞密度后接種于6孔培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h后可用于后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)。

1.2.2 顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染 本課題組前期測(cè)序獲得miR-145-4的序列為：5′-GUCCAGUUUUCCCAG-GAAUCCCUUA-3′(未發(fā)表),根據(jù)其序列設(shè)計(jì)其相似物(mimic)、抑制物(inhibitor)、mimic-NC和inhibitor-NC(表1)，序列均由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。 顆粒細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，按照Lipofectamine?3000說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染終濃度為100 nm/μL的miR-145-4的mimic和inhibitor，對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染mimic-NC和inhibitor-NC。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，24 h后利用Trizol收集細(xì)胞樣品。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量 利用TRizol試劑提取處理前后的卵泡顆粒細(xì)胞總RNA，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用熒光定量試劑盒SYBR Green qPCR Mix分別檢測(cè)miR-145-4、增殖凋亡標(biāo)志基因CyclinB2(登錄號(hào)：XM_027467130)和BCL2(登錄號(hào)：XM_027451679)以及miR-145-4靶基因PIK3CA(登錄號(hào)：XM_027464233)的表達(dá)情況，引物見(jiàn)表1。引物均由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成。各個(gè)基因的表達(dá)量計(jì)算分別以U6 和β-actin(登錄號(hào)：NM_001310421)為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板1 μL，SYBR Green qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。

表1 miR-145-4相關(guān)序列及定量引物序列

續(xù)表

1.2.4 靶基因預(yù)測(cè)與載體構(gòu)建 根據(jù)在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站Targetscan (http:∥www.targetscan.org/vert_72/)和BiBiServ中的RNAHybrid (https:∥bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)進(jìn)行miR-145-4的靶基因預(yù)測(cè)與結(jié)合位點(diǎn)分析。針對(duì)蛋鴨PIK3CA基因3′-UTR中與miR-145-4結(jié)合位點(diǎn)突變前后的序列，分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增突變前后PIK3CA基因3′-UTR片段，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系20 μL：蛋鴨血液DNA模板1 μL，10×Buffer 10 μL，上、下游引物各1 μL，KOD-FX酶 1 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收后和pmirGLO質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，經(jīng)過(guò)膠回收后連接，分別獲得野生型(PIK3CA-wt)和突變型重組載體(PIK3CA-mut)，將構(gòu)建的PIK3CA-wt和PIK3CA-mut載體送武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序，驗(yàn)證載體構(gòu)建結(jié)果。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)熒光素酶活性 將pmirGLO、PIK3CA-wt和PIK3CA-mut載體分別與miR-145-4 mimic和mimic-NC共轉(zhuǎn)染蛋鴨卵泡顆粒細(xì)胞。按照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，測(cè)定螢火蟲(chóng)熒光素酶(firefly luciferase，F(xiàn)L)和海腎熒光素酶(ranilla luciferase，RL)強(qiáng)度，根據(jù)FL/RL比值來(lái)判斷相對(duì)熒光素酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，使用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[14]，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，利用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行作圖。兩組樣本平均值比較采用t檢驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 miR-145-4對(duì)鴨顆粒細(xì)胞增殖凋亡的影響

利用合成的miR-145-4 mimic和inhibitor分別轉(zhuǎn)染鴨卵泡顆粒細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-145-4及增殖凋亡關(guān)鍵基因CyclinB2和BCL2表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，過(guò)表達(dá)miR-145-4后，與對(duì)照組相比，miR-145-4表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，細(xì)胞增殖標(biāo)記基因CyclinB2表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因BCL2表達(dá)量極顯著增加(P<0.01)；而抑制miR-145-4后，miR-145-4表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，CyclinB2基因表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)、BCL2基因表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明miR-145-4促進(jìn)了蛋鴨卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡。

①A，轉(zhuǎn)染miR-145-4 mimic后miR-145-4的表達(dá)情況；B，轉(zhuǎn)染miR-145-4 inhibitor后miR-145-4的表達(dá)情況；C，轉(zhuǎn)染miR-145-4 mimic后CyclinB2和BCL2基因表達(dá)情況；D，轉(zhuǎn)染miR-145-4 inhibitor后CyclinB2和BCL2基因表達(dá)情況。②*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。圖5、6同①A，The expression of miR-145-4 after transfected miR-145-4 mimic;B，The expression of miR-145-4 after transfected miR-145-4 inhibitor;C，The expression of CyclinB2 and BCL2 genes after transfected miR-145-4 mimic;D，The expression of CyclinB2 and BCL2 genes after transfected miR-145-4 inhibitor.②*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01).The same as fig.5 and fig.6圖1 過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)miR-145-4后相關(guān)基因表達(dá)情況Fig.1 The expression of related genes after overexpression and inhibition of miR-145-4

2.2 miR-145-4靶基因預(yù)測(cè)與載體構(gòu)建

通過(guò)Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-145-4的靶基因，共預(yù)測(cè)到1 680個(gè)靶基因，從中挑選與細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)的基因PIK3CA為靶基因。將PIK3CA基因3′-UTR序列和miR-145-4序列導(dǎo)入RNAHybrid網(wǎng)站中分析二者的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，miR-145-4與PIK3CA基因的潛在結(jié)合位點(diǎn)位于208—232 bp之間。根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)突變前后的序列分別構(gòu)建野生型(PIK3CA-wt)和突變型(PIK3CA-mut)載體。對(duì)構(gòu)建的野生型和突變型載體分別進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示野生型和突變型載體的PIK3CA目的片段長(zhǎng)度為240 bp、載體長(zhǎng)度為7 350 bp(圖3)，與預(yù)期一致，說(shuō)明質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。對(duì)構(gòu)建的野生型和突變型載體進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示野生型載體的序列與參考序列一致，突變型載體的序列，從GATTT突變?yōu)镚CTCA(圖4)，與預(yù)期結(jié)果一致，可用于后續(xù)研究。

2.3 miR-145-4與PIK3CA基因靶向結(jié)合關(guān)系驗(yàn)證

用pmirGLO、PIK3CA-wt、PIK3CA-mut分別與miR-145-4 mimic、miR-145-4 mimic-NC分別共轉(zhuǎn)染鴨卵泡顆粒細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞檢測(cè)熒光活性，結(jié)果見(jiàn)圖5。 由圖5可以看出，共轉(zhuǎn)染miR-145-4 mimic和PIK3CA-wt載體后，與PIK3CA-mut及空載體共轉(zhuǎn)染組相比，其雙熒光素酶活性均極顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明miR-145-4能夠與PIK3CA基因3′-UTR結(jié)合。

圖2 miR-145-4與PIK3CA基因的潛在結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.2 Prediction results of potential binding sites between miR-145-4 and PIK3CA gene

M，DL5000 DNA Marker；1，PIK3CA-wt；2，PIK3CA-mut圖3 野生型與突變型載體雙酶切結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results of wild and mutant type vector

圖4 野生型與突變型載體測(cè)序結(jié)果Fig.4 The sequencing results of wild and mutant type vector

圖5 miR-145-4與PIK3CA的3′-UTR結(jié)合關(guān)系的雙熒光素酶驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Double luciferase verification results of the binding relationship between miR-145-4 and 3′-UTR of PIK3CA

2.4 miR-145-4對(duì)PIK3CA基因表達(dá)的影響

利用miR-145-4 mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染鴨顆粒細(xì)胞后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PIK3CA基因的表達(dá)變化，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，當(dāng)過(guò)表達(dá)miR-145-4后，PIK3CA基因表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，而抑制miR-145-4后PIK3CA基因表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)(圖6)。

圖6 過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)miR-145-4后PIK3CA基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of PIK3CA gene after overexpression and inhibition of miR-145-4

3 討 論

miRNA是一類長(zhǎng)度19～24 nt的非編碼單鏈RNA，常通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因的3′-UTR部分或完全互補(bǔ)，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，從而起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)的作用。已有研究表明，miRNAs參與卵泡發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，包括卵泡生長(zhǎng)、排卵及閉鎖過(guò)程[15]，并且在卵泡發(fā)育的調(diào)控方面也發(fā)揮著重要作用。Wu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-gga-miR-200a-3p在雞的生殖調(diào)控中具有重要的作用。Kang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，mir-26a-5p通過(guò)靶向TNRC5A基因促進(jìn)雞卵巢中卵泡膜細(xì)胞的增殖。而關(guān)于miRNA參與蛋鴨卵泡發(fā)育的研究報(bào)道較少，因此本試驗(yàn)開(kāi)展了蛋鴨miRNA調(diào)控卵泡發(fā)育的相關(guān)研究。

已有研究表明，miR-145作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控mRNA表達(dá)的miRNA，抑制肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及血管生成[18]；通過(guò)降低基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移,促進(jìn)調(diào)亡[19]；通過(guò)靶向作用激活素受體IB抑制小鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖[20]等。 本研究結(jié)果顯示，miR-145-4促進(jìn)了蛋鴨卵泡顆粒細(xì)胞凋亡，說(shuō)明miRNA對(duì)蛋鴨卵泡發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。

經(jīng)典的miRNA作用方式是miRNA通過(guò)與靶基因的3′-UTR 結(jié)合抑制靶基因的表達(dá)，繼而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。miRNA靶基因眾多，在不同發(fā)育階段或組織細(xì)胞中起主效作用的靶基因可能存在差異，而單個(gè)靶基因又會(huì)同時(shí)受到多個(gè)miRNA調(diào)控，共同構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[21-22]。Wu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-145-4可以靶向DDIT3基因調(diào)控蛋鴨卵泡發(fā)育。本研究使用Targetscan網(wǎng)站共預(yù)測(cè)到1 680個(gè)miR-145-4的靶基因，從中挑選與細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)的基因，確定PIK3CA基因作為候選靶基因，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示，miR-145-4可以靶向PIK3CA基因。已有研究報(bào)道，PIK3CA參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展[23],PIK3CA基因的突變與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)[24]。本研究結(jié)果表明，PIK3CA基因中存在miR-145-4的結(jié)合位點(diǎn)，利用雙熒光素酶法驗(yàn)證了二者之間的結(jié)合關(guān)系；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-145-4通過(guò)靶向PIK3CA基因促進(jìn)了蛋鴨卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而參與了蛋鴨卵泡發(fā)育的調(diào)控過(guò)程。本研究首次明確了PIK3CA基因?yàn)閙iR-145-4的靶基因，并初步明確了二者在蛋鴨卵泡顆粒細(xì)胞中的作用及可能的調(diào)控機(jī)制，為深入探究miRNA 在禽類卵巢顆粒細(xì)胞中的功能提供理論依據(jù)，但miR-145-4在蛋鴨卵泡發(fā)育中的功能及其作用機(jī)理尚待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-145-4促進(jìn)了蛋鴨卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡；預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其靶基因PIK3CA3′-UTR存在miR-145-4的結(jié)合位點(diǎn)，利用雙熒光素酶活性檢測(cè)驗(yàn)證了miR-145-4能夠與PIK3CA基因3′-UTR結(jié)合并發(fā)揮調(diào)控作用；過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)miR-145-4后PIK3CA基因的表達(dá)量顯著升高或降低。綜上，推測(cè)miR-145-4通過(guò)靶向PIK3CA基因促進(jìn)了蛋鴨卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡。