摘要：目的： 觀察消毒愈肌膏對(duì)糖尿病足大鼠潰瘍皮膚組織糖含量和成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 。方法： 將 Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組5只、模型組10只、中藥組10只。制作糖尿病足大鼠模型，模型組和空白組： 常規(guī)飲食，在患處應(yīng)用無(wú)菌鹽水，無(wú)菌紗布包扎，每二天換藥 1 次。中藥組： 患處消毒愈肌膏，無(wú)菌紗布包扎，每二天換藥 1 次。觀察 3 周。在不同時(shí)間段觀察皮膚糖含量的變化和創(chuàng)面的愈合程度，電鏡觀察成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：治療1周后，模型組和中藥組創(chuàng)面愈合率明顯低于空白組，有顯著性差異（ P <0.05） ; 中藥組創(chuàng)面愈合率明顯高于模型組，有顯著性差異（ P < 0.05） ; 治療2、3周后，模型組、中藥組創(chuàng)面愈合率明顯小于空白組，有顯著性差異（P <0.05） ; 中藥組創(chuàng)面愈合率明顯高于模型組，有顯著性差異（P <0.05） 。糖尿病足模型大鼠皮膚組織糖含量明顯高于中藥組和空白組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而中藥組大鼠皮膚組織糖含量明顯高于空白組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論： 消毒愈肌膏促進(jìn)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合，能降低局部糖含量，糾正成纖維細(xì)胞增值與凋亡平衡。

關(guān)鍵詞：糖尿病足; 消毒愈肌膏; 成纖維細(xì)胞

【中圖分類號(hào)】 R587.1? ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A? ? ? 【文章編號(hào)】2107-2306（2022）03--02

糖尿病足是糖尿病并發(fā)癥之一，其創(chuàng)面的難以愈合成 為醫(yī)學(xué)者關(guān)注的問(wèn)題[1- 2]。成纖維細(xì)胞的增值與凋亡異常也是創(chuàng)面的難以愈合因素之一[3]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)消毒愈 肌膏對(duì)糖尿病足大鼠潰瘍組織的干預(yù)，初步觀察糖尿病足大鼠皮膚高糖狀態(tài)下，成纖維細(xì)胞形態(tài)變化，探討消毒愈肌膏防治糖尿病足作用機(jī)制。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠25只，體質(zhì)量（180-230） g，購(gòu)于購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心溫度、濕度、通風(fēng)良好。

1.2 試劑與儀器

消毒愈肌膏（ 發(fā)明專利號(hào)： 201310535598.X） ; 溶解鏈脲佐菌素（ STZ） ，美國(guó) Sigma 公司; 低溫高 速離心機(jī)（ 湖南湘立科學(xué)儀器有限公司） ; 透射電鏡，電子天平，電腦生物組織脫水機(jī)切片刀。

1.3 方法

1.3.1 分組與模型制備

25只Wistar大鼠常規(guī)喂養(yǎng)一周后隨機(jī)數(shù)字隨機(jī)分為 3 組： 空白組5只、模型組10只、中藥組10只。將模型組、中藥組，禁食 12 h 后， 以 1% 濃度，55.0 mg / kg 的劑量 STZ 腹腔注射，1 周后， 每隔 1 d 監(jiān)測(cè)空腹血糖，連續(xù)3次，血 糖均在 16.7mmol /mL 以上，即為 1 型大鼠糖尿病造模成功。將各組大鼠按 0.3 ml/kg 腹腔注射 10% 的水合氯醛麻醉，根據(jù)目前對(duì)大鼠 DFUs 模型的報(bào)道本實(shí)驗(yàn)在糖尿病大鼠的雙后足背部各做一 3 mm×7 mm 的全層矩形皮膚缺損，視為足部潰瘍?cè)炷３晒?，并記為?0 天。 其飼養(yǎng)密度為 3 只/籠，每天跟換1次墊料，每天換水1次，每二天用 0.5%的碘伏對(duì)足部潰瘍消毒 1 次。

瘍大鼠模型。

1.3.2 處理方法

模型組和空白組：常規(guī)飲食，在患處應(yīng)用無(wú)菌鹽水，無(wú)菌紗布 包扎，每二天換藥 1 次。中藥組：常規(guī)飲食，患處消毒愈肌方外敷，無(wú)菌油紗條外敷，無(wú)菌紗布包扎，每二天換藥 1 次。觀察3周。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1創(chuàng)面的愈合率 足背創(chuàng)面拍照，應(yīng)用軟件測(cè)算創(chuàng)面 面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率： 愈合率 = （ 1-當(dāng)前測(cè)量面積 ÷ 原始創(chuàng)面面積） × 100% 。

1.4.2皮膚組織糖含量測(cè)定：取皮膚組織塊，稱質(zhì)量（約為0.2g），冰浴下剪碎，加入預(yù)冷的0.24mol/L Ba（OH）2 的溶液1.5ml，勻漿，離心半徑14cm，3000r/min，離心10min，上清液計(jì)量后，Beckmancs 生化自動(dòng)分析儀檢測(cè)葡萄糖濃度。按照下列公式計(jì)算，皮膚糖含量每克皮膚糖含量毫克每升。

每克皮膚糖含量（mg/g皮膚）=[上清液體積（ml）×糖濃度（mmol/L）×180]/皮膚組織塊濕量（g）×10-3

1.4.3透射電鏡觀察? 取出固定完成的標(biāo)本，0.1M磷酸緩沖液漂洗3次，1%的鋨 酸、0.1M 磷酸緩沖液固定2小時(shí)，脫水，滲透，包埋，切片，染色，封片，電鏡下觀察糖尿病足皮膚超微結(jié)構(gòu)。

2.結(jié)果

2.1各組創(chuàng)面愈合率比較

治療1周后，模型組和中藥組創(chuàng)面愈合率明顯低于空白組，有顯著性差異（ P <0.05） ; 中藥組創(chuàng)面愈合率明顯高于模型組，有顯著性差異（ P < 0.05） ; 治療2、3周后，模型組、中藥組創(chuàng)面愈合率明顯小于空白組，有顯著性差異（P <0.05） ; 中藥組創(chuàng)面愈合率明顯高于模型組，有顯著性差異（P <0.05） ，見(jiàn)表1

2.2皮膚組織糖含量測(cè)定：糖尿病足模型大鼠皮膚組織糖含量明顯高于中藥組和空白組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而中藥組大鼠皮膚組織糖含量明顯高于空白組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2

2.3電鏡對(duì)糖尿病足皮膚超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示：消毒愈肌”外用方促進(jìn)微血管的再生，抗成纖維細(xì)胞凋亡。

2.3.1微血管：

正常組：血管內(nèi)皮細(xì)胞正常，細(xì)胞器多見(jiàn)，線粒體正常，基底膜正常（圖1）;模型組：內(nèi)皮細(xì)胞染色體有邊集，管腔內(nèi)細(xì)胞較多，血管水腫，線粒體空化（圖 2）;中藥組：內(nèi)皮細(xì)胞正常，線粒體基本正常，部分空化，基底膜基本清晰（圖 3）

2.3.2成纖維細(xì)胞

正常組：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體發(fā)達(dá)，線粒體中等量（圖 4）;模型組：細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，核間隙增寬，細(xì)胞器減少，線粒體空化（圖 5）;中藥組：線粒體空化、水腫，細(xì)胞核基本正常，核膜清晰，多見(jiàn)正常細(xì)胞器（圖 6）。

3.討論

導(dǎo)致糖尿病足（DF）形成的危險(xiǎn)因素有很多，主要包括糖尿病神經(jīng)病變、外周血管病變、感染概率的增加以及糖尿病皮膚病變。高血糖狀態(tài)下，線粒體產(chǎn)生大量 ROS，使氧 化應(yīng)激水平增高，通過(guò)損害內(nèi)皮細(xì)胞、線粒體，導(dǎo)致異常代謝通路激活，促進(jìn)炎性反應(yīng)等， 從而加重 DF 的發(fā)展[4-5]。吳海霞[5]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病慢性皮膚潰瘍組患者血清中脂質(zhì)過(guò)氧化 產(chǎn)物 MDA 水平明顯升高，而 CAT、SOD 和 GSHPX 水平明顯降低;NADPH 氧化酶亞基p22、p47、p67 及 gp91 表達(dá)明顯升高（P<0.05） ，且細(xì)胞凋亡蛋白 Bax、Caspase3 和 Ccaspase9 表達(dá)明顯升高，而 Bcl2 表達(dá)明顯降低;同時(shí)，糖尿病慢性皮膚潰瘍組患者 血清中炎癥因子 TNF-α、IL-2、IL-6 和 IL-10 水平明顯升高。高血糖狀況下， 抗氧化酶糖基化，超氧化物岐化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 （GSH-Px）等抗氧化酶活性降低，活性氧物質(zhì)增多，細(xì)胞氧化和抗氧化狀態(tài)失衡，導(dǎo)致細(xì)胞 內(nèi) ROS 生成增加。高血糖是產(chǎn)生氧化應(yīng)激的主要原因。

成纖維細(xì)胞是真皮內(nèi)的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)細(xì)胞和主要修復(fù)細(xì)胞之一， 真皮組織的正常代謝及創(chuàng)傷后修復(fù)主要依賴于成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為。增殖和凋亡是細(xì)胞生物學(xué)行為的主要指標(biāo)。眾多的氧化應(yīng)激對(duì)大鼠真皮成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響研究中觀察發(fā)現(xiàn)， 氧化應(yīng)激能導(dǎo)致大鼠真皮成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的異常， 細(xì)胞活力下降， 凋亡增加[7]。因此創(chuàng)面組織中氧化應(yīng)激增強(qiáng)， 那將可能導(dǎo)致創(chuàng)面難愈。

本研究中，筆者應(yīng)用的消毒愈肌膏依據(jù)與糖尿病足病理特點(diǎn)配伍 組成，黃連、黃柏、白芷、甘草、當(dāng)歸等 10 余味藥物組成，具有解毒消腫、生肌止痛作用。將消毒愈肌膏外用在糖尿病足大鼠局部皮膚上觀察發(fā)現(xiàn)中藥組創(chuàng)面愈合率明顯高于模型組，提示外用消毒愈肌膏可以促進(jìn)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合。同時(shí)檢測(cè)創(chuàng)面周?chē)つw的糖含量發(fā)現(xiàn)，中藥組糖含量明顯低于模型組，這一定證明消毒愈肌膏能降低局部糖含量，進(jìn)一步降低高糖環(huán)境下促發(fā)氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激，纖維細(xì)胞細(xì)胞活力提高， 凋亡減少，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。在電鏡觀察下，模型組纖維細(xì)胞表現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，核間隙增寬，細(xì)胞器減少，線粒體空化。而中藥組纖維細(xì)胞呈現(xiàn)線粒體空化、水腫，細(xì)胞核基本正常，核膜清晰，多見(jiàn)正常細(xì)胞器。這與課題中的假設(shè)相一致。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)我們將進(jìn)一步證明，消毒愈肌膏抗氧化作用，糾正纖維細(xì)胞增值與凋亡平衡。

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作者簡(jiǎn)介：李旗（1980 - ） ，男，山東煙臺(tái)人，副教授，碩士，研究方向： 中醫(yī)治療代謝性疾病。

基金項(xiàng)目：河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ H2019209565）