李 芮,劉 健,靳 楠,蔣佩珍,毛 月,唐旭東

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院血液科,北京 100091)

再生障礙性貧血(Aplastic anemia，AA)是由免疫功能紊亂導(dǎo)致的骨髓衰竭性疾病，主要以外周全血細(xì)胞減少、網(wǎng)織紅細(xì)胞減少為臨床表現(xiàn)。其發(fā)病與T淋巴細(xì)胞為主的免疫功能紊亂，造血微環(huán)境異常和造血干細(xì)胞損傷有關(guān)。AA屬中醫(yī)“虛勞”“髓勞”范疇，多因臟腑虛損，功能失常，復(fù)加致病因素干擾所致。黃芪、當(dāng)歸是臨床上常見的補(bǔ)益氣血之藥，常應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病的治療中。黃芪與當(dāng)歸常以不同劑量配伍應(yīng)用于各方中，黃芪∶當(dāng)歸為5∶1即當(dāng)歸補(bǔ)血湯，此方由金元四大家之一李東垣所創(chuàng)。該方記載于《內(nèi)外傷辨惑論》，主要治療血虛陽浮之發(fā)熱、氣血虧虛、勞倦內(nèi)傷等證[1]。當(dāng)歸甘、溫，可補(bǔ)血活血；黃芪甘、微溫，具有補(bǔ)氣健脾之功效，二者合用有補(bǔ)氣生血的作用。有研究顯示，當(dāng)歸補(bǔ)血湯在促進(jìn)造血，抗纖維化，調(diào)節(jié)免疫等方面有著重要作用[2]。黃芪主要成分包括皂苷類、黃酮類和多糖類等，當(dāng)歸中主要成分包括揮發(fā)油、有機(jī)酸及多糖類等[3]。黃芪∶當(dāng)歸以1∶1、5∶1比例配伍時，促進(jìn)造血效果最強(qiáng)，可有效提高外周血細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)骨髓造血功能，抑制骨髓造血細(xì)胞消亡[4]。

目前，國內(nèi)對黃芪及當(dāng)歸配伍應(yīng)用及其分子成分研究相對深入，但對其治療AA的潛在作用靶點研究尚不足。故本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，系統(tǒng)闡述當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療AA的有效潛在靶點及其治療途徑，探討其可能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究資料 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)、Uniprot數(shù)據(jù)庫、Genecards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、Drugbank數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、String數(shù)據(jù)庫、Cytoscape 3.8.0軟件。

1.2 研究方法

1.2.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分、靶點篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：通過TCMSP檢索篩選當(dāng)歸補(bǔ)血湯的全部化學(xué)成分[5]?？诜枚?Oral bioavailability,OB)和藥物相似性(Drug likeness,DL)是評價化合物活性的重要指標(biāo)，設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18篩選當(dāng)歸補(bǔ)血湯的潛在活性成分[6]。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點蛋白的潛在靶點進(jìn)行名稱標(biāo)準(zhǔn)化，并剔除重復(fù)項。

1.2.2 AA相關(guān)靶點預(yù)測：以“aplastic anemia”為關(guān)鍵詞，在Genecards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、Drugbank數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫等檢索AA疾病靶點，將得到的疾病靶點匯總并剔除重復(fù)項，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將檢索到的全部靶點名稱標(biāo)準(zhǔn)化[7-10]。

1.2.3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯與AA共同靶點預(yù)測：將當(dāng)歸補(bǔ)血湯的活性成分靶點與AA的關(guān)鍵靶點取交集得出共同靶點，利用Version 2.1.0軟件繪制韋恩圖。

1.2.4 藥物-疾病共同靶點蛋白互作(Protein protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：通過String數(shù)據(jù)庫[11]構(gòu)建當(dāng)歸補(bǔ)血湯與AA共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”,最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence>0.9”，其余均為默認(rèn)設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。再利用Cytoscape 3.8.0軟件[12]對所獲取的靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)可視化。

1.2.5 通路富集分析：本研究使用R語言對當(dāng)歸補(bǔ)血湯與AA共同靶點蛋白進(jìn)行GO及KEGG分析，通過R語言軟件將結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分、靶點篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用TCMSP分析平臺，設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18，篩選出當(dāng)歸補(bǔ)血湯的潛在活性成分。經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選，剔除重復(fù)項，獲得黃芪潛在活性成分18個，當(dāng)歸2個，共計20個，見表1。當(dāng)歸補(bǔ)血湯潛在作用靶點221個，灰色節(jié)點代表黃芪與當(dāng)歸，矩形藍(lán)色越深說明度值(Degree)越大(圖1)。

表1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分信息

圖1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 AA相關(guān)靶點檢索 以“aplastic anemia”為關(guān)鍵詞，在Drugbank數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、Genecards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，刪除重復(fù)項后共得到781個疾病相關(guān)靶點。

2.3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯、AA共同靶點預(yù)測 通過R語言將221個當(dāng)歸補(bǔ)血湯潛在活性靶點與781個AA相關(guān)靶點取交集，共有54個共同靶點，獲得韋恩圖(圖2)。

圖2 當(dāng)歸補(bǔ)血湯與AA共同靶點韋恩圖

2.4 當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療AA的 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將54個共同靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中分析構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖,存在4個游離靶點(圖3)。利用Cytoscape 3.8.0軟件對所獲取的靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)可視化后，存在54個靶蛋白發(fā)生相互作用，代表靶蛋白之間相互作用的邊共662條，其中靶點互作網(wǎng)絡(luò)的Degree值中位數(shù)為26，大于平均Degree值的靶點共27個，選取前13位中藥預(yù)測靶點并可視化(圖4)。按照Degree值大小分別為TP53、IL6、VEGFA、AKT1、TNF、CASP3、CXCL8、MYC、IL10、IL1B、CCL2、IL4、EGF，以上13個關(guān)鍵靶點在互作網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，可作為當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療AA的重要預(yù)測靶點。

圖3 共同靶點相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 關(guān)鍵靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療AA通路的富集分析 將54個靶點蛋白提交至R語言Bioconductor數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析，其中包括生物信息過程(Biological process，BP)相關(guān)條目1872條，主要涉及細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路，細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控，活性氧代謝過程，調(diào)節(jié)活性氧代謝過程；細(xì)胞組成(Cellular component，CC)相關(guān)條目11條，主要作用在核染色質(zhì)、分泌顆粒腔、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、血小板α顆粒等；分子功能(Molecular fuction，MF)相關(guān)條目89條，主要包括活性氧代謝過程，對脂多糖的反應(yīng)，對細(xì)菌分子的反應(yīng)，調(diào)節(jié)活性氧代謝過程及參與T細(xì)胞活化過程等功能。KEGG相關(guān)條目121條，主要涉及T細(xì)胞白血病病毒感染、甲型流感、HIF-1信號通路、JAK-STAT信號通路、乙型肝炎等。BP、MF、KEGG選取排名前20的分析結(jié)果，CC選取其全部相關(guān)條目，將上述結(jié)果用R語言繪制氣泡圖可視化(圖5)。氣泡顏色由紫到紅代表lgP值越小，lgP值越小表示其顯著性越強(qiáng)。氣泡越大，表示其基因數(shù)越大?？v坐標(biāo)代表BP、CC、MF及KEGG通路，橫坐標(biāo)代表基因占此通路中總基因數(shù)的比率。設(shè)定KEGG通路中“藥對-疾病”靶點基因數(shù)≥7，篩選出43條通路。利用Cytoscape 3.8.0軟件對靶點與通路進(jìn)行可視化，紅色三角形代表靶點基因，綠色菱形代表通路，形狀越大，Degree值越大(圖6)。

圖6 KEGG通路可視化

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸補(bǔ)血湯中含有多種活性成分可通過多個基因靶點，多個活性通路，對再生障礙性貧血治療產(chǎn)生作用。當(dāng)歸補(bǔ)血湯中以黃芪活性成分HQ2(MOL000098-槲皮素)、HQ12(MOL000392-芒柄花黃素)、HQ14(MOL000422-山奈酚)及當(dāng)歸活性成分DG1(MOL000358-β-谷甾醇)、DG2(MOL000449-豆甾醇)口服利用率最高。有研究證實，黃芪、當(dāng)歸配伍使用時，當(dāng)歸多糖成分占較大比例[13]。因此認(rèn)為黃芪、當(dāng)歸可有效治療AA，槲皮素、芒柄花黃素、當(dāng)歸多糖、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇起到了重要的藥理作用。

槲皮素是一種自然界分布最廣的植物源性黃酮類化合物，廣泛存在于多種中藥及水果蔬菜中，天然活性較穩(wěn)定，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。徐亞文等[14]研究結(jié)果表明槲皮素可以調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9，抑制Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期TP53蛋白表達(dá)水平，抑制CDK4蛋白表達(dá)。袁長威等[15]研究表明，經(jīng)過芒柄花黃素處理后的細(xì)胞中p-AKT蛋白的表達(dá)水平逐漸降低。山柰酚作為一種多醇羥基黃酮類化合物植物生物活性成分，常以多種不同的糖苷形式存在，具有顯著的抗炎癥反應(yīng)、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及抑制腫瘤的作用[16]，自然界中富含黃酮類化合物的食物有益于人體健康，其中抗氧化作用較顯著，山柰酚的乙酸乙酯提取物有良好的抗氧化活性。當(dāng)歸多糖是從當(dāng)歸中分離、提取的藥用有效成分，具有抗輻射損傷、抗衰老、促進(jìn)造血、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用，還可以通過Pl3K/AKT通路促進(jìn)造血并提高外周血小板水平[17]。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療AA的PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示，黃芪、當(dāng)歸治療AA的重要預(yù)測靶點包括TP53、IL6、VEGFA、AKT1、TNF、CASP3等。有研究表明，約50%的AA在初診或治療過程中已經(jīng)存在或出現(xiàn)新的基因突變，其中包括TP53基因克隆突變[18]。TP53是重要的抗癌基因，在調(diào)控細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、清除自由基、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等過程中均起到重要作用。IL-6，是由內(nèi)皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞、巨噬/單核細(xì)胞等分泌而產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子。其可誘導(dǎo)集體免疫,活化B細(xì)胞形成抗體,調(diào)控細(xì)胞周期,影響血管生成,促細(xì)胞間質(zhì)生長。由活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，可以促進(jìn)原始骨髓細(xì)胞的生長和分化，是由內(nèi)皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞、巨噬/單核細(xì)胞等分泌產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子。其可誘導(dǎo)集體免疫,活化B細(xì)胞形成抗體,調(diào)控細(xì)胞周期,影響血管生成,促細(xì)胞間質(zhì)生長。IL-6是活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，可以促進(jìn)原始骨髓細(xì)胞的生長和分化。AA發(fā)病與造血微環(huán)境紊亂密切相關(guān)，其可以分泌IL-6、IL-11、干細(xì)胞因子等多種造血調(diào)控因子[18]。VEGF是血管內(nèi)皮生長因子，VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子的重要受體，其特異性地作用于內(nèi)皮細(xì)胞并具有多種作用，包括增加血管通透性、誘導(dǎo)血管生成、促進(jìn)細(xì)胞遷移及抑制細(xì)胞凋亡。AKT1屬于AKT基因家族，是PI3K/AKT信號通路中核心因子。程明秀等[19]研究表明，PI3K/AKT信號通路被激活后，可以加強(qiáng)造血作用，促進(jìn)造血干祖細(xì)胞的增殖分化。通過靶點預(yù)測，篩選出當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療AA的主要靶點還包括CXCL8、MYC、IL10、IL1B、CCL2、IL4、EGF等基因，說明當(dāng)歸補(bǔ)血湯可通過多靶點治療AA。

本研究通過GO富集分析及KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過HIF-1、JAK-STAT、TNF信號通路等治療AA。HIF-1是缺氧誘導(dǎo)因子，是細(xì)胞對缺氧應(yīng)答的重要的轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α表達(dá)增加會促進(jìn)白血病的轉(zhuǎn)移[20]。在動物細(xì)胞中，對氧氣的感知和反應(yīng)是一個非常重要的過程，已知HIF-1通路在腫瘤、心血管疾病、中風(fēng)等多種疾病的病理生理中占有重要地位。HIF-1是由兩個基本的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)組成的異二聚體，HIF-1α在缺氧條件下會積累表達(dá)、HIF-1b則是組成型表達(dá)。HIF-1可激活那些編碼參與低氧穩(wěn)態(tài)反應(yīng)蛋白質(zhì)的基因，可以誘導(dǎo)控制細(xì)胞增殖、血管形成的蛋白質(zhì)表達(dá)。缺氧直接或間接的調(diào)節(jié)了參與細(xì)胞分化的幾種基因，包括促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子-B(PEDF-β)。Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(The Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions, JAK-STAT)信號通路是眾多細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同途徑，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等過程，通過負(fù)調(diào)節(jié)因子與其他信號通路相互作用，以及STATs共價修飾等多種途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)。JAK-STAT通路的激活會誘發(fā)各種疾病的發(fā)生、發(fā)展，包括各種炎癥性疾病、淋巴瘤、白血病以及實體腫瘤等疾病。JAK-STAT通路是應(yīng)激的炎癥信號通路，主要將來自細(xì)胞外的化學(xué)信號傳遞給細(xì)胞核，導(dǎo)致與免疫、增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生等相關(guān)基因的DNA轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。JAK-STAT功能紊亂或失調(diào)可導(dǎo)致免疫缺陷綜合征和腫瘤。白細(xì)胞介素、干擾素和血細(xì)胞生成素生長因子可激活JAK-STAT途徑，調(diào)節(jié)髓系細(xì)胞的發(fā)育、分化[21]。張宇明等[22]研究表明，JAK激活突變或細(xì)胞因子信號失調(diào)，是導(dǎo)致惡性血液病的重要分子機(jī)制，JAK2突變常常病理性激活血紅蛋白素、血小板生成素和粒細(xì)胞集落因子。TNF-α是巨噬細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子，可誘發(fā)慢性炎癥，從而介導(dǎo)免疫反應(yīng)[23]。景曉平等[24]研究表明，AA患者的骨髓中負(fù)性造血調(diào)控因子TNF-α產(chǎn)生過多，其對骨髓造血功能有抑制作用。總之，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過調(diào)控HIF-1、JAK-STAT、TNF通路在治療AA中發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯中槲皮素、芒柄花黃素、當(dāng)歸多糖、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇等多種成分可能作用于TP53、IL6、VEGFA、AKT1、TNF、CASP3等靶點，通過調(diào)控HIF-1、JAK-STAT、TNF等通路發(fā)揮治療AA的作用，為當(dāng)歸補(bǔ)血湯的臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)，但由于本研究未設(shè)定黃芪、當(dāng)歸的配伍比例、用藥方式、用藥時間等，針對此方面的問題，還有待進(jìn)一步深入研究。